(初稿)氢键型大孔吸附树脂的初步制备及其对虫草素的纯化

1、五邑大学本科毕业论文摘 要本文通过用几种对虫草素纯化效果较好的商品化树脂进行纯化，确定以吸附（解吸）效果最好的LSD-001树脂，对虫草素进行吸附(解吸)，分别考查酸度,温度，时间等因素对吸附解吸过程的影响，进一步确定最佳静态吸附(解吸)工艺条件，在此基础上,进行动态吸附(解吸)实验,重点考察解吸液组分对解吸的影响，从而确定最佳动态纯化工艺,将洗脱液进行浸膏实验，得到虫草素的纯度为14.45%。另外，尝试合成带有胺基跟羟基的改性树脂，探究它的吸附性能与最佳吸附工艺，最后与商品化树脂LSD-001树脂联用，在最佳吸附解吸条件下，得到虫草素纯度为23.24%。关键词 纯化；虫草素纯度；改性树脂；吸

2、附（解吸）工艺条件AbstractThis article through to in several Chinese caterpillar fungus grain purification effect good commercialization resin to purify, confirmed the adsorption (desorption) effect the best LSD-001 resin, the meal for caterpillar fungus adsorption (desorption), respectively, examines the ac

3、idity, temperature, and time of adsorption and desorption factors such as the effect on the process, determine the best static adsorption (desorption) process condition, and based on this, the dynamic adsorption (desorption) experiments, focuses on liquid components on the desorption desorption effe

4、cts to determine the best dynamic purification process, will eluent extract on experiment, obtains the purity of Chinese caterpillar fungus element for 14.45%. In addition, try to synthesis of hydroxyl groups with with amino modified resin, explore its adsorption performance and best adsorption proc

5、ess, finally and commercialization resin LSD-001 / resin, in the best adsorption and desorption conditions, get caterpillar fungus element the purity was 23.24%. Keywords purification; Caterpillar fungus grain purity; Modified resin; Adsorption (desorption) process conditions 34目录摘要IAbstractII第一章 绪论

6、11.1 蛹虫草11.1.1 蛹虫草及其固体培养基简介11.1.2 虫草的活性成分研究11.1.3 虫草素21.2 树脂法21.2.1树脂法简介21.2.2 吸附树脂在中草药有效成分提取分离中的应用31.2.3 吸附树脂对生物碱的提取分离31.2.4 国内外利用树脂法对虫草素的纯化研究31.3 选题依据，研究意义和研究内容41.3.1 选题依据41.3.2 选题意义51.3.2.1 实践意义51.3.2.2 理论价值51.3.3 研究的内容6第二章 实验部分72.1 主要实验原料72.2 主要仪器、设备及辅助材料82.2.1 主要设备82.2.2 主要仪器92.2.3 辅助材料92.3 实验操

7、作流程和实验内容102.3.1 实验操作流程102.3.2 实验内容102.3.2.1 虫草素提取102.3.2.2 标准曲线绘制102.3.2.3 商品化树脂正交筛选112.3.2.4 LSD-001树脂对虫草素的吸附解吸112.3.2.5 胺化原理及树脂的制备112.3.2.5.1 胺化原理112.3.2.5.2 胺化树脂的制备112.3.2.6 胺化树脂含水率测定122.3.2.7 胺化树脂碱基交换容量测定122.3.2.8 胺化树脂红外表征132.3.2.9 胺化树脂SEM表征132.3.2.10 胺化树脂对虫草素的纯化132.3.2.11 乙醇胺胺化树脂对杂质吸附情况132.3.2.

8、12 乙醇胺胺化树脂与LSD-001树脂联用纯化工艺132.3.2.12.1 乙醇胺胺化树脂对杂质的吸附132.3.2.12.2 乙醇胺胺化树脂与LSD-001树脂联用提纯虫草素14第三章 实验结果分析与讨论153.1 虫草素标准曲线153.2 商品化树脂纯化工艺153.2.1 商品化树脂正交筛选153.2.2 LSD-001树脂对虫草素的静态吸附等温线173.2.3.1 解吸液pH对LSD-001树脂对虫草素的静态解吸影响183.2.3.2 解吸液氨的浓度对LSD-001树脂对虫草素的静态解吸影响193.2.3.3 解吸时间对LSD-001树脂对虫草素的静态解吸影响203.2.3.4 解吸温

9、度对LSD-001树脂对虫草素的静态解吸影响203.2.3.5 乙醇含量对LSD-001树脂对虫草素的静态解吸影响213.2.4 LSD-001树脂对虫草素的动态吸附解吸实验223.2.4.1 LSD-001树脂对虫草素的动态吸附实验223.2.4.2 LSD-001树脂对虫草素的动态解吸实验223.3 树脂胺化243.3.1 胺化树脂碱基交换容量和含水率243.3.2 胺化树脂红外表征253.3.3 胺化树脂SEM表征273.4 胺化树脂对虫草素的吸附273.5 乙醇胺胺化树脂对杂质的吸附293.6 乙醇胺胺化树脂与LSD-001树脂联用提纯虫草素29第四章 结论与展望314.1 结论314

10、.2 展望31参考文献32致谢34第一章 绪论1.1 蛹虫草1.1.1 蛹虫草及其固体培养基简介蛹虫草是一种名贵的中药和高级滋补品，性味甘平，益肺肾，补精髓，止血化痰，用于肺结核、老人虚弱、贫血虚弱等，具有重要的药用价值。因近年来国内外市场对蛹虫草需求的增加，导致对野生蛹虫草开采过度，目前野生资源已十分匮乏。为了满足社会需求，近年来，对人工蛹虫草的培养研究及其提取产物的研究与开发日益重视，并已取得了很大的进展。近年来，我国对蛹虫草的人工栽培、开发应用等都进行了广泛的研究，并获得了一定成果，1986年沈阳市农科院棋盘山发现野生的北蛹虫草，并对采集的子实体进行分离、驯化，经过多年的研究，北蛹虫草的

11、人工栽培获得成功。从1992年开始，李春燕等人在辽宁推广了北蛹虫草人工栽培技术。二十多年来，从野生北蛹虫草的发现到人工栽培的成功，从推广普及到深加工产品走向市场，从国家医药卫生重大攻关项目(1035工程)到国家高技术研究发展计划(863计划)，事实证明蛹虫草产业化人工栽培已经形成规模，同时它具有广阔的开发前景1。从1992年开始推广蛹虫草大规模人工栽培技术的十几年间，从事蛹虫草人工栽培研究工作的科研单位及生产基地，都在不断探索和研究在大规模生产栽培中提高产量和活性成分含量的有效途径。蛹虫草多采用无性繁殖，培养基起着很重要的作用。在完全人工控制的条件下，不同的培养基，不同的生长环境，对虫草子实体

12、品质(活性成分含量、活性功能等)的优良与否起着重要作用。可以说不同的培养基质直接决定了虫草子实体活性成分和培养基菌丝混合物中的活性成分的含量。当前无论在研究还是在实际的生产中，培养基的种类、配方成分都很多样化。目前，全国主要人工培养蛹虫草基地有广东的江门、湖南、上海、山东、河北，人工栽培北虫草的发源地沈阳、大连、盖州等地，而且全国各人工培养蛹虫草基地都致力于培养基的种类、配方成分、制作技术、生产性能等方面的改进，为优化虫草培养配方、保证虫草品质，以适应蛹虫草的规模化生产1-2。1.1.2 虫草的活性成分研究虫草尤其是冬虫夏草、大团囊虫草、蛹虫草、亚香棒虫草等种类，由于具有重要的药用价值，因而被

13、广泛应用于医药界。人们己从虫草及其无性型中分离到多种生物活性物质，依据化学结构大致可分为核苷类、多糖类、生物碱类、环状肤类、酶类和多胺类等，其中核苷类物质主要有腺苷和虫草素，而虫草素又是近年国内外研究的热点2。各种实验表明：这些生物活性成分分别具有抗菌、抗肿瘤、杀虫、免疫调节、免疫抑制、降低血糖和抗辐射等作用，在生物医药方面有重要用途3-4。1.1.3 虫草素虫草素，即3-脱氧腺苷，又名蛹虫草菌素。最早因cumngham等人报道蛹虫草寄生的昆虫组织不易腐烂而于1951年被发现。分子式C10H13N3O3，化学结构式为：溶于水、热乙醇、甲醇，不溶于苯、丁醚和氯仿。为含氮配糖体的核酸衍生物，属嘌呤

14、类生物碱，紫外光最大吸收波长为259nm。早在20世纪七十年代就己被发现有抑制肿瘤、抗疟原虫和抑制mRNA翻译的作用5，九十年代研究发现，添加腺苷脱氨酶抑制剂对其抗肿瘤活性的表达起着重要作用，虫草素的研究从而获得突破性进展。美国1997年已将虫草素用于一期临床实验，治疗急性前B和前T淋巴细胞白血病患者；同时，虫草素还表现出极强的抗真菌、抗HIV-I型病毒和选择性抑制梭菌属细菌活性3。1.2 树脂法1.2.1树脂法简介树脂吸附法建立于加世纪70年代6-7，其基本原理是按照物理吸附和化学吸附的“相似相容原理”和“亲和性原理”，设计合成一类与分离目标物具有高度亲和性基团、同时又拥有极高比表面积和发达

15、的分子扩散通道的大孔吸附树脂，当含有分离目标物的水溶液流过装填这种树脂的吸附柱的时候，树脂就可以几乎定量地吸附目标物，从而达到简便高效的分离目的。张全兴和王槐三等8-15曾采用Friedel一crafts后交联反应合成一类对水中芳烃衍生物具有良好吸附能力的大孔吸附树脂，并成功实现有毒有机工废水的吸附处理和污染物资源化，该项目成果获得2001年国家科技进步二等奖16。树脂法在中草药有效成分提取分离中是一项非常重要的技术。树脂法包括离子交换树脂和吸附树脂法。离子交换树脂是一类带有功能基的网状结构的高分子化合物，其结构由三部分组成，不溶性的三维空间网状骨架，连接在骨架上的功能基团和功能基团所带的相反

16、电荷的可交换离子。根据树脂所带的可交换的离子性质，离子交换树脂可大体上分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。阳离子交换树脂是一类骨架上结合有磺酸(-S03H)和羧酸(-COOH)等酸性功能基的聚合物。阴离子树脂是一类在骨架上结合有季铵基、伯胺基、仲胺基、叔胺基的聚合物。在中草药化学上它不仅可以用于分离提取那些可以离子化或能够转化为离子的化学成分，还能用于寻找中药有效部位；大孔吸附树脂是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂的有机高分子聚合物，应用大孔树脂进行分离的技术是20世纪60年代末发展起来的继离子交换树脂后的分离新技术之一。大孔树脂的孔径与比表面积都比较大，在树脂内部具有三维空间立体孔结构，由于具

17、有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点，近年来广泛用于天然产物的提取分离工作中，得到了普遍认可和重视。1.2.2 吸附树脂在中草药有效成分提取分离中的应用大孔吸附树脂是近十年来发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂，它具有物理化学稳定性高、吸附选择性独特，不受无机物存在的影响、再生简便、解吸条件温和、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点，广泛用于分离的多个领域，如有机废水的处理、食品脱色与精制、生化物质的分离纯化、色谱分离与富集等。在中药成分的提取方面，树脂吸附法也得到了广泛的研究

18、与应用。近年来，吸附树脂法在中草药有效成分的提取分离中得到了很好的应用。中草药中成分按照极性可划分为极性化合物(如生物碱的盐、甙类、氨基酸等)、中极性化合物(如某些生物碱、有机酸、黄酮等)以及非极性化合物(油脂、三萜等)。针对各成分不同极性和不同的分子尺寸，筛选、设计、合成对应的吸附树脂，一方面，吸附树脂与吸附质之间的范德华力、氢键作用，另一方面，吸附树脂内部网状空穴的不同孔径，使树脂对通过孔的化合物根据其分子尺寸的不同而具有一定的选择性：通过以上这些吸附性和筛选原理，中草药中的有效成分化合物根据吸附力不同和分子尺寸大小，在大孔树脂上经一定溶剂洗脱而达到分离的目的17。1.2.3 吸附树脂对生

19、物碱的提取分离生物碱是一类含有氮杂环的天然有机化合物，大多具有碱性和显著的生理活性，广泛分布于植物体内，是许多中草药及药用植物的有效成分，其药物作用主要表现为抗肿瘤作用和抗菌作用，同时生物碱还可以作用于神经系统和心血管系统18。使用吸附树脂吸附生物碱时，可用有机溶剂解吸，避免了引入外来杂质，并且解吸容易，洗脱峰集中，经过浓缩、干燥得到产品。有机溶剂可以完全蒸出，在产品中没有残留。如刘俊红19等研究了不同孔结构的大孔吸附树脂D10l、WLD-III、DA-201在延胡索生物碱提取中的应用，实验结果表明，对于大孔吸附树脂， 由于吸附作用是基于树脂内表面的物理吸附，因此树脂的比表面积显著影响其吸附容

20、量，DA-201树脂的吸附容量是D-101和WLD-III树脂的5倍。1.2.4 国内外利用树脂法对虫草素的纯化研究Cunningham首先报道了从虫草菌的培养液中分离虫草素，以培养滤液经Dowex-I-Cl-I离子交换树脂柱和活性炭柱层析，得到虫草素单体。刘静明同样利用Dowex-I-Cl-1树脂柱从蛹虫草菌丝的水提物中分离出虫草素。Suhadolnic等则采用Dowex-I-OH-1树脂从蛹虫草的培养滤液中分离得到虫草素。潘中华等将北虫草子实体经过粉碎、脱脂、过滤、烘干、水浴、沉淀、过滤、离心沉淀、除色素、浓缩、过树脂柱等步骤的处理，最后析出结晶到虫草素晶体。其离子交换树脂柱采用的是732

21、：阳离子交换树脂。树脂经2 mol/L的NaOH震荡2 h而后用蒸馏水冲洗至中性，再用2 mol/L的HCI震荡2 h，蒸馏水冲洗至中性，重复一次预处理树脂过程；装好柱后用pH值35的HCl 3倍柱体积过柱，至pH值不变时停止，尔后加样；样品完全进柱后，用pH值35的HCl平衡液固定被树脂吸附的虫草素，用双蒸水过柱除杂，在洗脱时用015 molL的NH4OH以1滴s加到层析柱内，10 ml试管收集洗脱液，6 ml/支，连续收集60支；收集液用红紫酸胺反应定性定量鉴定虫草素含量后放入冰箱中，在温度低于4时结晶析出虫草素晶体。钟艳梅等利用蛹虫草固体培养残基经过粉碎过筛、脱脂、索氏抽提或水浴浸提、除

22、杂、浓缩、离子交换柱分离，最后收集获得虫草素晶体。陈星以蛹虫草固体干燥培养基为原料，通过粉碎、热浸、低度醇液提取、过滤，调pH值至8-9，流经717、732离子交换树脂时虫草素不交换，这样无关的有机或无机阴阳离子都被吸附。再调节pH值至11，流经717离子交换树脂时，由于虫草素带负电荷而被吸附在柱上面，后采用常规方法，用纯水或蒸馏水洗脱，加热，浓缩(或真空干燥)，在4下静置后出现絮状沉淀，经滤纸过滤得白色块状虫草素晶体，向5095(最佳温度为6090)热水中逐步加入虫草素粗品，使之饱和为止；过滤除杂，将饱和液冷却至结晶，如此反复数次即可得到纯度很高的晶体201.3 选题依据，研究意义和研究内容

23、1.3.1 选题依据大孔吸附树脂是近年来国内外新发展的分离技术，在医药领域，特别是天然药物精制中广为应用，适合工业化生产。目前，利用大孔吸附树脂法从大米培养基残基中提取纯化虫草素的工艺报道比较少，因此本实验的目的在于试图通过对比前人的方法，总结综合出一种在提取、纯化和产率等方面都具有明显优势的工艺，并为工业化提取与纯化蛹虫草大米培养基残基中的虫草素提供参考价值。从而提高大米培养基残基资源利用率，增加市场价值，实现低碳经济的真正意义。目前，日本和韩国等国家一直有研究单位专业从事高纯度虫草菌素的分离纯化研究工作，并已有产品出口欧美市场。虽然我国近年来也曾有大量同类的研究，但仅停留在虫草菌丝体的人工

24、培养及制剂的研究上，水平有限，技术含量不高，无法同国外同类产品竞争，所以探索新的提取纯化工艺迫在眉睫，具有极其深远的意义；另外各种虫草中的虫草菌素，即虫草素的含量很少，需要研究探索取得虫草素的新途径，如果人工合成虫草素能够成功，将会取得可观的社会效益和经济效益。氢键吸附的关键是能在吸附剂与吸附质之间形成氢键，吸附剂可以分为氢键给体型、受体型和混合型三类。氢键型吸附树脂的合成方法是此类吸附剂研究的热点，通常情况下是在树脂表面引入能形成氧键的基团，如酚羟基、羧基、胺基、羰基和酰胺基等等。氢键型吸附树脂可以是大孔型超高交联的吸附树脂，合成路线可以是直接制备带有极性基团的树脂，也可以在非极性树脂表面引

25、入极性基团从而使得吸附剂与吸附质之间形成氢键。由于氢键型吸附树脂的制备具有多种路线和方法，新的种类不断出现，对于氢键吸附的研究及应用也在逐渐深入之中。氢键型大孔吸附树脂是近年来被提出的新概念，由于其能够实现吸附的选择性，具有较高的理论研究价值和实际应用意义。强极性的氢键型吸附树脂理论上可以与含有氢键受体(或给体)的极性吸附质形成氢键。基于此，本研究通过胺化剂合成了羟基，胺基修饰的含有氢键给体的大孔吸附树脂。利用氢键型吸附树脂能与虫草素、腺苷能形成氢键，提纯分离混合物中虫草素的目的。1.3.2 选题意义1.3.2.1 实践意义由虫草素制成的治疗白血病的新药已进入临床实验阶段。但虫草素的价格昂贵，

26、很难满足临床的广泛使用随着以蛹虫草为主要原料的医疗保健品、食品不断推出，蛹虫草的市场需求量不断扩大，蛹虫草逐渐步入规模化生产，势必有大量的栽培废料出现。从栽培废料中提取虫草素，极大地降低了虫草素的生产成本，具有巨大、潜在的商业价值。大孔吸附树脂是近年来国内外新发展的分离技术,并在医药领域,特别是天然药物精制中广为应用21,适合工业化生产。目前利用大孔树脂分离纯化虫草素研究也有少量文献报道,如Ni H等用聚酰氨树脂和大孔树脂纯化分离了蛹虫草固体培养基中的虫草素,并通过重结晶等方法处理,获得了纯度达到98%的虫草素。吕子明等用大孔吸附树脂和硅胶色谱柱,成功分离鉴定出9种化学成分,包括虫草素,刘红锦

27、等采用AB-8分离蛹虫草提纯虫草素也取得不错的效果22。可见大孔树脂对虫草素的分离纯化有很好的效果。但上述方法利用树脂类型较少,工艺条件不完善。本实验根据虫草素与腺苷的结构，有针对性地合成带胺基跟羟基的氢键型大孔吸附树脂,对虫草素进行吸附分离，并且研究该树脂的吸附分离工艺。,该研究为蛹虫草中虫草素的提取分离提供实验方法,从而为虫草素产品规模化生产提供参考。1.3.2.2 理论价值吸附树脂对吸附质的吸附按其作用力分，可分为物理吸附和化学吸附。物理吸附的两个重要机制分别是疏水作用和氢键作用。仅靠疏水作用吸附时的选择性较差，而氢键作用则具有很强的选择性，因此在吸附分离中有很大的优越性。氢键是一种专一

28、性较强的分子键或分子内作用力，由于氢键较低的键能，保证了氢键作用的可逆性，使其容易脱吸。而氢键作用的方向性又赋予其具有选择性。氢键作用在吸附分离中具有优良的效果，正受到各国研究人员的重视。本实验利用氯化的聚苯乙烯吸附树脂胺化、羟基化，制得氨基、羟基修饰的吸附树脂。试图利用此类吸附树脂与虫草素形成氢键机制，选择吸附分离虫草素。1.3.3 研究的内容本实验拟设计合成新的氢键型大孔吸附树脂并用于分离纯化蛹虫草中的虫草素。（1） 用几种对虫草素纯化效果较好的商品化树脂进行纯化，筛选效果最好的，进行吸附解吸，考察各种因素（如pH,温度，时间等）对吸附解吸过程的影响，确定最佳工艺条件。（2） 利用胺化剂氯

29、甲基化聚苯乙烯-二乙烯苯树脂（氯球）进行胺化反应，在苯乙烯骨架上引入羟基与胺基，合成出氢键型大孔吸附树脂，从而改善树脂的化学吸附性能。（3） 利用优化合成的树脂对蛹虫草培养基提取液中的虫草素进行提取分离，研究树脂的吸附性能，探讨吸附的一些影响因素，改进虫草素的提取纯化工艺，最后根据优化工艺的提取分离结果，探讨该工艺工业化的可能性。第2章 实验部分2.1 主要实验原料本实验所采用的主要原料见表2-1：表2-1 本实验所采用的主要原料名称规格含量用量生产厂家四氢呋喃AR95%1L汕头市西陇化工厂甲胺CP25%-30%500mL上海三爱思试剂有限公司二乙胺AR99%500mL天津市福晨化学试剂厂三乙

30、胺AR99%500mL天津市大茂化学试剂厂乙醇胺AR99%500mL汕头市西陇化工厂二乙醇胺AR99%500mL汕头市西陇化工厂三乙醇胺AR99%500mL汕头市西陇化工厂二乙烯三胺CP95%500mL广州化学试剂厂三乙烯四胺AR95%500mL天津市大茂化学试剂厂四乙烯五胺CP95%500mL汕头市西陇化工厂硫酸钠AR500g汕头市西陇化工厂氢氧化钠AR500g汕头市西陇化工厂浓盐酸AR36%-38%500mL汕头市西陇化工厂苯乙烯AR99%500mL天津市大茂化学试剂厂溴乙烷AR99%500mL天津市大茂化学试剂厂二乙烯苯CP45%250ml天津市光复科技发展有限公司过氧化苯甲酰AR500

31、g天津市大茂化学试剂厂氯化铝AR500g天津市大茂化学试剂厂氯化锌AR500g汕头市西陇化工厂明胶食用级500g天津亚太食品有限公司液蜡AR500mL汕头市西陇化工厂1，2-二氯乙烷AR95%500ml天津市光复科技发展有限公司石油醚AR500mL汕头市西陇化工厂氨水AR25%-28%500mL汕头市西陇化工厂酚酞AR20g汕头市西陇化工厂甲基红AR20g汕头市西陇化工厂次甲基蓝AR20g汕头市西陇化工厂2.2 主要仪器、设备及辅助材料2.2.1 主要设备本实验所用到的主要设备见表2-2：表2-2 主要设备列表名称型号数量单位生产厂家精密增力电动搅拌机JJ-1A 1 台 常州澳华仪器有限公司数

32、显恒温水浴锅HH-2 1 台江苏省金坛市顺华仪器有限公司电子天平JA2003 1 台上海良平仪器仪表有限公司电子天平EL204 1 台梅特勒-托利多仪器有限公司高速台式离心机H-1650 1 台长沙湘仪离心机仪器有限公司真空干燥箱BZF-50 1 台上海博迅实业有限公司高速粉碎机QE-200 1 台浙江屹立工贸有限责任公司水浴恒温振荡器SHA-B 1 台金坛市康华电子仪器制造厂微波炉G8OF20CN2L-DG(SO) 1 台佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司高效液相色谱FINNIGAN SURVEROR HPLC 1 台Thermo Electron Corporation酸度计pHS3C

33、1 台上海精科仪器有限公司数显示恒温干燥箱101-3A 1 台天津中亚材料试验机厂旋转蒸发器RE-201C 1 台巩义市予华仪器有限责任公司红外快速干燥箱WS70-1 1 台巩义市英峪予华仪器厂扫描电镜NNSEM-430 1 台捷克FEI公司红外光谱仪VERTEX-701 台德国布鲁克光谱仪器公司2.2.2 主要仪器本实验所使用到的主要的仪器见表2-3:表2-3 主要仪器列表名称规格数量圆底四口烧瓶500ml、250mL各1个球形冷凝管L=300mm1根烧杯 2000ml、1000ml、250ml、100ml、25ml 若干量筒1000ml、100ml、50ml、25ml、5mL各1个水银温度

34、计01001根锥形瓶250mL10个容量瓶500ml、200ml、100ml、50ml、25ml若干移液管50ml、25ml、10ml、5ml、2ml、1ml各1根抽滤瓶1000mL1个布氏漏斗=70mm1个比重计050%、50%100%各1根表面皿=10cm5个玻璃棒L=200mm1根层析柱=1.1cm、=1.1cm各1根酸式滴定管25mL1根碱式滴定管50mL1根2.2.3 辅助材料本实验使用到的辅助材料见表2-4：表2-4 辅助材料列表名称规格数量pH试纸0.55.0、5.59.0、114各一盒标准检验筛60目、100目各一个定性滤纸=7cm10盒LSD-001树脂=0.3-1.25cm

35、若干LSD-732树脂=0.3-1.25cm若干D-101树脂=0.3-1.25cm若干LSA-21树脂氯球=0.3-1.25cm=0.3-1.25cm若干若干2.3 实验操作流程和实验内容2.3.1 实验操作流程虫草素提取商品化树脂正交筛选筛选纯化效果最佳的树脂进行吸附解吸实验制备含胺基、羟基的树脂制备的树脂含水量，碱基交换量的测定以及红外，SEM表征用制备的树脂对虫草素提取液进行静态吸附解吸用制备的树脂和筛选的商品化树脂联用，对虫草素进行纯化2.3.2 实验内容2.3.2.1 虫草素提取将已经干燥的虫草培养基粉碎，筛选60-100目的颗粒，以粉末质量：石油醚体积为1：20的比例于50恒温振

36、荡2h脱脂，回收固体并烘干。称取2.0g固体于锥形瓶中，往其中加入50mL40%的乙醇溶液，于240W下微波提取90s，自然冷却后滤去固体，往提取液中加入三倍体积的95%乙醇，搅拌均匀，静置过夜，滤去醇沉下来的多糖，再将得到的滤液于旋转蒸发仪浓缩出去乙醇后，离心，除去不溶物。2.3.2.2 标准曲线绘制称取虫草素标准品2.0mg，加超纯水定容至25ml，该溶液浓度为0.08mg/ml，吸取该溶液7.5ml加超纯水定容至10ml，得溶液浓度为0.06mg/ml，吸取0.08mg/ml溶液5ml加超纯水定容至10ml，得溶液浓度为0.04mg/ml，吸取0.04mg/ml溶液5ml加超纯水定容至1

37、0ml，得溶液浓度为0.02mg/ml，吸取0.02mg/ml溶液5ml加超纯水定容至10ml，得溶液浓度为0.01mg/ml。经检测，绘制标准曲线。2.3.2.3 商品化树脂正交筛选树脂筛选：分别称取2.0g（干重）的树脂，置于250mL 锥形瓶中，加入30ml一定质量浓度的虫草素提取溶液，于30下放入恒温振荡器中振荡，转速120r/min，待吸附2h后过滤，测残余上清液中的虫草素质量浓度。往装有树脂的锥形瓶中加入0.2mol/L的氨性乙醇（80%）溶液50ml振荡解吸1.5h，转速120r/min，测洗脱液中虫草素的质量浓度（其中吸附实验是正交实验，而脱附实验是根据实验的一般性质经验，在特

38、定的一个条件下的实验）。按下列公式计算吸附量(mg/g) 、吸附率(%) 、洗脱率(%)，筛选出吸附量和洗脱率均较高的大孔树脂：2.3.2.4 LSD-001树脂对虫草素的吸附解吸静态解吸单因素实验：先将树脂在最佳吸附条件下吸附，再分别对解吸液的pH、氨的浓度、乙醇的含量、解析温度、解析时间做单因素实验，确定最佳静态解吸条件。动态吸附解吸：将树脂装柱，测其床体积（BV），以14BV/h流速经过树脂，使其穿透（即吸附饱和），再选用不同的解吸液洗脱，以4BV/h的流速洗脱，检测虫草素的浓度，并将浓度较高的组分进行浸膏实验，计算虫草素纯度。2.3.2.5 胺化原理及树脂的制备2.3.2.5.1 胺化

39、原理2.3.2.5.2 胺化树脂的制备将氯球洗净，烘干，用四氢呋喃溶胀5h，加入5倍量的胺化剂，羟基化试剂，用2mol/L NaOH溶液调节pH=1012，30搅拌反应24h。树脂的预处理按照GB5476-85的方法处理。取适量树脂装于吸附柱中，依次用10BV的lmol/L的盐酸溶液、蒸馏水、1mol/L的NaOH溶液、蒸馏水进行洗涤，用盐酸、NaOH溶液洗涤时控制流速为6一7ml/min，用蒸馏水洗涤时控制流速为25一30mL/min，使其完全转为羟型。自分液漏斗加入50BV的2mol/L NaOH溶液，以15一3OmL/min的流速自上而下通过树脂层。用同样速度通入纯水洗涤至中性，即在接出

40、2一3mL流出液中加入酚酞指示剂不变色。2.3.2.6 胺化树脂含水率测定树脂含水量的测定按照GB5757-86的方法测定吸水量达平衡状态的吸附树脂置于一支带有过滤板的离心管内，然后放在电动离心机中以3000rmin的速率离心5min，除去树脂颗粒外的水分。取出离心管内树脂样品，放入到已恒重的称量瓶中称重，将这两个称量瓶敞开放入烘箱中，在105烘干2h。将盖严的称量瓶在干燥器中冷到室温后称量，按下式计算树脂的含水量：X=（m2m3）/（m2m1）×100 式中：m1一空称量瓶的质量；m2一烘干前树脂和称量瓶的质量；m3一烘干后树脂样品与称量瓶的质量。2.3.2.7 胺化树脂碱基交换容

41、量测定树脂碱基交换容量按照GB5760-86的方法测定。全交换量的测定采用减量法称取2.0g树脂样品，用移液管吸取0.lmol/LHCI标准溶100mL置于干燥具塞锥形瓶中摇匀，在40水浴中浸泡2h，取出冷至室温。从锥形瓶中移取浸泡液置于另一锥形瓶中，加入50mL纯水和2滴酚酞，用0.lmol/L NaOH标准溶液滴定至微红色保持15S不褪色为终点。树脂湿基全交换容量按下式计算:E1=(10O×N14×N2×V1)/W1式中:E1一阴树脂湿基全交换容量;N1一HCl标准溶液的摩尔浓度;N2一Na0H标准溶液的摩尔浓度;100为HCl溶液用量;V1一滴定浸泡液消耗的

42、NaoH溶液的体积;W1一树脂样品的重量。干态阴树脂的全交换容量的计算:Q1=E1/(lX)式中:Q1一干态阴树脂的全交换容量;X一树脂样品的含水量。(1) 强碱交换量的测定:用减量法称取109树脂样品置于干燥具塞锥形瓶中，用移液管吸取0.5mol/LNa2SO4;溶液100mL加到置样的锥形瓶中摇匀，将瓶塞盖紧，在常温下浸泡20min。用移液管从锥形瓶中移取25mL浸泡液置于另一锥形瓶中，加入50mL纯水和3滴甲基红一次甲基蓝混合指示剂，用0.lmol/L的HCI标准溶液滴定至微红色保持15S不褪色为终点。树脂强碱交换容量按下式计算:E2=4×N1×V2/W2式中:N1一

43、HCl标准溶液的摩尔浓度;V2一滴定浸泡液消耗的HCI溶液的体积;W2一湿态树脂样品的重量。干态阴树脂强碱基团的交换容量Q2为:Q2=E2/(l一X)式中:X一树脂样品的含水量。(2) 弱碱交换量的计算:树脂中弱碱交换容量Q3可用下式计算:Q3=Q1一Q22.3.2.8 胺化树脂红外表征将样品在105干燥后，压片，用红外光谱检测。2.3.2.9 胺化树脂SEM表征将样品于无水乙醇中超声洗净，再于红外干燥箱烘干，将样品粘于导电胶上，喷金，于扫描电镜下检测。2.3.2.10 胺化树脂对虫草素的纯化称量1.0g（干重）树脂于锥形瓶中，用2mol/L盐酸和2mol/L的NaoH溶液调节提取液的pH值分

44、别为4、7、9，往锥形瓶中加入25mL提取液，于最佳静态吸附（解吸）条件下吸附（解吸），检测虫草素的浓度，筛选树脂。2.3.2.11 乙醇胺胺化树脂对杂质吸附情况分别称量1.0g、1.25、1.50、1.75（干重）乙醇胺胺化树脂于锥形瓶中，用2mol/L盐酸和2mol/L的NaoH溶液调节提取液的pH值=4，往锥形瓶中加入25mL提取液，于最佳静态吸附条件下吸附，检测杂质含量。2.3.2.12 乙醇胺胺化树脂与LSD-001树脂联用纯化工艺2.3.2.12.1 乙醇胺胺化树脂对杂质的吸附分别往25mL虫草素峰面积为7304416的提取液中加入1.00g、1.25g、1.50g、1.75g乙醇

45、胺胺化的干树脂，在最佳静态吸附条件下进行吸附，2.3.2.12.2 乙醇胺胺化树脂与LSD-001树脂联用提纯虫草素将pH=4的提取液在经过乙醇胺胺化树脂除去部分杂质，再让其经过装有LSD-001树脂的层析柱，在最佳动态吸附（解吸）条件进行吸附（解吸），将虫草素含量较高的组分做浸膏实验，计算虫草素的纯度。第3章 实验结果分析与讨论3.1 虫草素标准曲线以检测峰面积与浓度作图如下：图3-1 虫草素标准曲线得虫草素标准曲线的线性回归方程为：Y=84509+6×107X，R=0.99878.用origin软件拟合，得到虫草素的线性回归方程的回归系数为0.99878，表明高效液相色谱所测得虫

46、草素的面积与浓度满足上述方程的线性关系。3.2 商品化树脂纯化工艺3.2.1 商品化树脂正交筛选我们选择吸附液的浓度，PH值、吸附温度和吸附时间四个因素，我们选择此作为正交试验的四因素，各选取三个水平见下表，进一步优化了纯化工艺，结果见下表：表3-1 商品化树脂吸附正交实验表组号浓度/mg/mlpH值温度/时间/h10.007130220.007450430.007770640.009150650.009470260.009730470.011170480.011430690.0117502表3-2 商品化树脂对虫草素的吸附洗脱结果表编号树脂名称残余量/mg加入量/mg吸附量/mg/g洗脱量/

47、mg洗脱率%第一组LSD-0010.12810.210.04090.0389947.63LSD-7320.12740.210.04130.0177421.47D-1010.014370.210.09780.0252512.91LSA-210.12590.210.04200.0304136.17第二组LSD-0010.00000.210.10500.161877.03LSD-7320.17900.210.01550.0239277.24D-1010.15530.210.02730.0428378.33LSA-210.00000.210.10500.0589928.09第三组LSD-0010.01

48、1550.210.09920.102151.46LSD-7320.16190.210.02400.0238549.61D-1010.17730.210.01630.0134241.04LSA-210.14350.210.03320.0647097.35第四组LSD-0010.0023420.270.13380.0929234.72LSD-7320.13450.270.06770.0189614.00D-1010.10810.270.08100.0286517.70LSA-210.11660.270.07670.0415527.08第五组LSD-0010.0054010.270.13230.11

49、4443.22LSD-7320.22250.270.02380.0354474.56D-1010.21090.270.02950.0568596.24LSA-210.20340.270.03330.0595389.33第六组LSD-0010.02250.270.12380.164966.61LSD-7320.21910.270.02550.0274053.80D-1010.21840.270.02580.0457788.77LSA-210.21590.270.02710.0504293.18第七组LSD-0010.28740.330.02130.0120028.15LSD-7320.00860

50、70.330.16070.030069.35D-1010.27350.330.02830.0485685.91LSA-210.27230.330.02880.0322956.00第八组LSD-0010.010750.330.15960.0787324.66LSD-7320.28500.330.02250.0166437.02D-1010.28210.330.02400.0435290.82LSA-210.27870.330.02560.0437985.43第九组LSD-0010.24030.330.04480.0184120.53LSD-7320.25880.330.03560.0330546

51、.43D-1010.26480.330.03260.0587190.05LSA-210.27350.330.02820.0536294.93根据正交试验的直观分析和方差分析，可知整个正交试验中四个因素pH值温度，浓度时间，除pH值影响较为显著外，其他三个因素影响较小。故从实际出发，选择吸附时间为2h，吸附温度为30，在该条件下，调节吸附液的pH值，确定最佳的吸附条件。表3-3 不同pH商品化树脂对虫草素的吸附洗脱结果表名称吸附液PH=2吸附液PH=4吸附液PH=6吸附值/mg/gD-1010.05820.07490.0728LSA-210.05790.08150.0815LSD-0010.25

52、070.25440.2516LSD-7320.02540.04430.0430解吸值/mg/gD-1010.03630.06940.0726LSA-210.04140.07940.0800LSD-0010.21900.24850.2398LSD-7320.000.01770.00由表3-3的结果可以看出，此种条件下的吸附和洗脱效果均较佳，其中效果最好的是LSD-001树脂，在吸附液的Ph=4时，有最高的吸附值与解吸值。只有LSD-732树脂的洗脱和吸附效果较差，其原因可能是其为凝胶型阳离子交换树脂，孔径较小，直径较大的分子经过容易造成网孔的堵塞，导致吸附跟解吸效果不佳；而同属于阳离子交换树脂的

53、LSD-001就有较为合适的孔径，虫草素分子在酸性条件下形成阳离子，与树脂发生阳离子交换；而大孔树脂D-101，LSA-21主要是范德华力在过程中起作用，并无阳离子交换，故二者的吸附效果低于LSD-001，LSA-21的效果略强于D-101，可能是该树脂上引进少量酰胺基，与虫草素分子间形成氢键。综合考虑选用LSD-001阳离子交换树脂，在吸附条件为pH=4，吸附时间为2h，吸附温度为30为最佳吸附条件。3.2.2 LSD-001树脂对虫草素的静态吸附等温线配制不同浓度的吸附液，探究浓度对树脂吸附效果的影响，以及同一浓度下，温度对吸附效果的影响。吸附液的虫草素浓度分别为：0.022、0.045、0.067、0.085、0.102、0.118、0.148mg/mL其他吸附条件条件：pH=4，吸附时间为2h；图3-2 吸附等温线由图3-2可以看出：（1） 同一温度下，浓度较低时，由于虫草素含量远小于树脂的饱和吸附量，树脂的吸附速度较快，随着浓度的升高，吸附速度逐渐变慢。（2） 不同温度下的吸附值变化随着浓度升高而趋于平缓，说明LSD-001树脂对虫草素的吸附达到饱和，饱和吸附量约为3.30mg/g。（3） 不同温度下，温度升高，吸附量增加。原因可能是：吸附过程是个吸热的自发过程，升高温度有利于吸附的进行，使吸附量增加。3.2.