分子生物学：第八章 基因工程与体外表达

1、1第八章第八章 基因工程与体外表达基因工程与体外表达 Gene Engineering and Gene Expression 2目的要求目的要求 掌握：限制性核酸内切酶的概念与特点；掌握：限制性核酸内切酶的概念与特点；质粒载体的特点；基因克隆的基本过程。质粒载体的特点；基因克隆的基本过程。 了解：其他常用工具酶的特点。了解：其他常用工具酶的特点。 【重点重点】基因克隆的基本过程。基因克隆的基本过程。345 基因工程是指在体外对基因工程是指在体外对DNA分子按分子按照既定的目的和方案，对照既定的目的和方案，对DNA进行剪切和进行剪切和重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而重新连接，然后把它导入宿

2、主细胞，从而能够扩增有关能够扩增有关DNA片段，表达有关基因产片段，表达有关基因产物，进行物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究序列分析，基因治疗，研究基因表达的调节因子（如启动子、增强子基因表达的调节因子（如启动子、增强子等），以及研究基因的功能等。等），以及研究基因的功能等。 6 第一节第一节 基因克隆的工具酶基因克隆的工具酶一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 从双链从双链DNA内部特异位点识别并且裂内部特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。解磷酸二酯键。7 限制性核酸内切酶的特点限制性核酸内切酶的特点类型类型 限制性限制性 修饰作用修饰

3、作用 识别位点识别位点 切割位点切割位点 型型 有有 有有 特异特异 识别位点下游识别位点下游100100到到1000bp1000bp型型 有有 无无 特异特异 可知、固定可知、固定型型 有有 有有 特异特异 识别位点附近切割识别位点附近切割DNADNA， 切割位点很难预测。切割位点很难预测。82 2限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名 EcoREcoR E E代表代表EscherichiaEscherichia属属 coco代表代表coli coli 种种 R R代表代表RY13RY13株株95 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 5 G 3 CTTAA AATTC3 G5 5 53 3

4、限制性内切酶的识别和切割位点限制性内切酶的识别和切割位点 通常是通常是4 46 6个碱基对、具有回文序列个碱基对、具有回文序列（palindrompalindrom）的）的DNADNA片段，大多数酶是错片段，大多数酶是错位切割双链位切割双链DNADNA，产生，产生5 5或或3 3黏性末端黏性末端（sticky endsticky end）。）。 如如EcoREcoR切割后产生切割后产生5 5黏性末端：黏性末端：10PstPst切割后产生切割后产生3 3黏性末端：黏性末端： 有一些酶沿对称轴切断有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端，产生平端或钝端（或钝端（Blunt end）, 如如Sma：5

5、-CTGCAG-3 5 -CTGCA G-3 3 -GACGTC-5 3 -G ACGTC-5 5 -CCCGGG-3 5 -CCC GGG-3 3 -GGGCCC-5 3 -GGG CCC-5 11二、二、 T4 DNA连接酶（连接酶（T4 DNA ligase） 催化双链催化双链DNA一端一端3-OH与另一双链与另一双链DNA的的5端磷端磷酸根形成酸根形成35磷酸二酯键，使具有相同黏性末端或磷酸二酯键，使具有相同黏性末端或平端的平端的DNA两端连接起来。两端连接起来。 12 第二节第二节 基因克隆的载体基因克隆的载体 载体是携带目的基因，使其在宿主细载体是携带目的基因，使其在宿主细胞内复制

6、或表达的胞内复制或表达的DNA分子。分子。13一、常用的克隆载体一、常用的克隆载体 (一一)质粒（质粒（plasmid） 是存在于多数细菌和某些真核生物染是存在于多数细菌和某些真核生物染色体外的双链环状的色体外的双链环状的DNA分子。分子。 14作为克隆载体的质粒应具备下列特点：作为克隆载体的质粒应具备下列特点：（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存）分子量相对较小，能在细菌内稳定存 在，有较高的拷贝数。在，有较高的拷贝数。（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主 细胞进行选择，如抗生素抗性基因，细胞进行选择，如抗生素抗性基因， -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶

7、基因（Lac Z）等。）等。（3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便）具有多个限制性内切酶的单一切点，便 于外源基因的插入。于外源基因的插入。 1516( (二二)噬菌体噬菌体 野生型野生型噬菌体经过改造，已衍生出噬菌体经过改造，已衍生出100多种多种克隆载体。克隆载体。 噬菌体载体分为插入型和替换型噬菌体载体分为插入型和替换型(置换置换型型)两类。两类。 目前应用较广的是目前应用较广的是EMBL系列、系列、gt系列和系列和Charon系列等。系列等。 17 gt10和和gt11载体适用于建立载体适用于建立cDNA文库。这文库。这两个载体都属插入型载体，能克隆两个载体都属插入型载体，能克隆7k

8、b以下的外以下的外源源DNA。 gt11为表达型载体为表达型载体。18( (三三) M13) M13噬菌体噬菌体 (M13 phage) 一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体。一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体。 感染细菌感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型）。复制型M13可用作克隆载体。可用作克隆载体。1920( (四四) )黏性质粒（黏性质粒（cosmidcosmid） 是由是由噬菌体的黏性末端（噬菌体的黏性末端（cos区）与质区）与质粒重新构建的载体，为双链、环状粒重新构建的载体，为双链、环状DNA。其。其克隆容量可达克隆容量可达4050 kb。

9、21( (五五) ) 病毒载体病毒载体 逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、EB病毒等作为基因转移的载体。多数病毒病毒等作为基因转移的载体。多数病毒载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记，毒启动子、包装元件、选择性遗传标记，以及以及pBR322的复制子组成。的复制子组成。22二二、表达载体表达载体 (一一) 原核表达载体原核表达载体 表达载体中含有复制起始位点、抗性基表达载体中含有复制起始位点、抗性基因因 、克隆位点、克隆位点 、启动子、启动子 、核糖体结合位点、核糖体结合位点和转录终止信号。和转录

10、终止信号。23 multiple cloning site24(二二) 真核表达载体真核表达载体 含有原核复制起始位点、抗生素抗性含有原核复制起始位点、抗生素抗性基因基因. 还含有真核表达元件还含有真核表达元件,包括启动子、包括启动子、增强子、克隆位点、增强子、克隆位点、 转录终止信号和转录终止信号和poly (A) 加尾信号加尾信号.25 第三节第三节 基因克隆的基本过程基因克隆的基本过程 基因克隆主要步骤：基因克隆主要步骤：制备目的基因和选择相关载体制备目的基因和选择相关载体目的基因和有关载体进行连接目的基因和有关载体进行连接重组的重组的DNA导入受体细胞导入受体细胞DNA重组体的筛选和鉴

11、定重组体的筛选和鉴定DNA重组体的扩增、表达和其他研究重组体的扩增、表达和其他研究26 （二）从（二）从cDNA文库中获得文库中获得 （三）（三）PCR扩增特定基因扩增特定基因 （四）人工合成（四）人工合成一、一、 目的基因的获得目的基因的获得 （一）从基因组文库中获得（一）从基因组文库中获得27几种常用克隆载体的比较几种常用克隆载体的比较注：注：+ +表示可用；表示可用；- -表示不可用表示不可用比较内容比较内容 质质 粒粒 噬菌体噬菌体 黏性质粒黏性质粒 M13噬菌体噬菌体克隆容量克隆容量 10 kb 22 kb 4050 kb 1 kb基因组基因组DNA文库文库 - + + -cDNA文

12、库文库 + + - -亚克隆亚克隆 + - - +序列分析序列分析 + + - +E.coli表达表达 + + - -二、载体的选择与准备二、载体的选择与准备28三、三、DNADNA分子的体外连接分子的体外连接（一）黏性末端（一）黏性末端（二）人工接头的使用（二）人工接头的使用（三）加入同聚体尾（三）加入同聚体尾（四）平端连接（四）平端连接29（一）黏性末端（一）黏性末端30（二）人工接头（二）人工接头31（三）加入同聚体尾（三）加入同聚体尾待克隆待克隆DNADNA片段片段重组质粒重组质粒混合、退火混合、退火空白质粒空白质粒32（四）平端连接（四）平端连接33四、外源四、外源DNADNA导入宿

13、主细胞导入宿主细胞 （一）转化（一）转化（transformation） （二）感染（二）感染（infection） （三）转染（三）转染（transfection） 34五、目的基因的筛选和鉴定五、目的基因的筛选和鉴定 外源基因导入宿主细胞后，筛选含有外源基因导入宿主细胞后，筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。目的基因的阳性克隆并加以扩增。 所用的方法主要有遗传学方法、免疫所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、学方法、核酸杂交法、PCR等。等。35（一）（一） 遗传学方法遗传学方法 插入灭活法插入灭活法1.362. 蓝蓝-白筛选（白筛选（互补）互补） 许多载体（如许多载体（如

14、M13M13系列、系列、pUCpUC系列、系列、pGEMpGEM系列）都系列）都含有含有-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（laclacZ Z）的调控序列和氨基）的调控序列和氨基端端145145个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码个多克隆位点。这种载体适用于可编码-半乳糖苷半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有活性的段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有活性的-半乳糖苷酶，使人工底物半乳糖苷酶，使人工底物X-X-ga

15、lgal转化成蓝色的代谢转化成蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外产物，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源源DNADNA片段，将使片段，将使lac Zlac Z基因灭活，不能生成有活性的基因灭活，不能生成有活性的-半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。373839（二）（二） 免疫学方法免疫学方法 如果克隆基因的产物是已知的，并且如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。学发光或显色反应

16、进行筛选。 40（三）（三） 核酸杂交法核酸杂交法 对菌斑或菌落进行原位分子杂交是从对菌斑或菌落进行原位分子杂交是从基因组文库、基因组文库、cDNA文库或重组质粒中筛文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一，而且这选目的基因的最有效的方法之一，而且这种筛选不取决于目的基因是否表达。种筛选不取决于目的基因是否表达。41菌落原位杂交菌落原位杂交的原理的原理 转化转化 E. coli并铺于琼脂平板上并铺于琼脂平板上将膜放置将膜放置平板表面平板表面定位、揭起定位、揭起变性、变性、中和、中和、固定固定杂交、杂交、洗膜、洗膜、显影显影42（四）（四） PCRPCR技术技术 具有高度的灵敏度和特异性，

17、能在极具有高度的灵敏度和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过琼脂糖凝胶电泳，可直接观察到产物通过琼脂糖凝胶电泳，可直接观察到产物的存在。的存在。 43( (五五) ) 酶切鉴定酶切鉴定 用抗生素筛选、蓝白筛选等方法筛选出用抗生素筛选、蓝白筛选等方法筛选出的菌落需进一步进行酶切分析，鉴定插入的菌落需进一步进行酶切分析，鉴定插入片段的大小和插入方向。片段的大小和插入方向。 44举例：举例： 人肿瘤坏死因子在大肠杆菌中的表达人肿瘤坏死因子在大肠杆菌中的表达45464748495051人肿瘤坏死因子基因序列ATGAGCACTGAAAGCATGATC

18、CGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAGACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATCGTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTGGGGTGATCGGCCCCCAGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGGCCCAGGCAGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGTTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCC