分光光度法测定蛋白酶酶活

1、 分光光度法测定蛋白酶酶活1 适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。2 测定原理蛋白酶在肯定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在肯定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1g酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。3 仪器和设备3.1 分析天平：精度为0.0001g。3.2 紫外分光光度计。3.3 恒温水浴锅：精度±0.2

2、。3.4 PH计：精度为0.01PH单位。4 试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。4.1 福林（Folin）试剂市售分析纯福林试剂。4.2 福林使用溶液 一份福林试剂与两份水混合，摇匀。4.3 碳酸钠溶液（42.4g/L） 称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。4.4 三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。4.5 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L 称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。4.6 盐酸溶液

3、c（HCL）1 mol/L及0.1 mol/L 1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。4.7 缓冲溶液4.7.1 磷酸缓冲液（pH7.5，适用于中性蛋白酶） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO412H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。4.7.2 乳酸缓冲液（pH3.0，适用于酸性蛋白酶） 甲液：称取乳酸（8090）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。乙液：称取乳酸钠（70）16g，加水溶解并定容至1000 mL。使用

4、溶液：取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。4.8 10g/L酪素溶液 称取酪素（固定厂家生产，不同厂家产品对试验结果有影响）1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸23滴）潮湿后，加入适量的缓冲溶液（测中性蛋白酶加磷酸缓冲液，测酸性蛋白酶加乳酸缓冲液）约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的H缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。4.9 L酪氨酸标准溶液（100g/mL） 称取预先于105干燥至恒重的L酪氨酸0.1000g，精

5、确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL溶解后再用蒸馏水定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或马上使用。5 分析步骤5.1 标准曲线的绘制5.1.1 L酪氨酸标准溶液：按表1配置。L酪氨酸稀释液应在稀释后马上进行测定。表1管 号酪氨酸标准溶液的浓度（g/mL）取100ug/mL酪氨酸标准溶液的体积 mL取水的体积mL吸光值Abs.000101101922028330374404655055分别取上述溶液各3.

6、00ml，各加碳酸钠溶液（4.3）15.00ml、福林试剂使用溶液（4.2）3.00ml，振荡均匀，置于40±0.2水浴中显色20min，取出冷却至常温，用分光光度计于波长680nm测定其吸光度（A），以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）。依据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（g），即为吸光常数K值;（其K值应在（95100）范围内）。如不符合，需重新配制试剂，进行试验。5.2 样品测定5.2.1 待测酶液的制备液体酶样：精确吸取样品10.0ml于100ml容量瓶中，用适宜溶剂（蒸馏水或者缓冲溶液）定容至刻度。把握稀释样品酶活力

7、在100u/ml1000 u/ml范围内。固体酶样：精确称取样品4.0g，精确至0.0002g。用适量适宜溶剂（蒸馏水或者缓冲溶液）溶解后，定容至100ml。再将定容溶液用定性滤纸过滤后，精确吸取10.0ml，用相应溶剂定容至100ml。把握稀释样品酶活力在100u/ml1000 u/ml范围内。5.2.2 测定a、先将酪素溶液放入40±0.2恒温水浴中，预热5min；b、按下列程序操作：试管A（空白） 试管B（酶试样，需作三个平行试样）加酶液4.00 mL 加酶液4.00 mL 40±0.2保温，2min 40±0.2保温，2min 加三氯乙酸8.00 mL（摇

8、匀） 加酪素4.00mL(已预热)（摇匀） 沸水煮沸，10min（精确计时） 40±0.2保温，30min（精确计时） 加酪素4.00mL(已预热)（摇匀） 加三氯乙酸8.00mL（摇匀） 40±0.2保温，30min，过滤（定性滤纸） 沸水煮沸，10min，过滤（定性滤纸） 取3.00ml滤液 取3.00ml滤液 加碳酸钠溶液15.0ml 加碳酸钠溶液15.0ml 加福林试剂使用溶液3.00ml 加福林试剂使用溶液3.00ml 40±0.2，显色20min 40±0.2，显色20min 冷却至常温 冷却于680nm波长，测定样品酪氨酸浓度6 结果计算6

9、.1 液体样品酶活力的计算从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/ml。样品的酶活力按式（1）计算： （1）式中：X样品的酶活力，(u/mL)； C由标准曲线得出的检测试液的酶活力，(u/mL)；21检测试液的体积，ml；16反应试液的总体积，mL；n所测样品的稀释倍数；3反应时间为10min的倍数；3吸取滤液的体积，ml；4加入酶液的体积，mL；所得结果表示至整数。6.2 固体样品酶活力的计算固体样品的酶活力换算按式（2）计算： （2）式中：固体样品的酶活力，(u/g)；固体样品溶解定容后的酶活力，(u/mL)；样品定容体积，ml；称取样品的质量，g；所得结果表示至整数。7 检验留意事项7.1 缓冲溶液配制留意事项 缓冲溶液配制完成后，用PH计测定其PH值，若PH值不在规定范围内，需用相应的试剂调PH值至规定