实验40植物组织中过氧化氢含量及过氧化氢酶活性测定

1、实验40植物组织中过氧化氢含量及过氧化氢酶活性测定植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰 老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2,是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过 氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。一、过氧化氢含量的测定【原理】H2O2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物一钛复合物黄色沉淀，可被H2 SO4溶解后，在415nm波长下比色测定。在一定范围内，其

2、颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系。【仪器和用具】研钵；移液管 0.2ml X 2支，5ml X 1支；容量瓶10ml X 7个，离心管5ml X 8支；离心 机；分光光度计。【试剂】100卩mol/L H2O2丙酮试剂：取 30%分析纯H2O2 57卩l，溶于100ml，再稀释100倍;2mol/L硫酸；5% （W/V ）硫酸钛；丙酮；浓氨水。【方法】1制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表 40-1加入试剂。表40-1测定H2O2浓度标准曲线配置表试剂（ml）离心管号1234567100 卩 mol/L H2O200.10.20.40.60.81.04 'C下预冷丙酮1

3、.00.90.80.60.40.205%硫酸钛0.10.10.10.10.10.10.1浓氨水0.20.20.20.20.20.20.23000r/min离心10min，弃去上清夜，留沉淀2mol硫酸5.05.05.05.05.05.05.0待沉淀完全溶解后，将其小心转入 10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管， 将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。2样品提取和测定：（1）称取新鲜植物组织 25g （视H2O2含量多少而定），按材料与提 取剂1 : 1的比例加入4C下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000 r/min下离心10min，弃去残渣，上清液

4、即为样品提取液。（2）用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤35次，直到去除植物色素。（3）向洗涤后的沉淀中加入 2mol硫酸5ml,待 完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。3结果计算：C Vt植物组织中H2O2含量（卩mol/g Fw）= FW Vl式中 C 标准曲线上查得样品中H2O2浓度（卩mol）;Vt样品提取液总体积（ml）;V1测定时用样品提取液体积（ml）;FW植物组织鲜重（g）。二、过氧化氢酶的活性测定高锰酸钾滴定法【原理】过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有

5、铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧， 在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。2eR（Fe+2）+H；O2=R（Fe+3+OH）2eI IR（Fe+3OH）2+H2O2=R（Fe+2）2+2H2O+O2据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定 量（反应过量）的 H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定 多余的出025H2O2+2KMnO 4+4H2SO4 5O2+2KHSO 4+8H2O+2MnSO 4即可求出消耗的 H2O2的量。【仪器和用具】研钵；三角瓶50ml X 4;酸式滴定管（10ml）;恒温水浴

6、；容量瓶 25ml X 1。【试剂】10% H2SO4; 0.2mol/L 磷酸缓冲液 pH7.8;0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO 4 （AR ） 3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定；0.1mol/L H 2O2：市售 30% H2O2大约等于 17.6mol/L，取 30% H 2O2溶液 5.68ml，稀释至 1000ml，用标准0.1mol/ KMnO 4溶液（在酸性条件下）进行标定；0.1mol/L草酸：称取优级纯 H2C2O4 2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至 1L。【方法】1. 酶液提取取小麦叶片2.5

7、g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至 25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容， 4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。2. 取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液 2.5ml，对照瓶中加入 煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H 2O2，同时计时，于 30C恒温水浴中保温 10min , 立即加入 10% H2SO4 2.5ml。3. 用 0.1mol/L KMn O 4标准溶液滴定 H2O2,至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。4. 结果计算：酶活性用每克鲜重样品

8、1min内分解H2O2的毫克数表示：（A B） Vt 1.7酶活（mgH 202/gFW min）=FW V1 t式中 A 对照KMnO 4滴定毫升数；B 酶反应后KMnO4滴定毫升数；Vt酶液总量（ml）;V1反应所用酶液量（ml）;W 样品鲜重（g）；1.7 1ml 0.1mol/L 的 KMnO4相当于 1.7mg H2O2。【注意】所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。三、过氧化氢酶的活性测定紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢， 使反应溶液吸光度（A 240） 随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活

9、性。【仪器与用具】紫外分光光度计；离心机；研钵； 250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度 吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；【试剂】0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含 1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H 2O2 （用 0.1mol/L 高锰酸钾标定）。【方法】1. 酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入 23ml 4C下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5C冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上

10、清液即为过氧化氢酶粗提液。5C下保存备用。2. 测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表 40-2顺序加 入试剂。表40-2紫外吸收法测定H2O2样品液配置表管号S1S2S3粗酶液（ml）0.00.20.2pH7.8 磷酸(ml)1.51.51.5蒸馏水（ml）1.01.01.025C预热后，逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2,每加完一管立即记时，并迅速倒入石英 比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后, 按下式计算酶活性。3. 结果计算：以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。A240 VT过氧化氢酶活性（u/gFW/min）= °V1 t FW （AsiAs2）式中A 24° = As°2As°加入煮死酶液的对照管吸光值；Asi, As2样品管吸光值;