活血祛瘀法干预激素性股骨头坏死骨组织的修复

1、www.CRTER.org陈雷雷，等. 活血祛瘀法干预激素性股骨头坏死骨组织的修复活血祛瘀法干预激素性股骨头坏死骨组织的修复陈雷雷1，2，陈晓波2，3，洪郭驹2，3，陈 达2，3，杨 鹏2，3，何 伟1，2 (1广州中医药大学第一附属医院关节骨科，广东省广州市 510000；2广州中医药大学国家重点学科中医骨伤科学实验室，广东省广州市 510000；3广州中医药大学第一临床医学院，广东省广州市 510000)引用本文：陈雷雷，陈晓波，洪郭驹，陈达，杨鹏，何伟. 活血祛瘀法干预激素性股骨头坏死骨组织的修复J.中国组织工程研究，2016，20(15):2148-2155.DOI: 10.3969/

2、j.issn.2095-4344.2016.15.003 ORCID: 0000-0002-5610-5245(何伟)文章快速阅读：活血祛瘀法干预激素性股骨头坏死的修复作用检测指标：(1)高分辨率MRI检查股骨头坏死表现(2)股骨头病理学组织检测(3)Western Blot检测兔股骨头ABCB1、RUNX2、OPN、RANK、RANKL、PPARg、骨保护素、血管内皮生长因子的蛋白表达水平50只新西兰兔随机分为3组模型组20只中药组(桃红四物汤组)20只正常组10只制备激素性股骨头坏死模型干预方法：中药组给予桃红四物汤混悬液灌胃；正常组和模型组灌服等体积超纯水陈雷雷，男，1982年生，山东省

3、滨州市人，汉族，2012年广州中医药大学毕业，博士，主治医师，主要从事股骨头坏死的基础与临床研究。通讯作者：何伟，主任医师，教授，博士生导师，广州中医药大学第一附属医院关节骨科，广东省广州市 510000中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)15-02148-08稿件接受：2016-03-07http:/WWW. 文题释义：激素性股骨头坏死：在国内外报道越来越多，是激素在广泛应用中近年被公认的并发症，其发病率目前已超过了创伤所致的股骨头坏死，机制尚不十分清楚，一般认为激素在体内长期蓄积造成血液黏稠度增加，血脂增高，脂肪栓塞，脂肪肝，造成骨的

4、微细血管阻塞，缺血，骨质合成减少，钙吸收障碍，骨质疏松及微细骨折的积累，最后导致激素性股骨头坏死。使用糖皮质激素如地塞米松最短有7 d导致股骨头坏死的，使用激素后发病时间不一，有使用激素后不到2个月就发生股骨头坏死的报道。活血化瘀：用具有消散作用的、或能攻逐体内瘀血的药物治疗中医诊断为瘀血病证的方法。摘要背景：激素性股骨头坏死的发病机制尚不明确，该病所伴随的塌陷破坏和重建性修复或与“骨形成-吸收”偶联失效所引起微观骨结构改变有关。活血祛瘀法经临床证实对该病有积极作用。但目前针对活血祛瘀法促进骨坏死修复的作用机制尚不清楚，相关国内外文献报道较少。目的：制备激素性股骨头坏死兔模型，探究活血祛瘀法对

5、激素性股骨头坏死修复的干预作用。方法：50只新西兰兔随机分为3组：正常组10只、模型组和中药组(桃红四物汤组)各20只，采用内毒素联合甲强龙的方法制备激素性股骨头坏死模型，最后一次肌肉注射甲强龙后24 h，中药组给予 0.3 g/kg桃红四物汤混悬液灌胃，正常组和模型组灌服等体积超纯水，连续8周。实验第8周分别进行高分辨率MRI检查和病理学组织检测以评估建模效果，采用Western Blot检测兔股骨头ABCB1、RUNX2、OPN、RANK、RANKL、PPAR、骨保护素、血管内皮生长因子的蛋白表达水平。结果和结论：经苏木精-伊红染色显示：模型组可见部分骨小梁断裂，骨细胞核固缩，骨小梁空骨陷

6、窝，骨髓细胞坏死，与正常组相比空骨陷窝率差异有显著性意义(P < 0.05)，中药组可见成骨活动仍较为活跃，骨小梁形态较好，说明活血祛瘀法可改善坏死区域组织修复。高分辨率MRI显示：模型组股骨头外形基本正常，股骨头内可见低信号带；中药组股骨头外形趋于正常，股骨头内近骨骺处有小块低密度区，大部分骨组织灰度值正常，提示活血祛瘀法可改善坏死区域影像学改变。Western Blot检测结果：模型组与正常组相比RUNX2、RANK、RANKL的蛋白表达升高，ABCB1、骨保护素、血管内皮生长因子蛋白表达下降；中药组与模型组相比，除RANK、RANKL表达下降外，其余均升高，差异3 P.O.Box

7、1200,Shenyang 110004 kf23385083有显著性意义(P < 0.05)。结果说明：活血祛瘀法促进兔激素性股骨头坏死的修复可能与调节ABCB1、RUNX2、RANK、RANKL、骨保护素、血管内皮生长因子蛋白的表达水平有关。关键词：Chen Lei-lei, M.D., Attending physician, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong

8、 Province, China; the National Key Discipline and the Orthopedic Laboratory of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, ChinaCorresponding author:He Wei, Doctoral supervisor, Professor, Chief physician, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital o

9、f Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; the National Key Discipline and the Orthopedic Laboratory of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China组织构建；骨组织工程；股骨头坏死；糖皮质激素；活血祛瘀；成骨-破骨；高分辨率MRI；Western blot；国家自然科学基金主题

10、词：股骨头坏死；糖皮质激素；组织工程基金资助：国家自然科学基金资助项目(81302990)；广东省杰出青年科学基金(2015A030306037)；广东省高等学校学科与专业建设专项资金项目(2013LYM 0010)“Removing Blood Stasis” Method for bone repair in steroid-induced osteonecrosis of the femoral headsChen Lei-lei1, 2, Chen Xiao-bo2, 3, Hong Guo-ju2, 3, Chen Da1, 2, Yang Peng2, 3, He Wei1, 2

11、(1Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; 2the National Key Discipline and the Orthopedic Laboratory of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; 3t

12、he First Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China)AbstractBACKGROUND: The pathogenesis of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head remains unclear. Femoral head reconstruction after collapse is related to the bone remodeling du

13、e to disorder of the bone formation-absorption coupling. “Removing Blood Stasis” Method has been shown to have a positive effect on the disease in clinics. However, the mechanisms by which the “Removing Blood Stasis” Method confers bone repair after osteonecrosis remain poorly understood.OBJECTIVE:

14、To explore the effect of “Removing Blood Stasis” Method on bone repair in rabbits with steroid-induced femoral head osteonecrosis.METHODS: Fifty New Zealand rabbits were randomly assigned into three groups: normal control (n=10), model (n=20) and Taohong Siwu Decoction (n=20) groups, respectively. T

15、he steroid-induced osteonecrosis of the femoral head animal models were established by intramuscular injection of endotoxin combined with methylprednisolone (MPS). Rabbits in Taohong Siwu Decoction group were intragastrically administered with 0.3 g/kg of Taohong Siwu Decoction suspension after the

16、last injection of methylprednisolone. The control and model groups were administrated by equal volume of ultrapure water for 8 consecutive weeks. High-resolution MRI and pathological determinations were used to assess the successful models. Protein expression levels of ABCB1, RUNX2, OPN, RANK, RANKL

17、, PPAR, osteoprotegerin (OPG), vascular endothelial growth factor (VEGF) in rabbit femoral heads were detected by western blot assay.RESULTS AND CONCLUSION: (1) Hematoxylin-eosin staining showed that trabecular bone fracture, karyopyknosis, empty lacunae, necrotic bone marrow cells were seen in the

18、model group. Empty lacunae rate in the model group was significantly different from that in the normal control group (P < 0.05). Bone formation was active and kept better trabecular morphology in the Taohong Siwu Decoction group. It suggested that “Removing Blood Stasis” Method can improve repair

19、 of necrotic area. (2) In the model group, femoral head with a wide range of low-density areas in high-resolution MRI; Taohong Siwu Decoction group showed the relatively normal shape of the femoral head with small areas of low density. It suggested that “Removing Blood Stasis” Method can improve ima

20、ge changes in the necrotic area. (3) Protein expression levels of RUNX2, RANK, RANKL were significantly up-regulated but protein expression levels of ABCB1, OPG, VEGF were significantly down-regulated in the model group compared with the normal control group; whereas, they were all significantly up-

21、regulated in the Taohong Siwu Decoction group compared with the model group, except for RANK and RANKL (P < 0.05). These results suggest that the “Removing Blood Stasis” Method can promote bone repair in steroid-induced femoral head osteonecrosis rabbits by regulating protein expressions of ABCB1

22、, RUNX2, RANK, RANKL, OPG, and VEGF.Subject headings: Femur Head Necrosis; Glucocorticoids; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81302990; Guangdong Funds for Distinguished Young Scholar, No. 2015A030306037; the Key Discipline Construction Project in Highe

23、r Education of Guangdong, No. 2013LYM 0010Cite this article: Chen LL, Chen XB, Hong GJ, Chen D, Yang P, He W. “Removing Blood Stasis”Method for bone repair in steroid-induced osteonecrosis of the femoral heads. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(15):2148-2155.2153ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CO

24、DEN: ZLKHAH0 引言 Introduction激素性股骨头坏死(steriod-induced osteonecrosis of femoral head，SIONFH)是好发于中青年人群的骨科难治疾病，也是股骨头坏死最常见类型。由于激素类药物在临床的广泛应用，并发激素性股骨头坏死的病例也日益增多1。激素性股骨头坏死虽不致威胁生命，但严重影响患者工作生活，造成沉重的社会和经济负担。激素性股骨头坏死发病机制目前尚未明确，或与基因组的表观遗传学的改变密切相关，包括基因多态性以及甲基化水平改变等2-3。激素性股骨头坏死发生塌陷的机制可能与破骨细胞和成骨细胞构成的“骨吸收-形成”偶联失效有关

25、。在病理组织上观察骨坏死组织，根据不同时期分别可表现为泡沫细胞生成、骨髓细胞坏死、骨髓纤维化等4。从微观分子层面观察，骨坏死的发生发展受成骨、破骨、脂化、血管化等多重机制相互作用而成，包括ABCB1、RUNX2、OPN、RANK、RANKL、PPAR、骨保护素、血管内皮生长因子等一系列关键因子或通路。从宏观上看，激素性股骨头坏死在大体标本上呈现除新生骨、硬化带外，病灶内死骨与活骨并存，部分股骨头坏死区存在小的囊变。在MRI上表现为，负重区软骨下出现局灶性信号改变，低信号带、双线征、水肿高信号区域及囊变低信号区。激素性股骨头坏死发生后并不立即出现明显的骨结构和力学性能改变，在修复过程启动后才出现

26、骨结构损害和力学性能降低。坏死骨组织表现为骨小梁数量减少、变薄、甚至发生断裂，骨小梁的连续性损坏和断裂则可致应力传导出现障碍，最终导致塌陷的发生5。因此，如何通过有效的措施延缓和改善头内坏死组织的破坏和塌陷，是目前激素性股骨头坏死非手术治疗的研究重点。已有较多临床实践和研究表明，中医药治疗股骨头坏死的疗效确切6，目前主要从“瘀”的病理因素认识其发病的机制。股骨头坏死症候虚实错杂，兼夹痰湿、肝肾亏虚，但脉络瘀阻起着关键作用，贯穿疾病始终。以桃红四物汤为代表方的活血祛瘀法广泛应用于股骨头坏死的临床治疗。 为了进一步研究活血祛瘀法对激素性股骨头坏死的干预作用及内在微观机制，作者建立新西兰兔激素性股骨

27、头坏死动物模型，采用高分辨率MRI观察骨头坏死区域影像学变化，通过组织病理学及Western blot等方法，观察活血祛瘀法对激素性股骨头坏死股骨头修复的生物学影响。实验目的包括：观察激素性股骨头坏死动物模型股骨头影像学与组织形态学变化，通过分子生物学方法研究活血祛瘀法促进激素性股骨头坏死修复的作用机制。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 随机对照动物实验。1.2 时间及地点 于2015年1至10月在广州中医药大学动物实验中心及重点学科中医骨伤科学实验室完成。1.3 材料 中药干预激素性股骨坏死实验用药物、试剂及仪器：药物、试剂及仪器来源Lipopolys

28、accharide,批号L2880 (from 055: B5)美国sigma公司注射用甲泼尼龙琥珀酸钠，批号Z07412美国辉瑞公司Protease Inhibitor Cocktail Set IIICalbiochem，539134吐温20(T104863)、氯化钾(P112133)、三(羟甲基)氨基甲烷(T110601)、冰乙酸(A116167)、氯化钠(C111547)、乙二胺四乙酸(E112487)、甘氨酸(A110752)、甲醇(M116115)、异丙醇(I112011)、甘油(G116208)、EGTA(E104434)、曲拉通X-100 (T109027)、氟化钠(S1115

29、91)、过硫酸铵(A112450)、十二烷基硫酸钠(S108346)上海阿拉丁生化科技股份有限公司Deoxychlate(D6750)Sigma公司，30%丙烯酰胺预混液(AS0500)Labtide公司ECL发光液(32106)Pierce公司，Immobilon-P PVDF膜(IPVH00010)Millipore公司转印滤纸(170-3931)、预染marker(1610374)BIO-RAD公司BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012)、HRP山羊抗小鼠IgG二抗(A0216)、HRP山羊抗兔IgG二抗(A0208)上海碧云天生物技术有限公司RUNX2(sc101145)抗体、OPN抗体

30、(sc73631)、PPAR抗体(sc7273)、骨保护素(sc8468)抗体Santa Cruz公司ABCB1(13978)、GAPDH(5174)，RANK(4845)抗体CST公司血管内皮生长因子(ab1316)抗体、RANKL(ab22113)Abcam公司Mini-PROTEAN Tera System、PowerPac Basic、ChemiDoc MP凝胶成像仪美国BIO-RAD公司ELix10+ Milliq-B超纯水系统美国Millipore公司Multiskan GO酶标仪美国Thermo ScientificTP1020自动脱水机、Autos全自动染色机德国Leica公司

31、BX53显微镜OLYMPUS公司3.0 T MRI 扫描仪GE health care公司实验动物：健康新西兰白兔50只，普通级，雌雄各半，24周龄，体质量3.0-3.5 kg，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证编号：44002100005081。广州中医药大学动物实验中心标准饲养，标准兔粮适应性饲养，自由饮水，室温(23±2) ，间隔12 h照明，定期消毒及通风。中药制备：桃红四物汤药物按医宗金鉴组成：桃仁10 g、红花5 g、生地12 g、当归12 g、赤芍10 g、川芎10 g，采用专用中药壶制备成混悬液，购自广州中医药大学第一附属医院。1.4 实验方法1.4.1 动物分组

32、 50只新西兰兔随机分为3组：正常组10只、模型组和中药组(桃红四物汤组)各20只。1.4.2 造模方法 激素性股骨头坏死的造模建立参照Qin等7的方法。模型组和中药组兔采用内毒素10 g/kg耳缘静脉注射1次，24 h后臀部肌肉注射甲强龙40 mg/kg，隔间24 h连续注射6次。正常组注射等体积生理盐水。注射激素期间，每天每只动物相应臀肌处注射青霉素10×104 U，连续6次，预防感染。1.4.3 各组干预方法 桃红四物汤药物按照人的临床等效剂量换算，兔的临床等效剂量为0.3 g/kg。最后一次注射甲强龙24 h后，中药组给予桃红四物汤混悬液灌胃，正常组和模型组灌服等体积超纯水，

33、连续8周。1.4.4 高分辨率MRI参数 由广州中医药大学第一附属医院影像科提供3.0T高分辨率磁共振影像仪。扫描序列包括轴位T2 WI、轴位T2WI压脂及冠状位T1WI序列。其中，轴位T2WI序列：TR/TE=4 100 ms/85 ms，层厚/层间距为2 mm/0.2 mm，FOV为180 mm×180 mm，矩阵为320×224。轴位T2WI压脂序列：TR/TE=367 ms/ 76.8 ms，层厚/层间距为2 mm/0.2 mm，FOV为170 mm× 170 mm，矩阵为320×224。冠状位T1WI序列：TR/TE= 4 134 ms/85

34、ms，层厚/层间距为2 mm/0.2 mm，FOV为180 mm×180 mm，矩阵为320×224。1.5 主要指标测定1.5.1 高分辨率磁共振检查 麻醉前禁食12 h，戊巴比妥30 mg/kg耳缘静脉注射进行麻醉，静脉注射必须缓慢，同时观察肌肉的紧张度、角膜反射和对皮肤疼痛的反应。麻醉中采取保温措施，保持气道通畅和组织的营养，进行双侧髋关节的MRI扫描。MRI扫描在广州中医药大学第一附属医院进行，生成的图像文件保存为DICOM格式，通过移动硬盘拷贝至计算机工作站。MRI检查完成后将新西兰兔运送回动物房，苏醒后常规饲养。1.5.2 苏木精-伊红染色收光镜观察 截取股骨头

35、，剔除周围肌肉及韧带组织，沿正中冠状面剖开，用体积分数10%中性甲醛溶液(pH 7.4)固定48 h，再置于10% EDTA-Tris缓冲液中脱钙，隔天更换脱钙液，直至完全脱钙以后，流水冲洗，逐级乙醇脱水，二甲苯透明处理2 h，石蜡包埋、切片，切片厚度为4 m，常规苏木精-伊红染色。光镜下观察骨髓腔内骨髓细胞、骨小梁及骨细胞形态及空骨陷窝等。1.5.3 Western Blot实验 样品制备：将研磨钵用液氮预冷，从液氮中取出股骨头，称重后迅速放入研磨钵中，研磨至粉末状，按50 mg骨组织/200 L RIPA裂解液制备样品。BCA法测量总蛋白浓度。SDS-PAGE：分别制备10%分离胶、5%浓

36、缩胶，待凝胶聚合后，小心拔出梳子，放入电泳槽内，注入电泳缓冲液。每组取30 g样品裂解液，与上样缓冲液按51充分混匀，置沸水浴中加热5 min，冷却后用微量移液器吸取样品与预染蛋白marker点样，80 V电压进行电泳。待预染蛋白marker前沿迁移出胶底板后，停止电泳，取出凝胶。转膜：PVDF膜预先在甲醇中浸泡5 min，在半干转膜槽上，夹子黑面朝下，从下至上依次放转膜缓冲液浸湿的滤纸、凝胶、PVDF膜和另一块浸湿的滤纸，形成“三明治”，保持整个装置内湿润，并避免产生气泡，350 mA转膜3 h。封闭：取出转膜后的PVDF膜置于盛有5%脱脂奶粉的封闭液的平皿中，置于摇床上室温封闭1 h。抗体

37、孵育：倾倒封闭液，加入一抗(ABCB1、血管内皮生长因子、RANK、骨保护素按11 000稀释，GAPDH按12 000稀释，RUNX2、OPN、PPAR按1500稀释，RANKL按1650稀释)，摇床上室温振荡孵育2 h或者4 孵育过夜。回收一抗，用TBST洗涤3-5次，每次10 min。加入相应HRP标记的二抗(11 000)，置摇床上室温振荡孵育2 h。TBST洗涤3-5次，每次10 min。化学发光、显影：将ECL发光显色试剂盒中的显色剂A和B等体积混合后，加在PVDF膜上充分接触反应2 min后，将PVDF膜移至另一保鲜袋中，去尽残液，包好，避免产生气泡，放入凝胶成像系统中进行成像分

38、析。先曝光3- 5 min，根据信号的强弱适当调整曝光时间，保存图像，分析结果，使用image-pro plus软件进行半定量分析。1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。计量资料结果以±s表示，先做方差齐性检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD法，计数资料的比较采用卡方检验，P < 0.05为差异有显著性意义。CBA图1 造模后不同组新西兰兔股骨头苏木精-伊红染色图像特点(×200)Figure 1 Hematoxylin-eosin staining of the rabbit femoral head after model

39、ing (×200)图注：图中A为正常组；B为模型组，可见部分骨小梁断裂，骨细胞核固缩，骨小梁空骨陷窝，骨髓细胞坏死；C为中药组，可见成骨活动较为活跃，骨小梁形态较好。CBA图2 激素型新西兰兔股骨头高分辨率MRI图像Figure 2 High-resolution MRI images of the femoral head of rabbits in each group图注：图中A为正常组；B为模型组；C为中药组。2 结果 Results 2.1 造模过程事件分析 新西兰兔50只，随机分为3组，40只新西兰兔用于建立激素性股骨头坏死模型，其有7只在注射内毒素后24 h死亡，33

40、只存活，存活率为82.5%。模型组有14只出现坏死征象，坏死发生率为82.4%(14/17)；中药组有5只出现坏死征象，坏死发生率为(5/16)31.3%。2.2 股骨头坏死模型评价 股骨头坏死造模成功的标准参照Ikemura等的评价方法8。模型组：骨小梁稀疏变细，结构紊乱，出现骨髓细胞碎片，骨小梁空骨陷窝或骨小梁内骨细胞核固缩，伴随着周围骨髓细胞的坏死，细胞数目及网状结构较正常稀疏，脂肪细胞体积增大，有的融合成泡状。正常组：骨小梁完整，排列规则，骨小梁中的骨细胞清晰可见，空骨陷窝少见，骨髓中造血细胞丰富，脂肪细胞相对较少，形态正常。模型组出现股骨头坏死的病理征象，可见部分骨小梁断裂，骨细胞核

41、固缩，骨小梁空骨陷窝，骨髓细胞坏死，见图1。中药组股骨头病理征象，可见成骨活动较为活跃，骨小梁形态较好。正常组空骨陷窝率为(8.96±1.43)%，模型组为(26.00±1.25)%，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。2.3 高分辨率磁共振扫描 人体股骨头坏死MRI表现为，负重区软骨下出现局灶性信号改变，低信号带、双线征、水肿高信号区域及囊变低信号区。家兔模型较人体为不典型，可依据其信号变化进行判断，见图2。MRI扫描显示，正常组股骨头外形为半圆形，灰度信号均匀；模型组股骨头外形基本正常，股骨头内可见低信号带，提示为股骨头坏死区；中药组股骨头外形正常，股骨

42、头内近骨骺处有小片状低信号区，大部分骨组织灰度值正常，提示股骨头坏死修复较好。2.4 激素性股骨头坏死相关蛋白检测 Western blot检测ABCB1、RUNX2、OPN、RANK、RANKL、PPAR、骨保护素、血管内皮生长因子的蛋白表达。与正常组相比，模型组ABCB1的蛋白表达明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，而中药组相对于模型组的ABCB1蛋白表达升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，说明在股骨头坏死时ABCB1蛋白功能降低，而活血祛瘀中药可促进ABCB1的蛋白表达。与正常组相比，模型组RANK、RANKL、RUNX2蛋白均升高，骨保护素蛋白降低，差异

43、有显著性意义(P < 0.05)，说明发生股骨头坏死时，机体成骨细胞受激活分化增加而破骨细胞活跃；而中药组相比模型组，RUNX2、骨保护素升高而RANK、RANKL表达降低(P < 0.05)，说明活血祛瘀中药可有效激活RANK/RANKL/骨保护素通路，调控成骨细胞内骨钙素的表达，从而进一步促进成骨细胞分化与活性，抑制破骨细胞的功能活动。相对于正常组，模型组内血管内皮生长因子的蛋白表达降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，说明股骨头坏死抑制血管内皮细胞的生长及血管生成。相对于模型组，中药组血管内皮生长因子的蛋白升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，说明活血

44、祛瘀中bBARUNX2蛋白相对表达ABCB1蛋白相对表达0.20正常组 模型组 中药组01.51.00.50baa正常组 模型组 中药组RUNX2(55 000)GAPDH(37 000)ABCB1(141 000)GAPDH(37 000)aCDbRANK蛋白相对表达OPN蛋白相对表达正常组 模型组 中药组正常组 模型组 中药组RANK(42 000)GAPDH(37 000)OPN(25 000-55 000)GAPDH(37 000)FE骨保护素蛋白相对表达正常组 模型组 中药组ab0.200.4

45、00.20ab0abPPAR蛋白相对表达正常组 模型组 中药组RANKL蛋白相对表达正常组 模型组 中药组PPAR(53 000)GAPDH(37 000)RANKL(95 000)GAPDH(37 000)血管内皮生长因子蛋白相对表达GH正常组 模型组 中药组VEGF(26 000)GAPDH(37 000)OPG(45 000)GAPDH(37 000)图3 各组兔股骨头ABCB1、RUNX2、OPN、RANK、RANKL、PPAR、骨保护素、血管内皮生长因子蛋白的达水平 Figure 3 Protein expression leve

46、ls of ABCB1, RUNX2, OPN, RANK, RANKL, PPAR, osteoprotegerin, and vascular endothelial growth factor in the femoral head of rabbits in each group图注：图A为ABCB1蛋白表达；B为RUNX2蛋白表达；C为OPN蛋白表达；D为RANK蛋白表达；E为RANKL蛋白表达；F为PPAR蛋白表达；G为骨保护素蛋白表达；H为血管内皮生长因子蛋白表达。与正常组比较，aP < 0.05；与模型组比较，bP < 0.05。药可通过升高血管内皮生长因子蛋白表达

47、以促进坏死骨组织内血管化修复。各组间PPAR和OPN的蛋白表达水平，差异无显著性意义。见图3，表1。表1 各组兔股骨头ABCB1、RUNX2、OPN、RANK、RANKL、PPAR、骨保护素、血管内皮生长因子蛋白的表达水平(±s)Table 1 Protein expression levels of ABCB1, RUNX2, OPN, RANK, RANKL, PPAR, osteoprotegerin, and vascular endothelial growth factor in the femoral head of rabbits in each group指标正常组

48、模型组中药组ABCB10.923±0.0080.149±0.003a1.088±0.028bRUNX20.011±0.0010.023±0.003a0.400±0.010bOPN0.152±0.0020.159±0.0050.335±0.007RANK0.483±0.0310.733±0.028a0.643±0.011bRANKL0.328±0.0270.598±0.013a0.412±0.022bPPARg0.335±0.0070.3

49、25±0.0070.295±0.044骨保护素0.652±0.0270.403±0.010a0.425±0.008b血管内皮生长因子0.486±0.0090.293±0.007a0.336±0.027b表注：与正常组比较，aP < 0.05；与模型组比较，bP < 0.05。3 讨论 Discussion激素性股骨头坏死发病机制复杂，目前尚未完全明确。在发病过程中，除了骨吸收-形成偶联失效引起的骨质破坏以外，糖皮质激素可使骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化能力增强，而向成骨细胞的分化降低。激

50、素性股骨头坏死的骨组织内会出现骨细胞、造血细胞及骨基质降解等表现，继而发生坏死区周围的修复反应9。长期以来，激素性股骨头坏死缺乏针对病因的特效药物，而中医药在实验与临床研究中已显示具有良好的前景10。激素性股骨头坏死在中医学中属于“骨蚀”、“骨痹”的范畴，主要从“瘀”的病理因素认识其发病的原因和机制11-12。桃红四物汤作为活血祛瘀法的经典方，临床上治疗骨伤科“瘀证”取得了良好效果。文献研究认为活血祛瘀法是治疗激素性股骨头坏死的基本法则13。实验研究采用桃红四物汤含药血清干预坏死骨微粒刺激的巨噬细胞发现，含药血清能增高转化生长因子1的表达，抑制肿瘤坏死因子 的表达，进而促进激素性股骨头坏死骨修

51、复14-15。然而活血祛瘀法通过何种方式影响糖皮质激素对成骨-破骨反应作用则尚不明确。因此，需要深入研究该法在激素性股骨头坏死的生物学作用，以进一步阐明其促进激素性股骨头坏死修复的作用机制。随着激素性股骨头坏死发病机制的深入研究，目前可探知在激素性股骨头坏死坏死中起关键性作用的若干基因或蛋白。其中包括ABCB1是编码糖蛋白的多药耐药物质，其反映了激素抵抗的主要基因，主要作用机制是介入到P糖蛋白对于药物基质的细胞内外运输。研究表明，基因多态性可能导致了激素在细胞内外分布，从而调控激素性股骨头坏死的发生16。RANKL由成骨细胞、骨髓间充质干细胞和T、B淋巴细胞分泌，RANKL与破骨细胞表面的RA

52、NK受体结合，通过接头蛋白使TRAF-6 途径引起核因子B的激活，进一步促进破骨细胞的生长和增殖，破骨细胞的过度增殖引发过度溶骨和骨吸收17。骨保护素是由成骨细胞系的各种细胞合成的骨保护蛋白，它的表达与细胞分化呈正相关。RANK/RANKL/骨保护素通路在股骨头坏死中发挥抑制破骨细胞形成分化、活化并诱导破骨细胞凋亡的功能18。Runt相关转录因子2(RunX2)控制着成骨细胞特异蛋白骨钙素的表达，是成骨细胞分化及行使功能的中枢调控，而且研究表明激素可抑制Runx2的表达和活性19-20。血管内皮生长因子在体内外均可特异性的促进血管内皮细胞的生长并诱导血管生成，具有强大的促内皮细胞增殖、促血管生

53、成作用，对坏死区内成骨及骨修复过程中的血管长入发挥重要作用21。实验基于上述生物机制认为，活血祛瘀法可能通过某种途经直接或间接地影响了ABCB1、RUNX2、RANK、RANKL、骨保护素、血管内皮生长因子等相关因子的表达，调控成骨细胞、破骨细胞的分化及功能来完成坏死骨组织的修复。实验发现活血祛瘀法可降低新西兰兔激素性股骨头坏死的发生率，促进股骨头坏死的修复。与正常组相比，模型组中RUNX2、RANK、RANKL的蛋白表达上调，ABCB1、骨保护素、血管内皮生长因子蛋白表达下调；而与模型组相比，中药组除RANK、RANKL表达下调外，其余均上调。说明活血祛瘀法促进新坏死修复机制可能与抑制RAN

54、K、RANKL的表达，促进ABCB1、骨保护素、血管内皮生长因子、RUNX2表达有关。作者贡献：设计、评估者为第一作者和通讯作者，实施为全体作者。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：实验动物在戊巴妥纳麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：本刊实行双盲外审制度，文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。作者声明：文章第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。

55、文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Wang XS,Zhuang QY,Weng XS,et al.Etiological and clinical analysis of osteonecrosis of the femoral head in Chinese patients.Chin Med J (Engl).2013; 126(2): 290-295.2 Gong LL,Fang LH, Wang HY, et al. Genetic risk factors for glucocorticoid-induced oste

56、onecrosis: a meta-analysis. Steroids.2013;78(4):401-408.3 Sun Z,Yang S,Ye S,et al.Aberrant CpG islands' hypermethylation of ABCB1 in mesenchymal stem cells of patients with steroid-associated osteonecrosis. J Rheumatol.2013;40(11):1913-1920.4 Chernetsky S,Mont M,Laporte D,et al.Pathologic features in steroid and nonsteroid associa