分子生物学与细胞生物学实验基本技术2

1、实验十九SSCP技术检测基因突变一、目的学习分析基因突变的SSCP技术。二、概述单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开.该方法称为单链构象多态性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析。将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技

2、术，进一步提高了 检测突变方法的简便性和灵敏性.。三、材料电泳仪，垂直板电泳槽，移液器，枪头，载样缓冲液，凝胶图象分析仪等。四、实验步骤1、通过PCR方法扩增DNA片段，从琼脂糖凝胶电泳中回收及纯化DNA片段。2、制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)：1) 制备适宜浓度的胶液，加入胶模的两块玻璃板之间。2) 在胶凝固之前，将梳子插入模子。3) 室温放置1h使之凝固.然后拔掉梳子，顶部加入1×TBE封闭，备用。3、加样1) DNA变性：将DNA样品与载样缓冲液（含50%去离子甲酰胺的pH8.0  20mmol/L Tris-HCL）混合，在90-95加热3-5分钟，然后立即置于冰浴中

3、。使双链DNA片段变性成为单链DNA。2) 每孔加样量5-15ul。4、电泳 在10-15下电泳.开始在20W电泳，待样品进入胶后，再调节功率至30W，电泳1-3小时。若以恒定电压进行电泳，电压可维持在10-20V/cm。电泳结束后取下凝胶，将其浸在含 0.5ug/ml溴化锭的1×TBE缓冲液中染色30-45min，在紫外灯下观察，或进行银染。5、银染法1) 将凝胶用去离子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定30min，不断摇晃。2) 倒掉固定液，用去离子水洗二次。3) 再浸入染色液（0.15%AgNO3）中，染色10分钟。4) 倒掉染色液，用去离子水洗3-5次。5) 将

4、凝胶浸入显色液（0.5%NaOH和 0.15%甲醛）中显色，直至条带显示最佳颜色（约10min）。6) 立即倒掉显色液，加入终止液（10%冰乙酸），终止反应。.7) 将凝胶置无水乙醇中脱水，凝胶图象分析仪观察拍照，或将凝胶封入塑料袋中，可以保存较长时间。五、注意事项：1. PCR-SSCP只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序。2. 由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。 3

5、、经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现。3. 在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下：DNA片段长度(核苷酸数)丙烯酰胺(%)1Kb700b3.5700b500b5500b200b8200b12审实验二十PCR-RFLP一、目的掌握PCR-RFLP方法及其在基因突变检测中的应用二、概述PCR-RFLP技术:PCR-RFLP全称多聚酶链反应(PCR)一限制性片段长度多态性 (restriction fragment length Polymorphism，RFLP)分析.PCR-RFLP主要有三个环 节:(1)靶基因PCR扩增;(2

6、)扩增的DNA片段限制性酶切图谱(长度多态性).该术应用PCR 将目的基因片段扩增百万倍以上，即使被测样品核酸量小于pg水平，也能被扩增出来，这不仅大大提高了基因分析的灵敏度，而且无需标记或放射性探针杂交过程.PCR-RFLP主要用于核酸变异性分析与比较，当DNA或RNA分子由于单碱基突变或序列重排，使某种酶切位点增加，减少或消失，导致限制性酶切片段长度发生改变，就产生了限制性片段长度多态性，由于限制性内切酶在DNA分子上有特异的酶切位点，根据其识别序列的位置和数量，可以把大小相似而序列有差异DNA切割成不同的片段通过核酸电泳，可将长度不等的DNA片分离而显出其长度多态性(片段的大小). PC

7、R-RFLP用于基因分析具有分辩率高，重复性好，简便快速直观等优点，主要用于微生物的分群分型分亚型，癌基因分析，遗传病的诊断，HLA分型及载脂蛋白基因的分析等.三、材料及试剂1. ALW261内切酶及反应buffer2. PCR产物样品3. 去离子水4. eppendorf管及Tip头5. PCR仪6. 标记笔、无粉手套等四、操作步骤1. 设置20ul反应体系，在200ulEP管中加入：PCR产物样品 17.5 ul10×buffer2 ul ALW2610.5 ul2. 充分混匀，离心20S。3. 置于PCR议上37反应过夜4. 用6×上样buffer上样电泳（1.5琼脂

8、糖凝胶）5. 凝胶成像及观察审实验二一动物组织细胞的裂解与全细胞蛋白提取、浓度测定一、目的掌握动物细胞裂解释放细胞全蛋白及其浓度测定的方法及保存条件二、概述组织细胞在特定的物理化学条件下，释放部分或全部蛋白质，通过离心等步骤加以分离，即可获得蛋白质粗品。制备细胞裂解物是分离蛋白质的一个重要步骤，裂解细胞的方法取决于不同的实验目的与要求。Cell lysis buffer 1用于释放细胞浆蛋白，Cell lysis buffer 11用分离全细胞蛋白，本实验以Cell lysis buffer 11为细胞裂解液提取全细胞蛋白。根据蛋白质性质，测定蛋白质的方法主要有：Bradford 法：蛋白质与

9、考马斯亮蓝染料的结合量不同，其OD595值也不同，与OD595成直线关系；Lowry法：蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物，此复合物及芳香族氨基酸还原磷钼酸磷钨酸试剂产生蓝色；紫外分光光度法：蛋白质的芳香族氨基酸在280nm 有吸收；双缩脲法：凯氏定氮法。本实验利用考马斯亮蓝法对提取细胞全蛋白质进行定量。三、试剂与材料1. Cell lysis buffer 11（50mMTris-Cl, 150mM NaCl, 0.0%NaN3, 0.1%SDS, 1mM PMSF, 1%NP-40, 0.5%去氧胆酸钠）2. 低温高速冷冻离心机3. 电动匀浆机4. 移液器5. EP管6. Tip头7. 制冰

10、机8. Bovine serum albumin (BSA)9. 生理盐水10. 紫外分光光度计或装备有595nm滤光器酶标仪11. 考马斯亮蓝G-250（0.01考马斯亮蓝G-250，4.75乙醇V/V，10磷酸（V/V）四、操作步骤（一）、全细胞蛋白提取1. 组织需用预冷的PBS洗净残血，每100mg组织加入Cell lysis buffer 1ml，电动匀浆机匀浆至无完整细胞结构（4）。2. EP管分装，离心（12000g×20min，4）。3. 上清液即为全细胞蛋白质，EP管分装后-70保存；部分用于蛋白质浓度测定。（二）、蛋白质浓度测定1. BSA标准管蛋白的配制：取1.5

11、mlEP管6个，分别加入0.5mg/ml BSA 0 ull、5ul、10ul、15ul、20ul、25ul，用0.9%NaCl补足至100ul。同样方法制备样品。2. 每管分别加入1ml考马斯亮蓝G-250，震荡片刻，室温放置2分钟。3. 加入酶标板或比色皿进行测定，读取OD595nm，以BSA标准管蛋白建立标准曲线和相关方程式，求出被测标本的蛋白质浓度。五、注意事项1. 制备蛋白质时一般要求在4条件下操作，并加入一定的蛋白酶抑制剂，以防蛋白质降解。2. 被检测样品的稀释度应在标准曲线范围内，所以要摸索好条件，再进行检测。审实验二二SDS-PAGE and WESTERN BLOT一、目的熟

12、悉SDS-PAGE电泳方法及其应用，掌握WESTERN BLOT检测蛋白质表达水平二、概述不同带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同，常用泳动率或迁移率来表示。泳动度是指带电颗粒在单位电场强度下电泳的速度。其影响主要因素有：带电颗粒净电荷的数量、大小及形状，电场强度，电泳液PH值及粒子强度，电渗作用。在SDS-PAGE过程中，加入SDS以消除带电颗粒本身电荷的影响，使电泳迁移率只决定于待分离物质分子的大小，与本身电荷无关。在变性条件下进行单向凝胶电泳，蛋白质在凝胶介质中向阳极泳动时因分子量大小不同而得到分离。灌制聚丙烯酰胺先灌制分离胶，待分离胶凝固后在其上灌制浓缩胶，然后固定在电泳装置上，蛋白质在

13、SDS存在下煮沸变性溶解，上样电泳后电转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上，与放射性或非放射性物质标记的抗体特异性结合，成像或现色以检测相关抗原的质与量。三、试剂及材料1. Protein marker2. Bovine serum albumin (BSA)3. Tris base( ultr pure)4. SDS (ultr pure) 5. 30%Acrylamide/Bis- Acrylamide6. 0.1M PMSF(biotech grade)7. Glycine8. DTT9. TEMED10. 二巯基乙醇（化学纯）11. 0.5%丽春红（分析纯）12. 5×SDS elec

14、trophoresis buffer (0.125M Tris, 0.96M Glycine, 0.5%SDS)13. 2×SDS landing buffer (0.1M Tris, 20% Glycerol, 4%SDS, 2%2-ME, trace bromophenol blue ) 14. TBST (0.1M Tris-Cl, 09% NaCl, 0.05% Tween-20,PH 7.5)15. Blocking buffer(TBST+5% non-fat dry milk)16. Antibodies diluted buffer(TBST+0.4%BSA)17.

15、Transfer buffer (25mM Tris-Cl, 192mM Glycine,20% methanol)18. 考马斯亮蓝R-250 (0.05%考马斯亮蓝R-250, 50%甲醇，10乙酸)19. Bio-Rad protein 111）电泳仪电泳槽、转移槽20. 台式高速冷冻离心机四、操作步骤（一）、SDS-PAGE1. 按电泳仪说明书组装好灌胶模块。2. 按table 1配制凝胶溶液，按要求制备分离胶和积层胶，凝固后备用。3. 上样：调整蛋白质样品浓度为5g/l，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，隔水煮沸5mim，冷却后按顺序依次上样（电转移胶每孔上样20l，银染胶

16、每孔上样8l，含合适的protein marker。4. 电泳：接通电源，恒压电泳（30mA，1小时，Tris-Glycine电泳缓冲液）至染料前沿到达凝胶底部。5. 凝胶考马斯亮蓝染色：将凝胶置于盛有考马斯亮蓝染色（10%乙酸，45%甲醇，45%水，0.05%考马斯亮蓝G-250）中，室温染色2小时以上，脱色液（10%乙酸，45%甲醇，45%水）脱色4小时以上至蛋白条带清新为止。6. 凝胶银染略。Table 1Contens10% separation gel（ml）5% condensing gel ( ml)Non-ion water4.03.430% acry/bis-acry3.30

17、.83Tris-CI2.5(1.5M PH 8.8)0.63(1.0M PH 6.8)10%SDS0.10.0510%AP0.10.05TEMED0.0050.005Mini protein 电泳系统效果图（二）、western blot 检测1. hBTCC-NMPs及对照组织全细胞蛋白经SDS-PAGE分离后，三明治法恒压电转移至硝酸纤维素膜（nitrocellulose membrane NCM）（100V，60min，4）。2. 取出NCM，丽春红染色5分钟，用软铅笔标记样品顺序及蛋白标准位置，流水脱色。3. 加入封闭液（含5% nonfat dry milk in TBST）室温封闭

18、1小时。4. 弃去封闭液，少许TBST润洗一次，加入一抗（1：100，抗体稀释液稀释，from rabbit）4孵育过夜。5. TBST洗膜3次，每次15分钟。6. 加入Sheep anti-rabbit IgG-HRP（1：1000，抗体稀释液同上），37湿盒中孵育1小时。7. TBST洗膜3次，每次15分钟。8. DAB试剂盒显色至满意效果，流水终止显色，照相保存。Mini protein 电转移系统效果图五、注意事项1. 凝胶不凝固原因有：AP失效，TEMED过期、凝胶溶液过期，温度过低，凝胶封闭不完整等，其中AP失效最为常见，考虑重新配制。2. 样品上样前应离心去除沉淀，以免影响电泳效

19、果。3. 电流不能过大，以免产热影响电泳效果（每块15mA）。4. Tris-CI (1.5M PH 8.8) 及0.5M Tris-CI（PH 6.8)PH值尽量准确。5. 电转移时三明治法程序从阴极至阳极依次是：垫片、滤纸、凝胶、NC膜、滤纸、垫片。放入转移模块时应是阴极接阴极，阳极接阳极，否则电转移不可能成功。6. 电转移时体系温度不能过高，过高会影响转移效率。7. 封闭效果不好会增加显色背景，可考虑增加封闭时间。8. 预实验确定好一抗和二抗稀释度，优化实验结果。9. DAB显色时，过氧化氢最好新鲜配制。10. SDS-PAGE分离胶合浓缩胶配方separation gelStored

20、solutionsConcentration of acry/bis-acry gel (%)589101112131415Non-ion water (ml)3.44.634.33.973.633.32.972.632.3030%acry/bis-acry (ml)0.632.673.03.333.674.04.334.675.01.5M Tris-CI(pH 8.8) (ml)0.832.52.52.52.52.52.52.52.510%SDS (l)5010010010010010010010010010%AP (l)50100100100100100100100100TEMED (l)

21、57.57.57.57.57.57.57.57.5Total volume 10ml separation gelthe volume is 5 ml when prepare condensing gel with 0.5 M Tris-CI (pH 6.8)审实验二三 细胞凋亡检测一、目的 熟悉细胞凋亡的一般检测原理及方法二、概述 细胞凋亡是指在一定的生理和病理情况下，机体为维护内环境的稳定，通过基因调控而使细胞自动消亡的过程。它有别于细胞死亡，而具备自己的特性：保持完整膜结构的细胞固缩，特异性的细胞浆大泡，染色体浓集，核碎裂后被细胞膜包裹而形成凋亡小体，因而可以用显微镜形态学检查得出。同

22、时凋亡在发生机制上是机体自己启动，由细胞本身自动控制，有基因指导的细胞自我消亡过程，因而它还伴随着细胞内外的化学改变，实验室常根据其化学变化来检测细胞凋亡的程度。以下就介绍几种常用的凋亡检测方法。DNA ladder法原理：依赖于Ca+、Mg2+的核酸内切酶激活后，将DNA在核小体连接处切割成180-200bp或其倍数的片断，因此可在琼脂糖凝胶电泳上显示出特殊的DNA梯状图谱。末端转移酶标记技术(TUNEL)原理：在细胞水平检测DNA裂解的原位标记技术已越来越多地被用于组织切片和培养细胞，细胞凋亡时，由于DNA的裂解，形成单或寡核小体的双链相对分子质量小的片段及在相对分子质量大的DNA上形成单

23、的继裂（缺口，nick）。此类断裂可用生物素、地高辛或荧光素标记的核苷酸在3-OH端予以显示。通常采用的酶是DNA聚合酶I或未端脱氧核苷酸转移酶（TdT），前者使核苷酸结合于缺口，需要模板存在，标记方法通常被称为“原位缺口平移”(in situ nick translation, ISNT),后者使核苷酸在双链的断端延伸，不需要模板的存在，其方法被称为未端记（end labeling）、加尾法（tailing reaction）或TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）。上述方法，尤其是TUNEL的应用已很广泛，其优点是可用于原位标记，可用于病理组织

24、，并可进行定量分析。值得注意的是坏死期由于内源性核酸内切酶和蛋白质酶的何等用，DNA被切割成大小不等的片段，也可出现 阳性反应。组织或细胞外理不当时可出现假阳性。因而，TUNEL等方法对凋亡细胞的标记是选择性的，而不是特异性的，TUNEL或其他DNA裂解原位标记的分析应结合阳性细胞的形态，尤其是核的特征，细胞的分布和有无炎症反应，除外非凋亡的阳性反应。Annexin v/PI原理：正常细胞的细胞膜磷脂分布是不对称的，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）位于细胞膜内侧，在细胞凋亡时转至细胞膜外表面，这一改变被认为是特导性的，并且可作为凋亡细胞表面改变的标记。PS表面化发生

25、于凋亡早期，其机制尚不清，可能是一种导致机体吞噬凋亡细胞的信号。膜联蛋白V是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力，荧光标记的膜联蛋白V与细胞表面PS结合，再用显微镜或流式细胞仪进行检测，可以观察凋亡过程中细胞膜PS的表面化。凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料（如PI)不能时入凋亡细胞内，坏死时胞膜遭到破坏PI能进入，因而结合PI染色进行双参数检测尚能区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞。正常细胞膜联蛋白V（-）PI（-），早期凋亡细胞膜联蛋白V（+）PI（-），晚期凋亡细胞和坏死细胞膜联蛋白V（+）PI（+）。三

26、、材料1. 电泳仪、电泳槽2. 真空干燥器3. Pharmacia Biotech公司的ImageMaster4. 流式细胞仪5. 微量加样枪(0.510 ul、540 ul和40200各1支)6. 流式试管及试管架7. Tip头8. 70%酒精、PBS、PC缓冲液(0.2mol/LNa2HPO4 和12mol/L枸橼酸按192:8混合后，调整到pH到7.8)、TBE9. NP-40、RNA酶、蛋白酶K 10. 0.25%溴酚蓝、EB染液、0.8%琼脂糖11. Annexin V试剂盒(CALTAG公司)四、操作步骤-（一）、DNA ladder法1. 收集细胞 取12×10个细胞，

27、离心后，用70%酒精固定2h。2. 洗涤 将酒精固定的细胞离去，去掉上清液，PBS 洗二次。3. PC缓冲液孵育、洗涤后的细胞经离心、去上清后，将细胞悬浮于40ml PC缓冲液中，室温下孵育。4. 真空干燥浓缩 将细胞悬液离心后，吸取上清液(含有小分子量的DNA片段)，加入到Eppendorf管中，用真空干燥器干燥浓缩15min。5. RNA酶消化 在干燥浓缩后的提取物中加入3ul0.25%NP-40和3ul1g/L的RNA酶，放37水浴箱孵育30min。6. 蛋白酶K消化 在干燥浓缩后的提取物中再加3ul1g/L的蛋白酶K，放37水浴箱继续孵育30min。7. 点样 在消化后的提取物中加入4

28、ul含0.25%溴酚蓝的点样液，混匀后，吸取约2040ul提取物，加入凝胶板上的点样孔中。另外，在最边缘的孔中点入指示剂。8. 凝胶的制作：0.8g琼脂糖粉末加入100ml0.5倍TBE缓冲液，搅拌加热至沸腾。将胶液冷却到约50左右时，加入200ul0.5ug/ml的EB染液，混匀后倒入胶板模中让其凝固。9. 电泳 将点样好的凝胶置于电泳槽，在0.5倍TBE缓冲液中用4v/cm电压电泳7h。10. 观察结果 典型的细胞凋亡显示出DNA梯带，最小片段约200bp左右。（二）、末端转移酶标记技术(TUNEL)1. 固定 收集12×10个细胞于离心管内，离心，弃去上清，重新悬浮于5mlPB

29、S；再离心，弃去上清。用1%多聚甲醛悬浮细胞，固定15min(4冰箱)后，离心，弃去固定液，用80%酒精在固定2h(-20冰箱)。2. 洗涤 将样品离心，弃去酒精，重新悬浮于5mlPBS，离心，弃去上清。重复此步骤二次。3. 平衡处理(此步骤仅用于oncor公司试剂盒) 将样品离心后吸取上清，每管加入75ul平衡缓冲液，用吸头反复吹吸数次，室温下静置510min。4. 反应 离心，吸去平衡缓冲液，每管加入反应液54ul(18ulTdT酶36ul反应缓冲液)，用吸头反复吹吸数次，离心管加盖，置37水浴箱内温育30min(每10min摇动离心管以悬浮细胞)。5. 终止反应 直接向离心管内加入5ml

30、 终止/洗涤液，继续温育10min，离心，弃去上清，重复此步骤一次。 6. 洗涤 向离心管内加入5ml PBS，重新悬浮细胞。7. FITC 标记 样品离心后，弃去上清，每管加入100ul FITC反应液(含亲合素-或链霉亲合素-FITC，或抗-地高辛FITC)，室温下避光孵育30min。8. 洗涤 直接向在离心管内加入5ml PBS。9. PI复染 样品离心后，吸去上清，每管加入 0.51mlPI染液(根据每管细胞数目)，反复吹吸使呈单个细胞悬液，室温下避光孵育30min。10. FCM检测 FACSCalibur流式细胞仪，采用蓝色激发光(波长488nm )，检测绿色荧光(-FITC) (

31、波长525nm) 红色荧光(PI) (波长620nm)11. 结果分析 所有细胞核均被PI着上红色荧光，而在显示屏上显示出其 DNA分布图(横坐标为DNA含量-红色荧光强度，纵坐标为细胞数)；凋亡细胞由于被特异地标记上FITC绿色荧光，因而显示二种荧光(绿色荧光FITC和红色荧光PI)，可与未凋亡细胞(仅含有PI荧光)区分开来(横坐标为DNA含量-红色荧光强度，纵坐标为DNA断裂标记-绿色荧光)。（三）、Annexin v/PI1. 收集细胞 用预冷的PBS洗涤两次。2. 用1倍结合缓冲液重悬细胞，使之浓度达到1×10个细胞/ml。3. 用加样枪吸取100ul(1×105个

32、细胞)到流式试管内。4. 加5ulAnnexin V-FITC和10ulPI到试管内。轻轻混匀，室温下避光孵育15min。5. 上机前，再加400ul结合缓冲液于试管内。流式细胞仪检测。6. 结果分析 正常细胞由于细胞膜没有损伤，PS位于细胞膜内侧，因而无法与以上两种染料结合而呈阴性；早期凋亡细胞由于PS外翻，能与Annexin V结合，被特异地标记上FITC绿色荧光；晚期凋亡和坏死细胞因为有细胞膜的损伤，PI能进入细胞内而上色因而显示二种荧光(绿色荧光FITC和红色荧光PI)；因而用Annexin v/PI可以区分正常、凋亡、坏死三种细胞。实验二四 CD3/CD19/CD45流式细胞术检测一

33、、目的 了解流式细胞术检测细胞膜表面抗原的实验原理、实验步骤及结果分析。二、概述 流式细胞术（FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。 它的工作原理：将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。流式细胞

34、仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果用数字显示。三、材料

35、及试剂1. 流式细胞仪FACSCalibur，BD公司产品2. 台式低速离心机 3. 微量加样枪(0.510 ul、540 ul和40200各1支)4. 流式试管及试管架5. Tip头6. 五种单抗：mouse IgGr1-FITC, mouse IgGr2a-PE, CD3-FITC, CD19-PE, CD45-PerCP7. 10×溶血剂8. PBS,双蒸水9. 含1%多聚甲醛的PBS四、实验步骤1. 准备两支试管，标记为对照管和检测管2. 对照管加mouse IgGr1-FITC, mouse IgGr2a-PE, CD45-PerCP各7.5ul; 检测管加CD3-FITC

36、, CD19-PE, CD45-PerCP各7.5ul。3. 两管各加外周血100ul（1×107），混匀，避光，室温孵育2025min。4. 每管加溶血素（10倍稀释）2ml,混匀，室温10min，溶血后1080rpm×5min，弃上清。5. 每管PBS 2ml洗涤，1080rpm×5min，弃上清。6. 加300ul含1%多聚甲醛的PBS固定。7. 上机检测。获取软件用CELLQuest,获取模板如下：图五、结果分析如图正常外周血细胞均为成熟细胞，均表达白细胞共同抗原CD45，其中以淋巴细胞表达最强，单核细胞及中性粒细胞次之。外周血T淋巴细胞表达CD3，B淋巴

37、细胞表达CD19审造血细胞分离与集落培养一、目的掌握造血细胞分离的方法，了解集落培养意义。二、概述从外周血、骨髓分离出来的细胞是多种细胞的混合物，如要进行集落培养，首先要分离纯化细胞。细胞纯化可根据其大小、密度而采用密度梯度沉降法来进行纯化。用于密度梯度沉降法分离细胞的介质应符合下列要求：（1）能产生一定程度的密度梯度，高密度时粘度不高；（2）PH中性或PH易于调整；（3）浓度不同时渗透压变化不大；（4）对细胞无毒性，细胞洗涤后能用于体外培养，分离液要无菌或能通过除菌滤膜。常用来分离人外周血单个核细胞(BMC)分层液比重是 1.077±0.001 的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(

38、Urografin)(FH)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2gml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。三、材料与试剂1. 比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞分离液)。2. Hank's液(无Ca、Mg)3. 10小牛血清RPMI16404. 培养体系3%琼脂 0.25ml血清 0.25ml刺激因

39、子 10ul细胞悬液 x ml0. 2台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。5. 肝素用Hank's液或生理盐水稀释成500单位/ml，抗凝人外周血肝素用量约为50单位/1毫升血。6. 无菌试管、吸管、1毫升和10毫升刻度吸管。7. 无菌干燥注射器针头。8. 碘酒，75酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。9. 血球计数板、显微镜、水平式离心机。四、操作步骤(一)、Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞方法1. 在试管中加入适量淋巴细胞分离液。2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水

40、平离心2000rpm×20分钟。3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。4. 用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。5. 末次离心后，弃上清，加入含有10%小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2%台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。6.

41、 单个核细胞浓度(细胞数1毫升细胞悬液)4个大方格内细胞总数×104×2(稀释倍数)/4细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。细胞活力（%）=未染色的细胞数/观察的细胞总数 × 100。7. 用本法分离PBMC，纯度在90以上，收获率可达8090，活细胞百分率在95以上。 （二）、造血干细胞的集落培养1、 分离单个核细胞；2、 在培养皿中加入适当比例的培养液、血清、细胞、集落刺激因子。3、 加入一定量的琼脂或甲基纤维素，充分混匀。4、 将培养皿或培养板置于含5% CO2饱和湿度的37C培养箱内，按需要时间进行培养。5、 观察结果。四、注意事项1. 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。2. 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。3. 用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面.4. 3%的琼脂放在水浴箱中煮沸溶解.5. 先在培养皿中放入其他培养物,最后放入琼脂马上轻轻摇匀。附：表一、人不同血细胞的漂浮密度细胞漂浮密度细胞漂浮密度红细胞淋巴细胞粒细胞B淋巴细胞嗜酸性T淋巴细胞嗜中性淋巴母细胞单核细胞自然杀伤细胞血小板审附实验器皿的清洗和消毒培养瓶或培养平皿的清洁与消毒是细胞培养成败的关键之一。清洁步骤：1. 初次使用的玻