免疫实验中国医科大学临床药学

1、实验安排实验一、ELISA板包被，封闭；小鼠抗原免疫；补体结合实验实验二、小鼠脾细胞提取及计数实验三、流式（测小鼠血T细胞）；NO测定； 双扩；血型鉴定实验四：ELISA；妊娠反应（试纸法）实验一：ELISA板包被，封闭小鼠抗原免疫眼球取血（一）包被 、封闭ELISA反应板1. 实验步骤：a. 微量加样器的使用b. 包被ELISA 反应板 ，37孵育1小时。c. 封闭ELISA反应板 ，37孵育0.5小时。2. 实验目的：检测小鼠抗绵羊红细胞抗体水平3. 试剂与器材：a. 包被稀释液（0.05mol/L Na2CO3NaHCO3 缓冲液，pH9.6）Na2CO3 1.5g；NaHCO3 2.9

2、g 加双蒸水至1000mlb. 封闭液（5%小牛血清/PBS 溶液）小牛血清50ml；PBS（pH7.4）950mlc. 洗涤液（PBST，pH7.4）NaCl 8.0g；KH2PO4 0.2g；Na2HPO4.12H2O 2.9g；KCl 0.2g；Tween 20 0.5ml 加双蒸水至1000ml4. 操作方法：包被酶标反应板：a. 待测血清：绵羊红细胞（SRBC）免疫小鼠血清b. 用pH9.6 的碳酸盐缓冲液1：200 稀释的抗原SRBC，用之包被聚乙烯塑料板。c. 每孔加100ul， 37温箱孵育1小时封闭酶标反应板d. 弃掉包被液，加入200ul PBS洗涤3 次，每孔洗3遍，每遍

3、1min。e. 甩干后用5%小牛血清/PBS 液封闭，每孔200ul。放370.5小时。f. 封闭结束后，弃掉封闭液，加入200ul PBS洗板3次，并在滤纸上拍干，每孔洗3遍，每遍1min。步骤说明：1. 酶联免疫吸附试验技术（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）（定量、定性实验）：是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为【包被】，加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原),生成【抗原(抗体)-待测抗体(抗原)-酶标记抗体

4、】的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。2. 【包被】：就是将已知抗原或抗体吸附于固相载体表面并保持其免疫原性。在ELISA 板上加上抗原以后，因为电荷数与板不同，所以抗原吸附板上，但是吸附后固相载体表面尚有未被占据的空隙；3. 【封闭】：就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而防止在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附原理：4. 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性; 5. 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合

5、物仍能保持其免疫学和酶学活性; 6. 酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果. 注意事项：1. 量取样品时选择适当量程的加样器，（P20： 0.520.0 µl；P200： 20200 µl； P1000：2001000 µl）2. 安装相应的枪头（白色P20，黄色P200，蓝色P1000）（2） 小鼠腹腔免疫1. 实验动物：昆明鼠6-8周，雌性2. 实验药品：抗原：绵羊红细胞（SRBC）3. 腹腔注射：5%的SRBC注射2

6、ml4. 操作步骤：免疫细胞的制备：准备适量的全血细胞：SRBC1500rpm*10min小心吸弃上清，留红细胞沉淀3mL生理盐水，重悬细胞沉淀重复上述步骤，反复洗3次。第三次离心后：3mL生理盐水，重悬细胞沉淀：制备好的SRBC.腹腔注射：左手提起并固定小鼠，使鼠腹部朝上，鼠头略低于尾部。右手持注射器将针头在下腹部靠近腹白线的两侧进行穿刺，针头刺入皮肤后进针3mm左右。使注射针头与皮肤呈45°角刺入腹肌，穿过腹肌进入腹膜腔，当针尖穿过腹肌进入腹膜腔后阻力消失，有落空感。固定针头，保持针尖不动，回抽针栓，如无回血、肠液或尿液后即可注射。注射量为2ml，标记小鼠。5. 注意事项：免疫之

7、前排空注射器中的空气；SRBC使用之前要混匀；.进针后的落空感。（3） 小鼠眼球取血1. 实验目的：小鼠腹腔抗原（SRBC）免疫后，小鼠体内产生了抗体，抗体（抗SRBC抗体）主要存在于血清内。眼球取血主要目的为收集血清。2. 实验药品：麻醉用药：4%水合氯醛；3. 实验步骤：a. 小鼠麻醉麻醉用药：4%水合氯醛；用量：每只小鼠0.4ml，腹腔注射b. 眼球取血：1、抓取小鼠，使眼球突出2、用眼科【弯镊】深入眼球深部，带着结缔组织，慢速夹去眼球，用1.5ml微量离心管接住流出的血液，每次采血量0.5-1ml 3、实验台上静置2h（11点左右）4、离心10000rpm，10min，收集血清，-20

8、保存c. 把取完眼球血的小鼠泡在装有70%酒精的烧杯中，接续【实验三】d. 将眼球血离心10000rpm，10-15min， e. 使用1000L加样器收集血清 （4）实验二：补体结合试验1. 实验试剂：2% sRBC；溶血素（血清中含有家兔-抗-sRBC 抗体）；补体（新鲜的豚鼠血清）；生理盐水2. 实验器材：小试管、微量加样器、水浴箱3. 实验步骤：a. 标记3个清洁、干燥的试管b. 加样（加样顺序如图）c. 水浴，37，孵育10m4. 注意事项：a. 挑选干燥、洁净是试管。若有水的试管会导致红细胞不等渗溶血。b. 水浴箱不可关闭水浴箱的盖子。水浴箱的盖子上的水若调入试管中，会造成反应体系

9、不等渗，进而导致红细胞因为渗透压的差异而破裂溶血。5. 实验结果：1号管中试剂变澄清，2.3号试管均浑浊实验三：小鼠脾细胞提取及计数1. 实验原理：脾脏是人类最大的免疫器官，捕获血源性抗原，储存血液。是动物体内最大的淋巴器官。深居于左侧肋弓之后，颜色暗红、质地柔软、呈内侧向内凹陷的扁椭圆形或条索状等。脾为表面有被膜覆盖的实体性器官。脾细胞主要成分：淋巴细胞，是执行免疫功能的重要细胞。为进一步了解和检测淋巴细胞的数量和功能，还需要制备脾细胞悬液。2. 实验试剂与器材：SRBC免疫一周的小鼠（眼球取血后的死亡小鼠）；PBS液作用是等渗、平衡渗透压、维持离子强度和PH；70%酒精作用是消毒红细胞裂解

10、液2ml冷NH4Cl动物解剖器械平镊和齿镊、5ml注射器、平皿、1.5ml微量离心管、15ml离心管、吸管、盖玻片。离心机，细胞计数板，显微镜3. 实验步骤：a. 取脾：将眼球取血后的小鼠颈椎脱位法处死；70%酒精皮毛全部浸湿3-5分钟，右侧卧位；左手持镊（尖头）提起皮肤，右手持剪刀于左侧肋骨最低点与髋关节间做一小切口 ；双手持镊子与切口垂直方向钝性分离皮肤，暴露腹膜；左手持镊提起腹膜右手持剪刀于腹膜做一小切口，双手持镊子与切口垂直方向钝性分离腹膜，充分暴露视野，于左侧肋缘下可见暗红色条索状脾脏；持【平镊】轻轻夹住脾脏，尽可能分离结缔组织和系膜（注意防止脾脏破裂）；将取下的脾脏放入装有5mlP

11、BS液的平皿中。b. 脾细胞提取：方法冲洗法研磨法优点制备的细胞数比较少，细胞比较分散；能够保持细胞的完整性，细胞不易破损省时，便于大量操作缺点不能保证细胞的完整性平镊轻轻夹住脾，用5毫升注射器吸取5mlPBS液，刺入脾脏冲洗脾细胞；拔掉针头用注射器吸取平皿中PBS液反复冲洗2-4次，直至脾脏由暗红色变为白色；把所获得的细胞悬液收集到15毫升离心管内，加PBS液至10ml（方便离心时配平）；c. 三次离心目的操作获得脾细胞收集离心管配平，1500rpm离心10min。去上清（沉淀贴壁面朝上倾倒上清）裂解红细胞使用吸管（每吸一次大约1ml）吸取2ml冷NH4Cl裂解RBC。【混匀】细胞后放置约5

12、min。加PBS液至10ml；1500r/min再离心5min，去上清洗涤细胞加PBS液5ml洗涤（上下吹打），1500r/min离心10min去上清 。悬浮细胞于1ml的PBS液中【混匀】。d. 弃上清，向离心管中加入1ml PBS液，充分混匀，得混匀液e. 计数液100倍稀释：先在EP管里加入990微升PBS液，从混匀液中吸取10微升加入到1.5ml微量离心管中涮一下枪头，反复抽吸几次，充分混匀。f. 显微镜计数：10×物镜找到细胞层和计数室；40×物镜找到白细胞计数区域。原则是从左到右S形计数，数上不数下，数左不数右实验四：抗原抗体反应1. 实验原理：a. 概念：体内

13、外发生的高度特异性结合反应，其结构基础为抗原表位与抗体超变区抗原结合位点的结构互补。b. 特点：特异性；非共价键结合；比例要适当c. 影响抗原-抗体反应的因素：电解质：0.85%氯化钠溶液；温度：37；酸碱度：pH6-8。抗原抗体复合物可在一定条件下解离，而免疫学特性不变。d. 凝集反应：在颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗原（或抗体）中加入相应的抗体（或抗原），在电解质存在的条件下出现凝集物的现象，称凝集反应。参与反应的抗原如细菌，细胞等，称凝集原，抗体称为凝集素。包括直接凝集反应（玻片反应、试管反应）和间接凝集反应。本次实验为玻片反应。e. 凝集反应分类：直接凝集反应：试管法和玻片法（反应

14、界面） 间接凝集反应 间接凝集抑制试验 协同凝集反应 抗球蛋白试验玻片法简便，快速，为定性试验，可做为半定量检测前的筛查试验，因该反应在玻片上进行而被命名玻片法 ，主要用于临床的血型鉴定，菌种鉴定 2. 实验器材：人外周血；抗A、抗B标准血清；（蓝色的为抗A，黄色的为抗B）；玻片（两种），采血针，棉签，酒精等3. 实验步骤：a. 准备玻片：取清洁载物玻片一张，于玻片左侧和右侧各加一滴抗A及抗B标准血清b. 采血：用无菌采血针刺破指尖或耳垂，用灭菌玻片的四个角（取2个即可）分别取血，加入含有抗A及抗B标准血清的液体中c. 反应：经12 分钟后用肉眼观察结果，出现红细胞凝集颗粒者即为阳性反应；仍为

15、均匀混悬液者为阴性反应。实验五：双向免疫扩散实验1. 实验原理：在含有电解质的凝胶中，可溶性抗原和相应抗体辐射扩散，形成浓度梯度，在比例适合处形成肉眼可见的白色沉淀线。一条沉淀线为一组特异性抗原抗体复合物。2. 结果分析：a. 沉淀线数量：对抗原抗体复合物只形成一条沉淀线；b. 沉淀线形状：沉淀线对于相应的抗原抗体是不可以通透的，对无关的抗原抗体是可以通透的；沉淀线的外形与反应物的分子量有关，通常趋向分子量较大的一方 c. 沉淀线位置：与反应物的相对浓度有关，通常靠近浓度小的一方3. 实验目的：检测病人血清中的甲胎蛋白（AFP）4. 实验试剂与器材：待测病人血清：待测1，待测2；阳性对照血清（

16、p）；抗AFP诊断血清；1.5食盐琼脂；琼脂板、打孔器，微量加样器，湿盒5. 实验步骤：a. 第一步：铺板将4ml琼脂倒入琼脂板中。b. 第二步：打孔打7个小孔,约7mm间距。c. 第三步：加样每空加样约1015l。d. 第四步：孵育放入37温箱孵育约24小时。6. 注意事项：倒胶要快速；打孔无裂缝；孔勿靠近琼脂边缘；加样不溢出；加样无气泡；清洗加样器1P2Ab12P7mm7. 结果分析：阳性对照孔和样品孔分别与SRBC小孔之间出现白色沉淀线。两条沉淀线相会后融合在一起，说明样品孔与阳性对照孔为相同成分。实验六：小鼠巨噬细胞NO的测定1. 实验试剂与材料：NaNO2标准品（100M）；1640

17、培养液；待测样品（1，2）； Griess试剂：使用之前两液等量混合【NED 0.2% (0.02g2.5H3PO4 10ml )用超声波溶解，SA 2%(0.2g2.5% H3PO4 10ml ) 】；微量加样器、枪头、板条。2. 实验原理：a. 巨噬细胞功能：强大的吞噬杀伤病原微生物的能力；重要的抗原提呈细胞，可摄取、加工处理及提呈抗原，激发适应性免疫应答；活化的巨噬细胞分泌大量细胞因子、补体成分及NO等，调控免疫应答。b. 诱导型NO合成酶（iNOS）系统为巨噬细胞活化后所产生的反应性氮中间物。iNOS属胞浆酶，在还原型辅酶II或四氢生物蝶呤存在下，可催化L-精氨酸与氧分子反应，生成胍氨

18、酸和NO。NO与吞噬细胞氧化酶所产生的过氧化氢或过氧化物酶结合，在体内酸性环境中产生可杀伤细菌的过（氧化）亚硝酸盐基，其在酸性环境中与Griess试剂中的磺胺和N-奈基乙二胺双氯化物进行重氮、偶氮反应，产生鲜艳橙红色产物。因此通过Griess法检测NO的水平来反映巨噬细胞的活化程度。3. 实验步骤：a. 于孔28中每孔加入100l 1640培养液b. 于孔1中加入200l NaNO2标准品c. 从孔1中吸出100l 加入2中，吹吸3次，再从2中吸出100l 加入3中，吹吸3次，再从3中吸出100l 加入4中，吹吸3次，以此类推，直至第7孔，混匀后吸取100l 弃掉。d. 于9和10中加入待测1

19、，11和12中加入待测2，每孔100l e. Griess试剂，每孔100l，室温10分钟，观测结果实验七：小鼠外周血T细胞亚群的鉴定流式细胞术1. 实验原理：a. 流式细胞术：（FlowCytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。b. 流式细胞仪特点：特异性好；灵敏度高（一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差5%即可区分）；多参数分析（细胞大小，胞内颗粒丰富程度，荧光强弱）；快速采集分析（每秒可检测1000-5000细胞，甚至上万个细胞）；客观性；流式细胞

20、仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上c. 流式细胞仪工作原理：将待测标本制备成单细胞悬液,经荧光标记抗体染色后由气压装置送入流动室。流动室由样品管和鞘液管组成,鞘液管充满流动的鞘液,鞘液流与样品流压力不等,当两者压力差达到一定程度时,鞘液裹挟着样品流迫使细胞有序地排列成单列,逐个进入激光聚焦区经激光束激发,产生散射光和荧光信号；通过一些波长选择通透性滤光片,即可将不同波长的散射光和荧光信号区分开来。散射光和荧光信号接收后转换成数字信号送计算机处理,可在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。d. 流式细胞仪应用： 分选细胞（严格无菌操作）；分析细胞大小和内部复杂程度 （颗粒性）；检测细胞表面表型: 抗细胞表面抗原抗体, MHC 四聚体等；透