产enterocin E5细菌素粪肠球菌发酵条件的优化

1、基金项目：北京市农委课题，北京市教委课题，2011年度科技面上项目作者简介：崔德凤，女，1963年生，高级实验师，研究方向为动物微生物学与免疫学，E-mail:*通讯作者：张永红产enterocin E5细菌素粪肠球菌发酵条件的优化崔德凤1，周波1，杨桂梅1，李焕荣1，阮文科1汪明2张永红1 *(1.北京农学院 动物科技学院, 北京昌平102206；2.中国农业大学动物医学院, 北京100193)摘要：目的对产enterocin E5细菌素粪肠球菌的发酵条件进行研究。方法采用琼脂扩散法测定发酵上清液对大肠埃希菌K88的抑菌活性。结果确定粪肠球菌E5产细菌素的发酵条件为MRS培养基，最适温度为3

2、7，最适起始pH值6.5，最佳接种量2%,种龄14 h，发酵时间16h,最佳培养基组分氮源为1%胰蛋白胨、0.5%酵母浸粉，最佳碳源为1%葡萄糖、0.5%蔗糖, 0.1% Tween-80有利于enterocin E5的产生。这是分离自北京优良商品猪黑六产enterocin E5粪肠球菌的首次报道。关键词enterocin E5；粪肠球菌；发酵条件；抗菌活性Study on the optimum enterocin E5 production condition of Enterococcus faecalisE5CUI Defeng1 ,Zhou bo YANG Guimei1 , LI

3、Huanrong1 ,RUAN Wenke1 ,WANG Ming2 , ZHANG Yonghong1*( 1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China ; 2.College of Veterinary Medicine , China Agricultural University , Beijing 100193 , China)AbstractObjectiveTo investigate the fermen

4、tation conditions for growth and antibacterial substance production by Enterococcus faecalis E5.MethodThe antibacterial activity of the supernatant against Escherichia coli K88 was tested with agar well diffusion. ResultsThe optimum fermentation conditions for E5 to produce enterocin E5 included the

5、 following: tryptone 1%, yeast extract 0.5%, glucose1%,sucrose 0.5%, and Tween-80 0. 1%.This formula of modified MRS could stimulate the generation of enterocin E5.The optimum initial pH was 6.5,while the best temperature was 37,with the inoculation amount of 2% (v/v), the seed age of 14 h,and the f

6、ermentation period of 16 h. This is the first report on enterocin E5 produced by Enterococcus faecalisE5 isolated from Beijing black six swine.Key words enterocin E5; Enterococcus faecalis;Fermentation conditions; antibacterial activity 乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一类能够发酵糖产生大量乳酸细菌的统称，肠球菌（enterococci）是乳

7、酸菌中对营养要求不高、容易培养、分布广泛的一类革兰氏阳性球菌。长期以来在乳制品加工、蔬菜及肉制品的发酵工艺中广泛应用。肠球菌在生长繁殖过程中除产生乳酸、乙酸等有机酸外还能产生多种具有抑菌或杀菌活性的细菌素，在抑制多种动物源病原微生物和食物腐败菌等方面具有重要作用。 (Abriouel, Ben Omar 等， 2006)从食品中分离出产生enterocin P细菌素的肠球菌并对其特性进行了深入的研究3。分离自牛粪堆肥中的肠球菌显示出对食物源病原微生物和腐败菌的抑制活性2。(Siragusa, 1992)从牛的胃肠道分离的希氏肠球菌对李斯特菌属具有明显的抑菌活性23。还有分离自扁角鹿、鸡肠道、鸵

8、鸟肠道、小型猪粪便等动物源和分离自青贮饲料、乳酪发酵剂、西班牙发酵橄榄，意大利腊肠等食物源肠球菌细菌素的报道4, 8,10,14,15,18, 25,26。细菌素的合成受到很多因素的影响，其中包括培养基的成分、培养基初始pH值、培养温度、收获时间、保存条件等等21。实验证明来源于鹌鹑盲肠的肠球菌产细菌素活性最强的培养基是ZAL13。研究发现pH和葡萄糖对Enterococcus faecium P13产生enterocin P的影响，细菌生长和葡萄糖消耗在pH7.0时达到最大值，细菌素的活性呈pH依赖性，pH恒定调节为6.0时，获得最大抑菌活性9。从细菌素应用的经济学角度出发，研究细菌素产生菌

9、发酵动力学，细菌素与产生菌的作用方式，影响细菌素产量的因素等具有极其重要作用。产生enterocin E5细菌素的肠球菌从北京健康商品猪黑六胃肠道分离鉴定，具有广谱的抑菌活性，编码enterocins A结构基因。本研究拟对影响enterocin E5生产条件，如培养基组成、pH值、培养温度等进行全面研究。1材料1.1菌株粪肠球菌E5：由微生物实验室分离筛选的产细菌素菌株；指示菌：大肠杆菌K88由微生物实验室保存1.2 培养基MRS培养基：胰蛋白胨10g酵母浸粉5g葡萄糖10g蔗糖5g醋酸钠15g枸橼酸铵2gKH2PO4 6g MgSO4.7 H20 0.58g，MnSO4.4H20 0.25

10、g，FeSO4.7 H20 0.03g，吐温-80 1g蒸馏水1 L pH7.0-7.4。PYG培养基：大豆蛋白胨 0.5g酵母浸粉0.5gKH2PO4 0.1g葡萄糖 0.1g MgSO4.7 H20 0.02g MnSO4.4 H20 0.002g蒸馏水0.1 L pH6.5。2方法2.1粪肠球菌E5生长曲线与抑菌活性的测定将培养12h粪肠球菌E5种子液以1的接种量接种于250 ml MRS培养基中，37 培养48h，每隔2小时取发酵培养液以未接种的培养液作为空白对照，细菌密度的测定， 采用UN1C0 UV-2000型分光光度计测OD600，pH值采用EUTECH pH510型酸度计测定。

11、同时410000 rmin离心10min，取上清采用琼脂扩散法测定其抑菌圈直径(mm)，指示菌为大肠杆菌K88。2.2培养基及其组份对enterocin E5产生的影响接种粪肠球菌E5种子液于TSB，SM，MRS和APT四种发酵培养基中37静止培养24h，测定发酵液的OD600值、pH值及抑菌效价；以有机氮和无机氮（蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨，柠檬酸铵、硝酸钠代替确定培养基中的氮源成分，以蔗糖、乳糖、阿拉伯糖等常用碳源对确定培养基中的葡萄糖进行等量替换，检测发酵液的OD600值、pH值及抑菌效价；在培养基中添加0.1-1%Tween-80，以1% ( v /v) 种子液进行接种，37需氧培养

12、24h测定菌体密度OD600和发酵上清液的抑菌效果，确定Tween-80的用量。 2.3培养基起始 pH值的确定 用1mol/L的HCI或1mol/L的NaOH调节MRS培养基的pH值至4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0接种肠球菌E5 37培养48 h ，测定菌体生长密度OD600与细菌素抑菌活力。 2.4最适培养温度、培养方式的确定将接种粪肠球菌E5的MRS培养基分别在20、25、30、37和42培养 24h，以最适培养温度选择振荡和静止的方式培养24h，测定细菌生长密度OD600和抑菌效果。2.5接种细菌种龄、接种量的确定分别将不同种龄(6、8、

13、10、12、14、16、18、20、22、24h)的粪肠球菌E5种子液按1%的接种量接入MRS培养基中37培养48 h ，测定菌体密度OD600与抑菌效果。取最适种龄粪肠球菌E5菌液以1.0%-10%接种量进行接种，37培养24h，测定菌体密度OD600和上清液的抑菌效果。3 结果与分析3.1粪肠球菌E5生长曲线与抑菌活性的测定粪肠球菌E5在培养2h、3h即进入对数生长期，细菌浓度呈指数式的增长，16-18h左右进入稳定期，细菌浓度增长速度缓慢，发酵2h后pH值显著下降，发酵22h后pH值趋于稳定，从整个发酵过程可以看出菌株产酸能力较强，最终pH值为4.5左右。粪肠球菌E5的抑菌活性曲线与细菌

14、生长动力学走势基本相似。细菌培养2h可以检测到enterocin E5细菌素，抑菌活性随培养时间的变化情况类似于菌浓度OD600值的变化，在对数生长期细菌素开始产生，18h进入稳定期后细菌素产量缓慢增加，未观察到细菌素产量的减少趋势。通常认为细菌素的产生与生长相关联，有的细菌素在细胞开始生长时即可产生，而有的细菌素则在对数生长后期或稳定期产生，在生长到一定时间后抑菌活性降低，可能是由于细菌素吸附到产生菌细胞表面导致发酵液中细菌素活性的下降，也可能是细菌素发生降解而失活20。图1.不同时间下菌体密度与enterocin E5抑菌效果Fig. l Cell growth and enterocin

15、 E5 activity at different culture time 图1.不同时间下菌体密度与enterocin E5抑菌效果Fig. l Cell growth and enterocin E5 activity at different culture time3.2 细菌素高产培养基营养成分的优化粪肠球菌E5在TSB，SM，MRS和APT四种培养基上均能够生长，APT最有利于肠球菌株的菌体生长，SM 产生的菌体浓度最低，细菌素抑菌活性最小，MRS细菌素产量最大，其次依次为TSB、APT和SM，因此选取MRS作为粪肠球菌E5生产细菌素用培养基。3.2.1碳源对细菌素产量的影响碳源

16、：分别采用乳糖、木糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖取代MRS中的葡萄糖成分，以1%（m/v）的比例添加。以1%接种量接种种子液、起始pH 6.5、37培养48 h，测定菌体生长与抑菌圈直径，结果见表1。可以看出除木糖细菌浓度较低外（因粪肠球菌E5不发酵木糖），其他几种糖均能促进细菌生长及细菌素的产生，培养液pH变化明显，呈弱酸性，葡萄糖和蔗糖对细菌素的形成作用最明显。表1 碳源成分对enterocin E5产量的影响Table1 Effects of carbon source on the production of enterocin E5碳源成分OD600抑菌圈直径/cmpH葡萄糖1.91

17、1.894.5乳糖1.861.514.6蔗糖1.871.864.5甘露糖1.771.355.1麦芽糖1.741.464.6木糖1.131.026.5果糖1.691.325.03.2.2 氮源对细菌素产量的影响分别用大豆蛋白胨、蛋白胨、柠檬酸铵和硝酸钠替代MRS中的胰蛋白胨，按1%（m/v）的比例添加。以1%接种量接种种子液、起始pH 6.5、37培养48 h，测定菌体生长与抑菌圈直径，结果见表2。可以看出，胰蛋白胨最有利于细菌的生长及细菌素的产生，添加蛋白胨、大豆蛋白胨细菌素产量较低；无机氮源不能满足细菌细胞生长需要与细菌素的生成，培养液pH值基本无变化。有机氮源的种类对细菌素的产生有较大影响

18、，不同来源的菌株对氮源的需要有所不同，细菌素产量也尽相同。表2 氮源成分对enterocin E5产量的影响Table2 Effects of nitrogen source on the production of enterocin E5氮源成分OD600抑菌圈直径/cmpH胰蛋白胨1.921.774.5蛋白胨1.781.454.6大豆蛋白胨1.651.324.6硝酸钠0.070.006.2柠檬酸铵0.490.006.03.2.3 Tween-80添加量对细菌素产量的影响 Tween-80是一种表面活性剂，可以促进细菌素的产生和抑菌活性的增强。实验表明：当Tween-80的添加量为1%时，

19、抑菌圈直径为1.8cm，比不添加Tween-80的对照组（抑菌圈直径1.62 cm)抑菌活性提高了10%。3.3 培养基初始pH值对细菌素产量的影响结果如图1-2所示，培养基初始pH值对细菌素产量有较大影响，在初始pH 6.5时细菌素产量最大偏酸或偏碱都不利于细菌素的产生。细胞生长变化较小，在pH6.5时OD600达到最大值这也说明细菌素的产生与细胞生长呈正相关。图2初始pH值对细菌素产生的影晌Fig 2 Effect of initial medium pH on the production of enterocin E53.4 不同培养温度对细菌素产量的影响分别将接种粪肠球菌E5的MRS

20、培养基置于不同的温度 (20、25、30、37和42)培养24h ，测定菌体生长密度与抑菌圈直径如表3所示。细菌最低生长温度为20，最高生长温度42，随着温度的升高，细菌密度不断增加在37达到最大值，细菌生长最好，获得最大细菌素活性单位。高于37，细菌生长密度明显降低，这与资料报道的某些细菌素在低于最适培养温度条件下有较高细菌素产量的结论不一致，说明细菌素的产生是一种复杂生理代谢过程，与多种因素有关。粪肠球菌E5在振荡和静止情况下都能生长，2种培养方式的菌体密度和抑菌效果差异不显著。表3 培养温度对enterocin E5产量的影响Table3. Effect of culture tempe

21、rature on the production of enterocin E5培养温度菌体密度OD600抑菌圈直径pH251.651.625.6301.711.565.2371.891.764.5421.681.555.13.5接种种龄、接种量对细菌素产量的影响不同种龄对菌体密度和细菌素抑菌效果的影响，结果显示种齢10-14 h之间细菌素产量基本一致，种龄14 h菌体密度最高抑菌效果最明显，16 h后菌体密度和发酵上清液的抑菌效果有降低的趋势，图略。最佳接种量的确定，随着接种量的改变细菌素的抑菌效果变化很大，接种量2%-10%时菌体密度基本没有太大变化，0.5%接种量细菌生长较慢，接种量2%

22、时抑菌效果最好可能2%接种量有利于细菌的快速生长和细菌素的分泌和积累，图略。4 讨论细菌产细菌素一方面由内在的遗传特性所决定，另一方面还会受到生长环境条件的限制，如营养(包括碳源和氮源)17、温度、初始pH、生长刺激因子、培养方式以及其它代谢物都会影响细菌素的产量与活性。本实验采用几种常用乳酸菌培养基检测细菌素活性，发现APT最有利于粪肠球菌E5株菌体的生长，但是MRS最适合细菌素的产生与积累，因此选取MRS为粪肠球菌E5细菌素生产用培养基。乳酸菌在细菌生长的过程中产生细菌素，培养条件刺激细菌细胞生长和细菌素的合成 6,16然而提高生长率和细菌菌体浓度对获得满意的细菌素水平并不是必需的，环境条

23、件完全可以影响特定细菌素的产生。即使细菌素产生菌生长很好，每个细胞合成多少细菌素，怎样产生的都不能确定。在这种情况下，培养基的成分、最适pH、培养温度等条件尤为重要。 为了探讨细菌主要营养素碳源和氮源对菌体生长，菌株产细菌素能力的影响，按MRS培养基的碳源比例分别用蔗糖、乳糖、麦芽糖等常用碳源对原培养基中的葡萄糖作了等量替换，实验证明粪肠球菌E5菌株的最适碳源为葡萄糖和蔗糖。此结果与大多数的细菌素产生菌的碳源需求相似，可能是因为乳酸菌具有一个磷酸转移酶系统，承担细胞内葡萄糖和蔗糖的运转与伴随的磷酸化代谢途径。实验分别以15g的有机氮源和无机氮源代替MRS培养基中的胰蛋白胨和酵母浸粉总量，结果表

24、明胰蛋白胨和酵母浸粉最有利于细菌素的生成。研究表明胰蛋白胨和酵母浸浸粉对乳酸乳球菌产生nisin有很大影响，两种成分都能增加nisin 的产量，然而高浓度的胰蛋白胨会使nisin产量减少5。发现增加培养基中有机氮源的含量可以使微球菌GO5产生的micrococcin GO5的产量有很大提高，培养起始pH为7.0-9.0，最适温度为37，在MRS组成中，乳糖和蔗糖更利于micrococcin GO5产12。有机氮源的种类对细菌素的产量也有影响，这可能与细菌素合成机制有关，某些氮源物质成分诱导了细菌素基因的启动24。Tween-80是一种表面活性剂，作为一种乳化剂，能够降低细菌与玻璃器材之间的表面

25、张力，改善细菌素产生菌细胞膜的通透性，促进细菌素的形成和活力的增强,但Tween-80过量，会影响硫酸铵反应形成沉淀，使纯化难度加大21。本实验比较了添加Tween-80对细菌素产生的影响，确定1%的Tween-80有利于细菌素的形成。各种细菌素产生的最适温度各不相同，这与细菌的种类与不同的来源有关。乳酸链球菌产生Nisin的最适温度为305,而扩展短杆菌ATCC9175在25时类细菌素的产量最高，37细菌素产量不明显19 。乳酸菌CCUG 42687合成Sakacin P最适温度为20，在25-30细胞浓度低时，Sakacin P停止形成，培养温度20时Sakacin P的产量是30时的7倍

26、，葡萄糖耗尽时，Sakacin P浓度非常低，酵母粉浓度增加，细菌细胞增长率增加，伴随Sakacin P 产量增加，胰蛋白胨的浓度对Sakacin P也有正向影响1。而肠球菌RZS C5产细菌素的温度必须控制在35 。本实验中的粪肠球菌E5产enterocin E5细菌素的最适温度为37，振荡培养与静止培养对细菌素的产生影响差异不显著。粪肠球菌E5在细菌生长稳定期后获得最大抑菌活性细菌素，与大多数细菌素产生动力学相似。乳酸菌产生细菌素受许多因素制约，培养基起始pH值是影响细菌素合成的重要因素之一。(Egorov, Baranova 等， 1976)研究了培养基起始pH值4.0-6.6对乳链球菌

27、生长和nicin生物合成的影响，表明pH值4.0-4.5细菌生长较差，pH值4.0没有观察到nicin生物合成，培养基最适pH值为4.5-6.6。细菌素Nisin，在pH值偏酸性时，抑菌活性强；在pH值偏中性时，抑菌效果显著下降7。不同的细菌素适用的pH范围不同，大多数在酸性环境下稳定，作用效果也较好。但很多细菌素在中性或碱性条件下，抑菌活性减弱或丧失，如PediocniAcH、PediocinA、PediocinPA1、Uctaein、Lactaein27、Acidolin、Nisin和Diplococcin具有相似的特征，此现象可能是由于细菌素分子在碱性条件下降解造成的。本实验中培养基在初

28、始pH 6.5时细菌素产量最大，偏酸或偏碱都不利于细菌素的产生。这一结果与细菌素的pH值生物学耐受性的特性相符22 。5 结论本文首次报道从北京优良地方品种黑六猪胃肠道分离产enterocin E5粪肠球菌，并确定了最适培养条件为MRS培养基，起始pH值6.5、培养温度37，接种量2%、种龄14 h，发酵时间16h，最佳培养基组分氮源为1%胰蛋白胨、0.5%酵母浸粉，最佳碳源为1%葡萄糖、0.5%蔗糖, 0.1% Tween-80有利于enterocin E5的产生。为enterocin E5作为抗菌制剂的研制奠定了理论基础。参考文献1. Aasen, I. M., T. Moretro, e

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