泛素化蛋白检测方法

1、泛素化蛋白检测方法l 蛋白质泛素化简介蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调整过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调整被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等状况。泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的格外保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点相互连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。目前争辩显示，假如多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进

2、入蛋白酶体而被降解；假如与被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中打算底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING结构域或RI

3、NG样结构域（比如U-box或PHD结构域）的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。l 蛋白质泛素化的检测方法争辩蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感爱好的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？然后需要争辩的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游的信号通路有什么影响？争辩上述内容的试验方法和试验流程：方法一：western blot and strip通

4、过WB检测全部发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。通过阳性条带的对比来初步推断某一特定蛋白的特定位点发生了泛素化。【具体试验流程附后】方法二：western blot and immunoprecipitations 通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分别出来。分别出来的蛋白再进行SDS电泳和western blot分析。【具体试验流程附后】。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。方法三：in vitro ubiquitination assay将要争辩的目的基因转染293细胞，使其大量

5、表达。24h后提取并分别目的蛋白。在体外反应buffer中将我们要争辩的蛋白A（被泛素化的那个蛋白）与UBE1，UbeH13-Uev 1 a heterodimer complex ，HA-ubiquitin以及我们要争辩的蛋白B（引起蛋白A泛素化的蛋白），共同进行孵育。将孵育后的产物进行IP和WB分析。【具体试验流程附后】。这一方法可以明确引起哪个蛋白是引起某蛋白发生泛素化修饰的E3连接酶。方法四：in vitro ubiquitin-binding assay将我们要争辩的蛋白（被泛素化的蛋白）基因转染293细胞，大量表达后提纯。或者直接提取内源性蛋白。在体外与K63- or K48-li

6、nked ubiquitin chain petides孵育，然后通过SDS电泳并用泛素化抗体进行检测。这一方法可以明确要争辩的蛋白哪个赖氨酸残基简洁发生泛素化。方法一：WB strip试验流程提取组织/细胞的总蛋白使用总泛素化抗体检测全部发生了泛素化的蛋白（此时可以观看到发生了泛素化的蛋白主要分布在哪些分子量区间）Stripping the blot用特定蛋白的抗体与膜反应显色用Ub K63抗体与膜反应显色Merge假如总的泛素化蛋白的条带，与特定蛋白的条带，以及K63位点泛素化条带发生了重合，此时可以初步推想，特定蛋白的第63位赖氨酸残基发生了泛素化方法二：Western blot and immunoprecipitations提取组织/细胞总蛋白用琼脂糖珠或磁珠包被的特异蛋白抗体，将与该蛋白结合的全部蛋白分别出来SDS电泳用泛素化抗体进行反应Stripping the blot用特异抗体进行反应方法三：in vitro ubiquitination assay将要争辩的蛋白基因转染293细胞使其大量表达提取蛋白，通过免疫共沉淀方法分别目的蛋白将可能发生相互作用的两种蛋白与UBE1，Ube