三、基因工程的载体

1、第三章：基因工程的载体第三章：基因工程的载体 用于基因克隆的载体质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体的功能及特征载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 具有合适的筛选标记 具有较高的外源DNA的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 质粒质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子

2、质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数的质粒是DNA型的绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 relaxed plasmid质粒质粒的基本特征质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞

3、中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容粒组成不相容性群质粒质粒的基本特征质粒的不相容性：分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优

4、势质粒质粒的基本特征质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等如Col、R的其它成员非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定质粒质粒的基本特征携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA

5、重组分子的筛选具有重要意义质粒质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：pSC101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 TetrColE1 6.5 kb 拷贝数 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Ampr质粒质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因低

6、拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒 装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选n报告基因：载体上导入，证明载体已经转入报告基因：载体上导入，证明载体已经转入宿主细胞中，将含有目的宿主细胞中，将含有目的基因基因的宿主从其它的宿主从其它细胞中区分出来，比如抗药性报告基因，细胞中区分出来，比如抗药性报

7、告基因，LacZ，lux等等质粒重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制 pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR322： 氯霉素可扩增拷贝数 50 - 100 / cell用于基因克隆 质粒重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 / 19： 拷贝数 2000 - 3000 / cell用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZBamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTA

8、CCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII质粒重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 / 19：正选择标记 lacZ 的显色原理pUC18/19PlaclacZMCSb-半乳糖苷酶的a-肽段OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONN5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-galn蓝白斑筛选蓝白斑筛选：利用：利用-半乳糖苷酶插入失活半乳糖苷酶插入失活的载体，在生色底物的载体，在生色底物(X-gal)和诱导物和诱导物(1PTG)存在时，可形

9、成深蓝色菌斑。用这存在时，可形成深蓝色菌斑。用这种载体进行克隆时，种载体进行克隆时，-半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的大部分被外源大部分被外源DNA片段取代，所产生的重片段取代，所产生的重组体丧失组体丧失-互补能力，在含有互补能力，在含有X-gal和和IPTG的平板下形成无色菌斑。因此，对于这类的平板下形成无色菌斑。因此，对于这类重组载体，可通过组织化学方法进行重组重组载体，可通过组织化学方法进行重组子的筛选。子的筛选。质粒重要的大肠杆菌质粒载体pGEM-3Z：多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZ用于外源基因的高效表达 注意：T7和SP6启动子特异性地

10、由噬菌体DNA编码的RNA聚合2743 bpMCSlacZPT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等质粒质粒DNA的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA： 氯化铯密度梯度离心法 质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱溶法 质粒DNA纯度低、快速、操作简便沸水浴法 质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间质粒质粒DNA的分离纯化氯化铯密度梯度离心法： 用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀ccc

11、DNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs质粒质粒DNA的分离纯化碱溶法： 用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质 离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除蛋白质乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA用无DNase的RNase去除残余的RNA cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA质粒质粒DNA的分离纯化沸水浴法： 用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴40秒钟离心，用无菌牙签挑去沉淀物 乙醇或异

12、丙醇沉淀质粒DNA噬菌体或病毒DNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl 噬菌体的生物学特性： 生物结构l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成 l-DNA全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61个基因l 噬菌体生物学特性： 生

13、物结构5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l l - DNA噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl 噬菌体生物学特性： 感染周期E.coli吸附LamB受体注入复制包装裂解噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl 噬菌体生物学特性： 感染周期体内包装100个左右的拷贝包装范围为原DNA的75 - 105%即 36 - 51 kbDA噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl 噬菌体生物学特性： 溶原状态 l噬菌

14、体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态。 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态。噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度 野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短

15、野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体： 插入型载体取代型载体噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度 插入型载体体外包装插入位点体外包装插入片段载体长度 37 kb插入片段大小：0 - 14 kb（51 37）噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度 取代型载体体外包装体外包装插入片段最小装载长度 10 kb（51 26）载体长度 26 kb插入片段最大装载长度 25 kb（36 26）噬菌体或病毒DNA大肠

16、杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1 - 2个同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：加装选择标记与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记颜色反应类标记噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-

17、DNA载体的构建：加装选择标记 imm434imm434基因编码一种阻止l-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活， l-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：加装选择标记 lacZlacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产生蓝色透明斑噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：构建琥珀密

18、码子的突变体 琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。将野生型l-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。 噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA重组分子的体外包装：l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受

19、体细胞用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA及其重组分子的分离纯化：将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37培养1小时 用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒 密度已达1013 -101

20、4 / L，大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放l-DNA 乙醇或异丙醇沉淀l-DNA 噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA作为载体的优点：l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 重组l-DNA分子的筛选较为方便 重组l-DNA分子的提取较为简便 l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达 外源基因噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13噬菌体的生物学特性： 生物结构M13噬菌体的外型呈丝状M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成 M13 D

21、NA全长6407个核苷酸M13 DNA上至少有10个基因2700个外壳蛋白分子M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长 噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13噬菌体的生物学特性： 感染周期+ DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA- DNAIIV噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13 DNA载体的构建：III VI I IV II X V VII IX VIII野生型M13RF-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mp系列载体lacZpolylinker噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13

22、DNA载体的特点：使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外这在DNA定向突变中非常有用M13重组分子筛选简便被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大 但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb噬菌体或病毒DNA 与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病 毒基因组DNA。 动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类： 单链DNA病毒双链DNA病毒单链RNA病毒双链RNA病毒 RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物，这些中间体可作为载体

23、进行常规的DNA重组。考斯质粒与噬菌粒 l-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25 kb和1.5 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段， 考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。 在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序列和质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。考斯质粒与噬

24、菌粒考斯质粒（cosmid）考斯质粒载体的构建：考斯质粒是一类人工构建的含有1978年Collins和Hohn发明构建pHC796400 bpTcrl fragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体cos site - carrying plasmid1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段装载范围为30 - 45 kb考斯质粒与噬菌粒考斯质粒（cosmid）考斯质粒载体的特点：能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简

25、便，筛选容易不能体内包装，不裂解受体细胞考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（phagemid or phasmid）噬菌粒载体的特点：噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞 装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb）能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（phagemid or phasmid）重要的噬菌粒载体：pUC118 / 119pUC118 pUC18 + M13间隔区 IGpUC119 pU

26、C19 + M13间隔区 IG500 个拷贝3200 bpMCSlacZlacIoriAprM13-IGpUC118 / 119表示M13辅助噬菌体DNA考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（phagemid or phasmid）重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT72958 bpMCSlacZPT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌体启动子PT3和PT7强化外源基因的转录提取出来的单链DNA重组分子在噬菌体RNA聚合酶的存在下，又可实现外源基因的体外转录人造染色体载体 人类、动物、植物的全基

27、因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千 kb 的DNA片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前常用的人造染色体载体包括：细菌人造染色体（BAC）酵母人造染色体（YAC）人造染色体载体细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50 - 300

28、kb之间各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝pBACs主要适用于：克隆大型基因簇（gene cluster）结构构建动植物基因文库人造染色体载体酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）YAC载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建：pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的选择标记大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记YAC载体的装载量为350 - 400 kb人造染色体载体酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）酵母人造染色体的使用：pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI连接转化酵母菌重组酵母染色体 用于基因转移的受体菌或细胞各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（r