NAMPT通过SIRT1ASlncRNAmiR-22SIRT1通路调节内皮租细胞的衰老,增殖和迁移

1、NAMPT通过SIRT1ASlncRNA/miR-22/SIRT1通路调节内皮租细胞的衰老,增殖和迁移通过大量的文献报道证实，在心血管疾病中内皮祖细胞（EPCs）的重要性。以前的研究表明磷酸核糖转移酶（NAMPT）在通过Sirtuinl（SIRT1）调节EPC的发展中发挥重要的作用，但是具体的机制还没有阐明。在刺激伴有NAMPT的EPCs以后，SIRT1和SIRT1反义长链非编码RNA（ASlncRNA）上调。将一个SIRT1ASlncRNA过表达载体转染到EPCs中，SIRT1表达上调。将一个一个小干扰RNA（siRNA）靶向注射到SIRT1ASlncRNA伴随NAMPT以后，SIRT1AS

2、lncRNA下调并且NAMPT-诱导SIRT1表达也降低。我们用软件分析和双重荧光素酶标记实验证实，miRNA-22调节SIRT1和SIRT1ASlncRNA。我们的数据证实SIRT1ASlncRNA通过竞争性吸附miR-22,减轻miR-22诱导的SIRT1下调。通过测量EPC衰老，增殖和迁移，我们发现NAMPT通过SIRT1ASlncRNA/miR-22/SIRT1通路抑制内皮租细胞的衰老，并促进EPC的增殖和迁移。这些发现为动脉粥样硬化和其它心血管疾病患者的预防和治疗提供了一个新的理论基础。这些研究结果为动脉粥样硬化（AS）等心血管疾病的防治提供了新的理论依据。据世界卫生组织统计，全球每

3、年有1670万人死于心血管疾病，占全因死亡率的50%以上。AS的发病机制是复杂的，但由于引发事件，包括血管内皮损伤、内皮功能及局部微血管系统的再生修复为AS的预防和治疗等提供新的治疗策略。最近的研究表明，内皮祖细胞（EPCs）可以分化为血管内皮细胞，促进血管生成，并是AS为发病机制提供重要的作用。乔治等人发现载脂蛋白E（apoE）基因敲除小鼠内皮祖细胞减少，血管修复能力下降。止匕外，有研究表明，烟酰胺转磷酸核糖激酶（NAMPT）作用于血管内皮细胞，这表明NAMPT可能在心血管疾病的发生、发展中起重要作用。在血管内皮细胞，NAMPT被证明能显著上调血管内皮生长因子（VEGF）的表达，促进血管内皮

4、细胞。止匕外，对人脐静脉血EPCs中，降低伊半乳糖甘酶的活性，增加端粒酶NAMPT活动，从而促进血管生成的。因此，我们推测，通过抑制NAMPT的形成影响EPC衰老。在哺乳动物中，NAMPT的限速酶的烟酰胺腺喋吟二核甘酸（NAD）生物合成途径将烟酰胺烟酰胺单核甘酸。范等人发现在人血管平滑肌细胞通过激活SIRT1抑制p53的功能，NAMPT增加NAD+水平，从而发挥抗衰老的作用。最近，高浓度葡萄糖被发现通过抑制SIRT1的活动表明，SIRT1参与介导的内皮祖细胞衰老诱导EPCs的衰老。以前，我们表明在内皮祖细胞NAMPT生理浓度（1nm）增强SIRT1的表达，可能抑制EPCs的衰老。以前，我们发现

5、NAMPT减弱ox-LDL诱导的衰老细胞通过上调SIRT1的表达是通过PI3K/ERK途径。此外，研究表明NAMPT调节SIRT1通过替代途径，如通过长链非编码RNA（IncRNA）,这是一个转录本长度超过200个核甘酸,不编码蛋白质的RNA分子，但可以调控基因表达，参与细胞增殖、分化、凋亡、和其他生理过程。止匕外，lncRNAs已发现与各种病理疾病过程相关。最近，lncRNA被证明影响心脏和血管的生长和分化，并与动脉粥样硬化性心脏病和心力衰竭有关。SIRT1lncRNA是天然反义转录（NAT）SIRT1，并且SIRT1lncRNA的表达增加SIRT1蛋白水平，而过表达SIRT1作为一个lnc

6、RNA突变不影响C2C12细胞SIRT1蛋白水平。止匕外，通过microRNA下调SIRT1（MIR）-34a消除SIRT1在C2C12细胞lncRNA的作用。在这项研究中，在EPCs中，我们探讨是否NAMPT调节SIRT1通过SIRT1lncRNA,并且我们探讨NAMPT对SIRT1在AS中的具体机制。2.1 细胞培养小鼠内皮祖细胞（原始细胞，中国）进行培养（Gibco、卡尔斯巴德、CA、美国）含10%胎牛血清（FBS、Gibco）。NAMPT（小鼠重组；米尔皮塔斯、CA、美国生物、）是添加到浓度为1nM,如果需要的话。2.2 载体重构和转染SIRT1ASlncRNA通过PCR扩增。正向引物

7、5-CGGGGTACCTATGCTAGAACAATGAAG-3（KpnI位点，下戈U线）和反向引物5-CCGGCTCGAGTTGCCTGCCTGTTGAGGA-3（XhoI酶切位点，下划线）。PCR产物经克隆入pcDNA3.1（Invitrogen公司，美国），经测序和克隆。pcDNA3.1-SIRT1为lncRNA的质粒进行PCR突变产生的突变体，和八个突变位点均在miR-22结合位点。SIRT1的lncRNA的siRNA,miR-22的模仿和抑制剂均购自Ambion（中国）。细胞接种于六孔板中，1x105细胞/毫升，与脂质体2000孵育24h后转染时进行细胞融合达70%（Invitroge

8、n）根据制造商的指示。转染质粒，miRNA,siRNA浓度为4闻/ml,50nM/孔，50nM/孔。转染后，EPCs收集和进行进一步的分析。总RNA,用Trizol试剂分离的细胞（液氮）根据制造商的指示。然后，1微克总RNA的制备与第一链cDNA合成试剂盒（Fermentas,德国）。引物是SIRT1的IncRNA基因特异性引物（向前：5-AATCCAGTCATTAAACGGTCTACAA-3;反:5-TAGGACCATTACTGCCAGAGGA-3）和SIRT1基因特异性引物（向前：5-TTGGCACCGATCCTCGAAC-3;反：5-CCCAGCTCCAGTCCAGTCAGAACTAT-

9、3）。GAPDH作为内对照。实时荧光定量PCR是在ABIPRISM7500序列检测系统进行（美国）与SYBRGreen一起（TaKaRa,中国）。比较循环阈值（CT）法用于定量。2.4 免疫印迹分析全细胞提取物用细胞裂解试剂制备（西格玛，穆村，美国）根据制造商的说明。采用BCA法测定蛋白浓度定量（皮尔斯，罗克福德，IL,美国），和蛋白质样品进行10%SDS-PAGE和WesternBlot检测使用SIRT1,半乳糖甘酶，和GAPDH抗体（CST,美国）。检测与羊抗兔IgG抗体进行标记辣根过氧化物酶（皮尔斯）和电化学发光检测系统（supersignal西微微；Pierce）。2.5 双重荧光素酶

10、实验全长SIRT13UTR和SIRT1ASlncRNA的扩增并克隆至UpsiCHECK-2载体上（Promega）。在提供结合位点突变体用QuikChange定点诱变试剂盒II（Stratagene公司创建的，CA,美国）。载体和miR-22模拟转染荧光素酶活性，并用双荧光素酶检测系统检测（Promega）按照制造商的指示。实验是在三个独立的实验重复进行。2.6 端粒酶活性的测定端粒酶活性的基因检测采用端粒重复序列扩增协议（TRAP）测定（罗氏应用科学，印第安纳波利斯，美国）按照制造商的指示。简而言之，2x105内皮祖细胞进行裂解，裂解试剂200毫升，和细胞裂解液离心16000转20分钟4C。

11、0.5微克的细胞提取液作为PCR反应的模板（50微升）。扩增产物（2.5用于杂交和ELISA检测。端粒酶活性被描述为相对端粒酶活性（RTA）。每组均含有阴性和阳性对照。端粒酶活性计算对EPCs相对于RTA阳性对照细胞的占比。细胞增殖在DNA合成期间，在96孔板中采用BrdU掺入测量比色法检测细胞增殖（BrdUELISA试剂盒，罗氏，德国）。转染48h和孵育后，媒体被细胞BrdU标记（10mM5-bromo-2-脱氧尿喀噬核音）3h,在37C孵育。细胞固定和过氧化物酶标记的抗BrdU抗体在室温下90分钟。然后，过氧化物酶底物（3,3,5,5-四甲基联苯胺）加入，和BrdU掺入定量的差异，在波长3

12、70nm吸光度减去492。细胞增殖率为对照值的平均百分比（100%）。2.8 细胞迁移率实验细胞迁移率（BDBiosciences公司,CA,美国）用侵袭小室，在DMEM中培养液（0.6毫升）被添加到下室。细胞被稀释到2x106细胞/毫升，在无血清的DMEM中，并100川的细胞中加入上室和5%CO2气氛中孵育37C6小时，4%戊二醛15分钟加入修复细胞插入滤波器的下侧。此外，用棉签去除滤膜上部剩余的细胞。用0.1%的结晶紫染色10分钟，用PBS清洗，显微镜下计数。2.9 统计学分析数据统计分析采用SPSS17.0统计软件进行（芝加哥、IL、美国）。两组之间的差异采用双尾t检验，三组或更多组之间

13、的差异采用单因素方差分析、多重比较分析。p0.05（*）被认为具有统计学意义。结果3.1. NAMPT上调SIRT1ASlncRNA的表达,在EPCs中SIRT1的表达我们先前表明NAMPT上调SIRT1的表达。对SIRT1ASlncRNA的发现，我们表明，NAMPT剂量依赖性上调SIRT1ASlncRNA表达（图1A）。因止匕，我们推测，在EPCs,同时上调SIRT1ASlncRNA和SIRT1的表达，提示SIRT1ASlncRNA可能诱导SIRT1NAMPT激活机制中发挥作用。因为NATs一般调节基因表达，我们探讨是否NAMPT调节SIRT1通过SIRT1ASlncRNA。SIRT1ASl

14、ncRNA表达载体在EPCs中，SIRT1表达增加（图1B、C、D）。EPCs中当siRNA靶向转染SIRT1ASlncRNA随着NAMPT，结果表明下调SIRT1ASlncRNA的表达能削弱NAMPT对SIRT1表达的促进作用（图1B、C、D）。这些结果表明，通过调节SIRT1的表达通过lncRNAASSIRT1的表达。3.2. NAMPT调节SIRT1通过SIRT1ASlncRNA/miR-22通路IncRNA可通过多种机制发挥作用调节SIRT1的表达，它可以与miRNA调控基因表达的作用。根据米兰达和RNAhybrid软件分析，有提供结合位点的SIRT1和SIRT1的IncRNA（图2A

15、,B,C）。在合成miR-22模仿内皮祖细胞转染，SIRT1和SIRT1表达的IncRNA被抑制（图2D）。双荧光素酶报告基因检测证实miR-22结合SIRT1和SIRT1的lncRNA（图2E）。因此，为lncRNA可能调节SIRT1通过miR-22。在共转染内皮祖细胞与SIRT1的lncRNA过表达载体和miR-22的模仿，SIRT1表达的抑制是相对于模仿组仅转染miR-22减少。在共转染内皮祖细胞与SIRT1ASlncRNA-m（miR-22结合位点突变）表达载体和miR-22模拟结合，SIRT1表达不能被抑制（图3A）。此外，miR-22减少NAMPT对于SIRT1表达的作用（图3A）

16、。隐私，我们的数据显示NAMPT通过SIRT1ASlncRNA/miR-22信号通路调节SIRT1的表达。3.3. NAMPT通过SIRT1ASlncRNA/miR-22信号通路调节EPC的衰老因为SIRT1与细胞衰老紧密相关，我们假设NAMPT通过SIRT1ASlncRNA/miR-22信号通路调节EPC的衰老。”乳糖甘酶的表达水平升高，被认为是衰老的一个标志。端粒的长度也与衰老相关，端粒酶维持端丽序列的长度和修复损坏的染色体。因此，细胞衰老的程度可以通过乳糖甘酶和端粒的活性进行评估。我们发现NAMPT抑制伊gal表达增加端粒酶的活性（图3B,C）。SIRT1ASlncRNA和NAMPT抑制

17、细胞衰老，而miR-22抑制细胞衰老。另外，miR-22减弱NAMPT和SIRT1ASlncRNA的抗衰老作用，但是SIRT1ASlncRNA不阻碍miR-22的促衰老作用（图3B,C）。因此，NAMPT通过SIRT1ASlncRNA/miR-22/SIRT1信号通路调节EPC的衰老。3.4. NAMPT通过SIRT1ASlncRNA/miR-22/SIRT1信号通路调节EPC的增殖和迁移内皮祖细胞前体细胞迁移、增殖调节EPC的增殖、迁移、分化为血管内皮细胞，促进血管内皮修复和新生血管形成的。我们发现NAMPT和SIRT1lncRNA促进EPC的增殖和迁移，而抑制miR-22EPC的增殖和迁移

18、（图4）。miR-22也减少NAMPT和SIRT1ASlncRNA诱导EPCs的增殖和迁移。对SIRT1结合位点突变miR-22lncRNA（SIRT1lncrna-m）并没有阻止抑制miR-22从EPC的增殖和迁移（图4）。这些数据表明，通过SIRT1ASlncRNA/miR-22/SIRT1信号通路调节EPC的增殖和迁移。讨论AS是多种心血管疾病的病理基础，从而威胁到数以百万计的全球人口健康。在缺血或血管损伤的病例中，在骨髓的EPCs可以迁移至外周循环和心肌缺血或损伤部位，分化为成熟的内皮细胞，促进新生血管形成，从而减轻组织缺血和修复血管损伤。NAMPT表达于心脏、大脑等组织具有多种生物学

19、效应。目前，关于NAMPT在心血管疾病中的作用缺乏一致的。例如，一些研究表明NAMPT导致内皮功能障碍诱导炎症和粘附分子的表达。然而，一些研究表明，内皮细胞中NAMPT过表达提高内皮细胞抗衰老等因素引起的氧化应激的能力，如高血糖浓度，最终促进内皮细胞的增殖。NAMPT也表明上调内皮型一氧化氮合酶的表达和活性内皮型一氧化氮合酶（eNOS）,通过AKT和MAPK信号通路，以及增加NO的生成，从而改善血管内皮细胞功能。此外，NAMPT可能施加不同的影响在不同浓度中也不同。然而，迄今为止，只有少数的研究中关于NAMPT在EPCs中的作用。的表达在内皮祖细胞中表达，并且最近的一项研究表明，SIRT1减缓

20、另外一个最近的研究还表明，SIRT1在这项研究中，我们发现NAMPT先前的研究表明Nampt促进SIRT1SIRT1的表达在不同的体细胞和生殖细胞中。血管内皮细胞衰老，维持血管内皮细胞功能。调节外周循环EPCs数量和减慢EPC衰老上调SIRT1ASIncRNA的表达，从而调节在EPCs中SIRT1的表达。SIRT1IncRNASIRT1NAT是一种IncRNA。最近的数据表明IncRNAs参与AS的发生，心脏衰竭，和许多其他的疾病。例如，LincRNA-P21已经显示出抑制增殖和促进凋亡巨噬细胞保护血管。因此，SIRT1ASlncRNA可能调节EPC的发展。在人类，小鼠，大鼠的表达研究中，有义

21、转录和NAT之间的关系是结果呈正相关。虽然NAT主要是正调控感基因的表达，但是调控的确切机制尚不明确。在目前的研究中，对lncRNA调控机制的常见方式是miRNA参与的相互作用。我们发现，SIRT1ASlncRNA缓解mir-22-诱导的抑制SIRT1通过竞争性结合miR-22。陈等人也证实miR-22的抑制增殖、运动、侵袭和通过直接靶向SIRT1人类胶质母细胞瘤细胞进行。止匕外，有研究表明NAMPT下调mir-22-诱导抑制SIRT1,通过上调SIRT1ASlncRNA的表达最终促进SIRT1的表达，降彳氐EPC衰老，增强EPC的增殖和迁移。许等人发现hsa-miR-22通过抑制SIRT1的

22、表达，导致细胞衰老诱导pRb的磷酸化。唐等人发现MALAT1受ox-LDL诱导的血管内皮功能障碍，部分通过竞争内源性RNAmiR-22-3p进行。这些研究的结论表明，IncRNAs和miRNA之间的相互作用在基因表达调控中发挥关键作用。综上所述，我们发现NAMPT调节SIRT1通过SIRT1ASIncRNA/miR-22的途径。我们的数据为AS发展进一步的探索提供了依据，特别是机制涉及NAMPT,SIRT1,及相关IncRNAs的机制。AugsGQJdxB理二BJ一星匚aoJIdF.LIMNFT南1%13SlTTIASIheIHA5HTLoipnraMaiimEFCi.对wetfwilliIb

23、riradiiJlird口EiirrUrHiiMuof柏91MdpTRT-gPOEsihDvnEhAtNAAlfTDtLTEumWT1昭tmtWh|iriE即Cb*旧itMjpcIwilh岫MFT缉MjhiGEwirtibSIill抵gorGIRT1ASbrlNA-OL阳gnWITlMIjhHRMiif函具UponErtJtoiCTTl,亶用匚.心JncftMAaprriMDn留心EtwrurdbyH-qX&|&L13nd5IEnincpmsicnvrasnwajiredbjWeitrmblol(CLCADPMnerwrdasilhrrcrrhiKD.1ganb-Mscbk.ErwUr*中盅S

24、O:.jiDiM|.ASIRT1ASIncRNA:5,CUCCUA3,UUUUCCUGGCAGUAGAAGGACCGUCG3UGUCAUUAA51uoasajgzOBSmilfnAHAASIncRNABmmu-miR-22;3UGUCAAGA-AGUUGACCGIKGAA5I：lII：IIIIIHill：SIRT1ASIncRNA-5A7ACTTTTCTCCTCTGGCAGTA3-SIRT1ASIncRNA-Mu:5A1ACTTTTCTCCTGCACATCGA3,ControlNCmiR-22mimicsmiR22inhibitorsCmmu-mlR-22.3ugucAAGAAGUUGACCGUCGAa5IIIIIIIIIIIIIISIRT1:5*cauuUUCCAAAA