骨髓间充质干细胞对失血性休克大鼠

1、骨髓间充质干细胞对失血性休克大鼠早期炎性反应的影响作者：李彤 王子薇 王淑梅 张学军 李艳秋单位：吉林大学口腔医院通讯作者：王淑梅 单位：吉林大学第二医院麻醉科基金项目：吉林省产业技术研究与开发项目 吉发改高技【2013】779号【摘要】 目的 探讨骨髓间充质干细胞对失血性休克大鼠血清炎性因子及重要脏器的影响。方法 体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、治疗组（n=20）。改良Wiggers法制备大鼠出血性休克模型，休克持续90 min。治疗组在复苏前给予106个第3代骨髓间充质干细胞PBS悬液1ml，假手术组和模型组给予相同体积PBS溶液。分别于复苏后6h、

2、12h、24h、48h、72h取血清，ELISA检测TNF-，IL-1、IL-6、IL-10水平，HE染色观察心、肝、肺、肾病理损伤。结果 治疗组血清TNF-和IL-6在复苏后12h-72h内较模型组显著下降（p0.05）；治疗组血清IL-1在复苏后6h-12h内较模型组下降显著（p0.05）；治疗组IL-10水平在复苏后6h-48h内均较模型组有显著升高（p0.05）。骨髓间充质干细胞减轻肺、肝、肾、心等器官的炎性细胞浸润。结论 骨髓间充质干细胞能调节失血性休克早期重要炎性因子水平，促进机体促炎-抗炎系统平衡。【关键词】 骨髓间充质干细胞；失血性休克；炎症因子；免疫调节The effects

3、 of BMSCs on early inflammatory response in hemorrhagic shock rats Xie Chong, He Jian-bin, Yu Qian, Xing Bai-chun, Yu Dai-hua, Yao Li-nong. Department of Anesthesiology, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University, Xian 710038, China【Abstract】 Objective The purpose of this study was to i

4、nvestigate the effects of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) on serum levels of early inflammatory cytokines and major organ damage after hemorrhagic shock in rat. Methods Male SD rats were randomly divided into sham operation group, model group and treatment group (n = 20). 106 BMSCs of the

5、 third passage were infused in treatment group before resuscitation. The other 2 groups were given PBS. Serum levels of TNF-, IL-1, IL-6, IL-10 were detected by ELISA at 6h, 12h, 24h, 48h, 72h after resuscitation. Heart, liver, lung, kidney were observed by HE staining. Results compared with model g

6、roup, serum levels of TNF- and IL-6 in treatment group significantly reduced between 12h-72h after resuscitation (P0.05); serum levels of IL-1 decreased significantly between 6h-12h. (P0.05), the level of IL-10 in treatment group increased within 6h-48h after resuscitation compared with that of mode

7、l group (P0.05). BMSCs decreased the inflammation induced by hemorrhagic shock in lung, liver, kidney and heart. Conclusions BMSCs can play an important role on inmune regulation at early inflammatory response after resuscitation of hemorrhagic shock and promotes the balance of pro-inflammation and

8、anti-inflammation in rat. Key words：Bone mesenchymal stem cells；Hemorrhagic shock；Inflammatory factors；Immunoregulation失血性休克由于组织有效灌流不足、细胞代谢紊乱以及菌群移位产生大量炎性因子，导致机体抗炎-促炎自稳态失衡，促炎因子大量释放，最终可演变为全身炎性反应综合症（SIRS），成为全身多器官功能不全综合症（MODF）的发病基础，后者是导致机体死亡的最主要原因1。骨髓间充质干细胞具有极低的免疫原性和独特的免疫调节功能2，在多种组织损伤和修复中表现出良好的免疫调节能力，但对

9、失血性休克后免疫失衡的影响尚未研究。本研究利用培养的大鼠骨髓间充质干细胞在大鼠失血性休克模型，调查间充质干细胞对炎性细胞因子的表达的影响，以证实其减轻失血性休克后炎性反应的效果，从而探讨失血性休克临床救治的新思路。材料与方法实验动物 SPF级SD大鼠，质量250300g。购于第四军医大学实验动物中心。本实验经第四军医大学附属唐都医院实验动物管理委员会批准。主要试剂 DMEM-LG培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（美国Gibco公司）；PE anti-rat CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD106（美国Biolegent公司）；戊巴比妥钠（第四军医大学生物技术中心）；大鼠TNF-

10、 ELISA试剂盒、IL-1 ELISA试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒、IL-10 ELISA试剂盒（美国RDD公司）；链霉素、氨苄青霉素（华北制药有限公司）。主要仪器 CO2恒温孵育箱（美国Thermo公司）；液闪计数仪 （美国Beckman公司）；IMT-2型倒置生物学显微镜（日本Olympus公司）；HH-4型恒温水浴箱(金坛富华电器有限公司)；流式细胞仪 （美国BD FACSAriaTM）；高速调温离心机（美国Sigma公司）大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、扩增和鉴定 大鼠颈椎脱臼处死，取双后肢胫骨和股骨。无菌2ml注射器吸取培养基迅速反复冲洗骨髓腔多次，直至冲出大部分骨髓。加入

11、含10%胎牛血清的DMEM-LG培养基，无菌玻璃管反复吹打，直至细胞充分重悬于培养基。调整细胞浓度至1106/cm2,接种细胞于75 cm2的塑料培养瓶中，37,5% CO2孵箱培养、传代。取第3代骨髓间充质干细胞弃去培养基，PBS溶液冲洗后弃去，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞皱缩变圆并部分脱落时加入胎牛血清终止消化，反复吹打贴壁细胞至绝大部分脱落，制成细胞悬液。离心取上清，PBS溶液调整细胞浓度至1107/ml。加入PE 抗鼠 CD29、PE 抗鼠CD34、PE 抗鼠CD45、PE 抗鼠CD90、PE 抗鼠 CD106。避光，4C冰箱内孵育30min。将制备好的样品行流式细胞仪鉴定，Cell

12、quest软件分析数据。大鼠失血性休克模型 3%戊巴比妥钠麻醉大鼠后固定。分离左股动脉插管，按3mg/kg体重输注肝素钠溶液，连接心电监护仪持续监测平均动脉压MAP。分离右股动脉，插管连接无菌注射器。急性快速放血至MAP降至40mmHg，而后间断放血或回输失血维持MAP在30-40mmHg水平90min。90min后回输全部失血进行复苏。实验分组 假手术组（A组）：大鼠麻醉后固定，分离左右股动脉插管，不失血，不输注任何溶液，90min后拔管结扎血管后缝合切口。（2）失血性休克模型组（B组）：大鼠麻醉固定，分离左右股动脉插管，均造失血性休克模型，90min后回输全部失血（5-6min回输1ml失

13、血），之后输注PBS溶液1ml，结扎血管，缝合切口。（3）骨髓间充质干细胞治疗组（C组）：失血 90min后回输全部失血（5-6min回输1ml失血），之后输注含有106个骨髓间充质干细胞的PBS溶液1ml，结扎血管，缝合切口。各组于复苏后6h、12h、24h、48h、72h 4只大鼠取样本待检。血清TNF-、IL-1、IL-6、IL-10的ELISA测定 分别于复苏后各时间点取大鼠下腔静脉血，离心取上清，-80C冷冻保存备检。检测按照ELISA说明书步骤进行。各组大鼠重要脏器的HE染色 各组大鼠处死后，取下心、肝、肺、肾脏，PBS冲洗后4%甲醛固定。24h以上。高浓度酒精脱水，浸蜡包埋。蜡块

14、切片5-8m。二甲苯脱蜡，酒精伊红染色液染色2-3min。纯酒精脱水后二甲苯透明。加拿大树胶封固、观察。统计分析 应用SPSS 13.0 统计软件，数据用均数标准差(xs)表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用配对t检验。结 果大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、传代 将骨髓内细胞离心重悬后接种于75cm2塑料培养瓶后，倒置显微镜下可见大量细胞悬浮于培养基中。12h即见部分细胞贴壁，呈大小不等圆形，并开始繁殖。48h-72h后可见不规则形、三角形，并伴有小突起。8-10天后，细胞大多呈梭形，突起明显，排列呈旋涡状。当传代至第3代时，纺锤形和梭形细胞增多明显，呈典型的成纤维样细胞结构，生长

15、均匀，形态趋向一致。流式细胞仪将第3代骨髓间充质干细胞进行表面标记物检测，骨髓间充质干细胞表明高表达CD29、CD90、CD106、CD44，低表达CD34、CD45，表达率分别98.4%、99.6%、50.2%、17.2%、1.5%、4.7%（图1）各组大鼠血清炎性因子浓度变化 休克复苏后相对于假手术组，模型组的TNF-、IL-1、IL-6浓度显著上升（P0.05），而治疗组TNF-、IL-1、IL-6浓度在各时间点均比模型组明显下降（P0.05）。模型组IL-10的浓度较假手术组显著下降（P0.05）；6h-48h内，治疗组IL-10的浓度均比模型组升高（P0.05）（图2）。脏器染色观察

16、 模型组肺组织正常结构遭到破坏，肺间质水肿，肺泡壁明显增宽，肺泡腔含气量减少，大量炎症细胞浸润。输注骨髓间充质干细胞则炎细胞浸润减少，肺组织结构相对完整。休克后大鼠肝脏结构排列紊乱，肝细胞有空泡样变性，胞质呈疏松样改变，汇管区可见大量炎性细胞浸润，小叶中央静脉扩张充血，给予骨髓间充质干细胞复苏72h后，肝结构排列正常，炎性细胞浸润减少。休克后肾间质有少量瘀血，肾小管上皮细胞空泡变性，肾正常结构造破坏，大量炎性细胞浸润。骨髓间充质干细胞复苏后72h可见病损区新的毛细血管再生，炎细胞浸润减少。模型组心肌细胞浑浊肿胀，间质水肿，横纹不规则，胞核完整或稍大，炎性细胞浸润。输注骨髓间充质干细胞72h后，

17、心肌排列整齐，炎性细胞减少，胞核完整。讨 论骨髓间充质干细胞是骨髓中的一种具有自我更新和多向分化能力的多功能非造血干细胞，具有两个重要的生物学特征3-5：一是在特定条件下向软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、血管内皮细胞等多种组织细胞分化的能力，对损伤组织有显著修复作用；二是独特的免疫调节特性和极低的免疫原性。研究表明，骨髓间充质干细胞可通过多种免疫抑制介质进行多靶位、多途径的免疫调节、控制炎性反应。对组织缺血再灌注损伤具有良好的修复功能和调节炎性反应平衡的能力。出血性休克复苏后免疫功能紊乱是全身炎性反应综合征的发病基础，表现为过度的促炎反应和明显抑制的抗炎反应6。目前的各种治疗和预防措施效果有限。本

18、实验中复苏时给予106个骨髓间充质干细胞，能够显著抑制血清中炎性因子TNF-、IL-1、IL-6的水平并增高血清抗炎因子IL-10的水平，并减轻肺、肝、肾、心等重要器官的炎性细胞浸润，促进新生血管的再生，修复受损组织，调节机体免疫功能的平衡。研究表明，CD4+CD25+ Tregs细胞7是骨髓间充质干细胞发挥免疫调节作用的重要的效应细胞。CD4+CD25+ Tregs细胞是一群具有免疫调节能力、控制免疫病理损伤的T细胞群，主要来源于CD4+CD8-细胞，特征是8-10能表达某种或某些细胞表面分子与靶细胞表面受体相互作用，使靶细胞休止于细胞周期G0/G1期而停止增殖，从而介导免疫抑制作用。CD4

19、+CD25+ Tregs细胞特异性分子标记物Foxp3是自身免疫的关键性调节物质，直接控制各种细胞因子的产生，其基因表达产物Scurfin蛋白是一种转录的阻遏物，可结合至细胞因子基因的启动区，减少细胞因子的产量，而缺乏Scurfin可引起迅速的淋巴细胞增生性疾病，对免疫环境的自我稳定十分重要。骨髓间充质干细胞对CD4+CD25+ Tregs细胞的调节可能是其在出血性休克复苏后发挥免疫调节的主要途径。骨髓间充质干细胞对出血性休克的免疫调节提供了新方法，但仍有许多问题需要解决，如骨髓间充质干细胞在体外如何鉴定、大量扩增、保存？输注的干细胞在体内的归巢、分化情况？是否诱导感染和肿瘤？如何调节Treg

20、s细胞的发育和功能？随着对休克病理机制更加深入的研究、对骨髓间充质干细胞认识的不断增多，骨髓间充质干细胞将有可能用于临床出血性休克的救治。图1 骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定图2 各组大鼠血清炎性因子浓度变化（* 与模型组比较P0.05） 参考文献1 刘良明，胡沛红严重创伤休克的液体复苏新进展J中国危重病急救医学，2003，15(5)：314-316.2 Pittenger MF, Martin BJ: Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. Circ Res 95:920, 2004.3 Da,

21、Silva Meirelles L, Chagastelles PC, Nardi NB: Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci 119:22042213, 2006.4 Rochefort，G Y;Delorme,B,et alMultipotential mesenchymal stem cells are mobilized into peripheral blood by hypoxiaJStem Cells，2006，24：22022208.5

22、Keyser KA, Beagles KE, Kiem HP: Comparison of mesenchymal stem cells from different tissues to suppress T-cell activation. Cell Transplant 16:555562, 2007.6 Sugiyama T, Kohara H, Noda M, Nagasawa T: Maintenance of the hematopoietic stem cell pool by CXCL12-CXCR4 chemokine signaling in bone marrow stromal cell niches. Immunity 25:977988, 20067 Uccelli A, Pi