基因工程复习

1、基因工程复习第一章：绪论基因工程的定义基因工程：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接、然后插入到载体分子中（细菌质粒，病毒或噬菌体DNA），转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。基因工程的主要操作内容：1. 目的基因的获取从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。2. 重组体的制备将目的基因的DNA片段插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。3. 重组体的转化将重组体（载体）转入适当的受体细胞中4. 克隆鉴定挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）5. 目的基因的表达使导入寄主细胞的目的基因表

2、达出我们所需要的基因产物。基因工程的基本形式第一代基因工程蛋白质多肽基因的高效表达经典基因工程。第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程。第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程。第四代基因工程基因组或染色体的转化基因组工程。基因工程的安全性1. 对环境的影响重新组合一种在自然界尚未发现的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。2. 新型病毒的出现制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型 微生物有可能在人类或其它生物体内传播。3. 癌症扩散将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。4. 人造生物扩散新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同

3、程度的潜在危险。重组DNA研究的安全准则1. 公众的担忧2. 专家的态度3. 制定安全规则4. 基因工程的安全措施（1） 实验室的物理安全（2） 实验室的生物安全（3） 载体的安全基因工程的应用一 基因工程在农业生产中的应用1. 提高植物的光合作用效率（1） 提高CO2固氮率（2） 提高光能吸收率和转化率2. 提高豆科植物的固氮效率3. 转基因植物4. 转基因动物二 基因工程在工业中的应用1. 纤维素的开发利用2. 酿酒工业三 基因工程在医药上的应用1. 用转基因植物或动物生产药物2. 用微生物生产药物3. 技术设计高效特异性的生物制剂4. 研究疫苗5. 基因诊断6. 法医鉴定7. 基因治疗四

4、 环境保护中的应用1. 检测水污染2. 生物降解第二章：基因工程的主要技术原理一、质粒DNA的提取1.碱抽提法提取质粒DNA（1）原理DNA双链加强碱变性成DNA单链，再恢复中性又可复性成双链。闭合环状的DNA，在变性后不会分离，复性快；染色体线性DNA和有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。（2）所用试剂的作用溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的b-1，4糖苷键。 在碱性条件（pH8）下有活性。 葡萄糖 增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。 EDTA Mg2+、Ca 2+的螯合剂

5、，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。 NaOH-SDS NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。 NaAc-HAc缓冲液 冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。 乙醇 用于沉淀DNA。 DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。 酚-氯仿(选用) 蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。 但苯酚会残留在DNA溶液中。 （现

6、多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。 2. 影响质粒DNA产量的因素 最重要的是： 菌株的遗传背景， 质粒自身的拷贝数。 （1）受体菌株 一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5a、JM109、XL1-Blue等。 endA基因编码核酸内切酶，在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断。 （2）质粒拷贝数 这是直接决定DNA产量的重要因素之一。 质粒本身的性质所决定（3）质粒大小 分子量大的质粒，拷贝数少。 3琼脂糖凝胶电泳估计原理：溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发 红色荧光。 与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量 4.

7、Southern blotSouthern 杂交的基本原理是将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。5. 酵母双杂交原理第三章:基因工程的酶学基础1.II类限制性内切酶 （第三章第11页）首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。 分离的第一个

8、酶是Hind （1）识别位点序列 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。 与DNA的来源无关。 （2）切割位点 切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如： 3. DNA连接酶一、DNA连接酶（ligase)的发现 从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。 二、DNA ligase的特点 （1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。 （2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。 2. 连接条件 （1）必须是两条双链DNA。 （2）DNA3端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（P

9、）。 （3）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+ 三、连接反应的机理 1. ATP（NAD+)提供激活的AMP。 2. ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。 3. AMP与连接酶的赖氨酸e-氨基相连。 4. AMP随后从连接酶的赖氨酸e-氨基转移到DNA一条链的5端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。 5. 3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。 四、连接反应的温度 1. 最佳温度 连接酶反应的最佳温度是37C。 2. 实用温度 但在37下粘性末端的结合很不稳定。 所以一般采用 416 C五、影响连接反应的因素 1. 插

10、入片段与载体的浓度比例 1020倍。 增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。 2. 反应温度 12.5。 一般1416 DNA聚合酶 一、 基因工程中常用的DNA聚合酶 1.大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T7 DNA聚合酶 4. T4 DNA聚合酶 5. 修饰过的T7 DNA聚合酶 6. 逆转录酶 二、常用的DNA聚合酶的特点1. 共同特点 把dNTPs连续地加到引物的3OH端。 2. 主要区别 持续合成能力和外切酶活性不同。 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。 其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTP

11、s就会从模板上解离下来。 三、DNA聚合酶在基因工程中的用途 1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I 主要用来制备带放射性标记的DNA探针。 （1）大肠杆菌DNA聚合酶I 的性质 一条单链多肽。 53外切酶活性位于N端。 用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的53外切酶活性部分。就成为Klenow fragment。 （2）DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件 底物： Mg2+ 带有3OH游离端的引物 DNA模板 第四章 基因工程载体1. 载体 （Vectors） 在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。 2. 基因工程对载体 的要求 （1）在宿主细胞内能独立复制。 （2）有

12、选择性标记。 （3）有一段多克隆位点。 外源DNA插入其中不影响载体的复制。 （4）分子量小，拷贝数多。 （5）容易从宿主细胞中分离纯化。 3. 载体 的种类 基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 l噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus） 4.双链噬菌体载体l载体1. lDNA分子的特点 （1）长度为48502 bp； （2）双链线性DNA； （3）但在两端有cos位点，可以环化。 cos位点（cohensive-end site）；lDNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。 2. l噬菌体的基因

13、组特点 l DNA上有至少61个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列。 其他约1/3是非必须基因（位于尾部合成至阻遏之间的区段）。 3. lDNA的复制 模型 （1） q型复制 l噬菌体感染细菌的早期：双链进行q型复制。 （2）滚环复制 感染的晚期：启动滚环复制机制。 形成多联体lDAN分子。 这种多联体分子必须在cos位点被切断成单体分子才能被包装起来。 4. l噬菌体载体的构建 （1）构建原理： 删除l噬菌体的非必需区，留出插入空间。 （2）构建过程 在这个非必须区内制造限制酶切点 引进某些突变表型，作为选择标记 突变某些基因，使它成为安全载体 删除lDNA必须区段上常用的限制

14、酶切点 l噬菌体DNA上本身有5个 EcoR I 和7 个Hind III切点！ （3）人工构建的l噬菌体载体有两种类型： 插入型载体（insertion vectors)： 1）免疫功能失活型： 插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（cI基因）内。 2）b-半乳糖苷酶失活型载体： 在l基因组中引入了LacZ序列。（其上含有一个EcoR I 克隆位点）。 替换型载体（substitution vectors) 两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于lDNA的非必须区两端。 用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源DNA片断置换。 （4）l载体的筛选标记 可取代片断中如果包含LacZ

15、，可用Xgal显色作筛选标记。 插入型载体 根据插入所引起的表型突变。 5. l载体的体外包装 l DNA象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。 必须利用噬菌体外壳的作用！ （1）体外包装： 在试管中与l噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组DNA注入受体菌中。 （2）体外包装过程 l噬菌体外壳蛋白的合成 E 基因 l 的E 基因编码头部蛋白的主要成分（占头部总蛋白的70%）。 D基因 l 的D基因的产物也是头部蛋白，但主要与l DNA 进入头部和头部的成熟有关（只占20%）。 （3）体外包装存在的问题： 包装错误： 既能包装用于生产头部蛋白的内源性原lD

16、NA，也能包装重组的lDNA载体。 重组： 外源的重组lDNA载体被诱发与内源性原lDNA发生重组。 体外包装的容量限制： 必须在正常野生型容量的75%105% （3651kb）之间。 （4）lDNA载体的优点 比一般的质粒载体的容量大的多。 用在真核生物基因组文库的建立。第五章 目的基因的获取（第三节）第六章 基因的重组与转移DNA体外连接应注意的事项 1.插入片断与载体的酶切位点互补 相同的粘性末端才能有效地连接、尽量避免平端连接、决不能进行非粘性末端连接。 2. DNA插入的方向正确 （1）用双酶切 由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。 3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确

17、（1）DNA定向插入 （2）起始密码 尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。 4. 防止载体自身环化连接 （1）提高插入片断的用量 连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。 （2）用碱性磷酸酶处理载体 载体切口的5磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。 重组体导入细菌细胞 一、感受态大肠杆菌的制备 1. 目的 增加受体菌细胞膜的通透性。 2. 菌种 使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。 3. 制备原理 用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。 4. 制备过程 二、重组DNA导入大肠杆菌 1. 外源DNA导入细菌的几种方法 （1）转化（trans

18、formation) （2）转染（transfection) （3）转导（transduction) 2. 转化率 每mgDNA转化成功的细菌克隆数。 3. 转化方法 （1）热休克法（heat shock） 简单，但转化效率不高（106-108/mgDNA）。 （2）电转化法 转化效率高（高于109/mgDNA）。 4. 平板培养基培养细菌 5. 影响转化率的因素 （1）重组质粒 环形质粒数 环形重组质粒 质粒自我连接 线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。 （2）感受态细胞 （competent cells) 生长状态 制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。 必须在冰冷的条件下制备。 CaCl2处理 要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。 储存感受态菌要在-70以下 使用感受态菌时必须迅速融化 融化后一般不能再次冻存使用。 6. 体外包装的噬菌体的转导 （1）体外包装（in vitro packaging） 把重组的噬菌体lDNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的l噬菌体颗粒。 （2）转导（transduction） （3）cI857基因突变的l噬菌体 （4） 互补型噬菌体 (5) 体外包装过程 （6） 转导 体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每mg lDNA能形成106噬菌斑