超声-酶-碱法提取啤酒废酵母-葡聚糖的研究

1、超声-酶-碱法提取啤酒废酵母 -1,3-葡聚糖的研究摘 要： 采用超声-酶-碱法从啤酒废酵母中提取 -1,3-葡聚糖，在超声波预处理和酶解最佳条件的同时，利用响应曲面法研究分析 NaOH 浓度、温度、用量和时间对 -1,3-葡聚糖得率、纯度和蛋白质含量的影响。试验结果表明，超声波处理后破壁率为 94.22 %；酶解后蛋白质去除率为 62.82 %；当加入 2.05 %的 NaOH 30.50 mL，74 处理5.7 h，-1,3-葡聚糖的得率为 10.21 %，纯度为 88.14 %，蛋白质含量为 1.19 %。超声-酶-碱法处理工艺具有 -1,3-葡聚糖得率、纯度高、蛋白质含量低及提取时间短

2、的特点。关键词： 综合利用； 超声-酶-碱法； 啤酒废酵母； -1,3-葡聚糖； 响应曲面法Resarch on the Extraction of -1,3-glucan from WasteBeer Barm by Ultrasonic-enzyme-alkali MethodAbstract: -1,3-glucan was extracted from waste beer barm by ultrasonic-enzyme-alkali method. In addition to the research on the optimumconditions of ultrasound

3、 pretreatment and zymolysis, the effects of NaOH concentration, temperature, use level and reaction time on the yield,the purity and protein content of -1,3-glucan were studied by response surface method. The results showed that the broken rate of barm cells byultrasound was 94.22 %, the removal rat

4、e of protein after zymolysis was 62.82 %, when 30.50 mL 2.05 % NaOH was added for 5.7 h treatmentat 74 , the yield of -1,3-glucan was 10.21 %, the purity was 88.14 % and protein content was 1.19 %. The ultrasonic-enzyme-alkali methodhad the advantages including high -1,3-glucan yield and high purity

5、, low protein content as well as short extracition time.Key words: comprehensive utilization; ultrasonic-enzyme-alkali method; waste beer barm; -1,3-glucan; response surface method酵母 -1,3-葡聚糖是一种良好的生物效应调节剂BRMS， 在增强机体抗辐射和促进伤口愈合等方面有显著作用1。 酵母 -1,3-葡聚糖除因不溶性使其在抗肿瘤等临床应用上受到限制外，抗氧化、保湿、无刺激和免疫调节等特点，使其在食品、化妆品和医

6、学方面有广泛应用23。 据统计，2007 年中国啤酒产量为 3931.4 万 t，产生废酵母约 58.97 万 t（干重），而 -1,3-葡聚糖含量达到酵母细胞壁的 29 %，开发潜力巨大。 目前，提取 -1,3-葡聚糖的方法主要有酸-碱法、酶-碱法和自溶-酶-碱法45。 其中，酸-碱法对环境污染严重，酶-碱法试剂用量较大，而自溶-酶-碱法虽能得到得率和纯度较高的-1,3-葡聚糖，但提取时间过长。本文主要研究的是超声-酶-碱法提取啤酒废酵母-1,3-葡聚糖工艺，即在常规的酶-碱法之前，对酵母进行了超声波预处理，使细胞壁松散、破碎，增大溶剂作用面积，以缩短提取时间和提高提取率。 首先对超声波破壁

7、和酶解除蛋白效果进行研究，再采用响应曲面法优化碱溶条件（NaOH 浓度、温度、用量和时间），建立碱溶与-1,3-葡聚糖之间的数学模型，以期获得最优的工艺参数，为啤酒废酵母综合利用提供理论数据。1 材料与方法1.1 材料与仪器实验材料：新鲜啤酒废酵母（广西南宁青岛啤酒有限公司提供）；木瓜蛋白酶（食品级）；NaOH、无水乙醇等（分析纯）。实验仪器：丹麦 FOSS 自动定氮仪；美国贝克曼超速离心机；日本岛津 UV-2051PC 紫外可见分光光度计；96真空冷冻干燥机。1.2 提取 -1,3-葡聚糖工艺流程啤酒废酵母预处理超声波处理酶解碱溶醇洗、水洗真空冷冻干燥-1,3-葡聚糖1.3 工艺要点1.3.

8、1 预处理新鲜啤酒废酵母置于 0 冷水中絮凝， 回收啤酒（上清液）后过 200 目标准筛，制得水分含量为 20 %25 %的净酵母，40 烘箱鼓风干燥后磨粉，待用。1.3.2 超声波处理取干酵母 5 g，加入 15 mL 水，在功率为 140 W、频率为 42 kHz 的条件下，处理 1080 min，再加入同体积的无水乙醇于 70 恒温提取， 离心后测定上清液海藻糖和蛋白质含量。1.3.3 酶解取破壁后的酵母残渣 5 g，先加入 50 mL 水，再添加208 u/g 底物的木瓜蛋白酶，于 50 、pH6.0 条件下酶解8 h，离心后测定沉淀蛋白质含量。1.4 碱溶响应曲面优化试验采用 Box

9、-Behnken 设计，选取 NaOH 浓度（x1）、温度（x2）、用量（x3）和时间（x4）4 个因素为自变量，以 -葡聚糖的纯度（Y1）、 蛋白质含量 （Y2） 和得率 （Y3） 为响应值。按照方程 xi=（Xi-Xo）/X 对自变量进行编码。 式中，xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，X0为试验中心点处自变量的真实值，X 为变量的变化步长。 试验因素的水平编码见表 1。设该模型通过最小二乘法拟合的二次多项方程为：Y=+4i = 1iXi+4i=1,jiXiXj+4i = 1iiX2ij其中： 为常数项，i为线性系数，ij为交叉项系数，ii为二次项系数。1.5 分析方法用 FOSS

10、 自动定氮仪测定蛋白质含量， 蒽酮-硫酸法测定多糖含量6。得率 =成品质量原料质量×100 %纯度 =多糖质量成品质量×100 %2 结果与分析2.1 超声波处理超声波主要通过空化效应， 使液体中产生空化泡，空化泡长到一定程度或强烈震荡将发生崩溃，会在局部小区域内产生高温高压， 形成微射流及高速剪切力，使细胞壁破裂，内容物泻出。 海藻糖和蛋白质作为细胞内主要内容物，能用来评价超声波破壁的效果。 试验结果见图 1。由图 1 可知，海藻糖提取率和蛋白质含量随着超声辅助提取时间的加长而迅速上升， 到 60 min 后达到稳定， 海藻糖最大提取率和蛋白质含量分别达到 94.22 %

11、和 5.27 %，说明超声波处理达到了破壁的目的。2.2 酶解试验蛋白酶能够去除酵母残渣中大量的蛋白质，为后续提纯分离 -1,3-葡聚糖奠定基础；同时，可以回收营养丰富的氨基酸、多肽蛋白液，提高酵母综合利用水平。 研究表明，取破壁后的酵母残渣 5 g，加入 50 mL 水，添加208 u/g 底物的木瓜蛋白酶，在 50 、pH6.0 条件下酶解8 h，蛋白质去除率达到最大值 62.82 %，且回收到 0.348g/L 的蛋白液。2.3 碱溶响应曲面优化试验2.3.1 试验结果影响 -1,3-葡聚糖品质的指标有纯度、蛋白质含量和得率，结果见表 2。从表 2 可以知道， 纯度的变化范围为 60.2

12、7 %90.40 %，蛋白质含量变化范围为 1.15 %2.99 %，得率变化范围为 8.98 %12.10 %， 其中纯度变化趋势较明显。2.3.2 方差分析用统计软件 SAS9.1.3 对表 2 中的数据进行方差分析，结果见表 3表 6。 回归参数方差分析和回归模型误差分析主要用来判断所得方程是否能预测相关指标走向，并分析各因素对目标指标的影响。由表 3表 4 可知，Y1，Y2和 Y3回归方程的一次项、Y1的二次项以及失拟项显著性检验都是极其显著的（P0.01）。 Y2的二次项是显著的 （0.01P0.05），但Y3的二次项不显著（P0.05）。 Y1的模型检验极显著，拟 合 系 数 R2

13、为 0.9347；Y2的 模 型 检 验 显 著 ，R2为1 0 1NaOH (%) x1X11.5 2 2.5x2X260 70 80NaOH (mL) x3X330 45 60(h) x4X45 6 7图 1 超声波处理时间对酵母破壁的影响马 森，卢家炯,高俊永，初兰娜，杜林繁·超声-酶-碱法提取啤酒废酵母 -1,3-葡聚糖的研究97酿酒科技 2009 年第 2 期（总第 176 期）·LIQUORMAKING SCIENCE TECHNOLOGY 2009 No2(Tol176)0.8123，说明模型拟合程度良好，试验误差小，适合分析-1,3-葡聚糖纯度和蛋白质含量。

14、 而 Y3模型检验为不显著，且 R2为 0.7038，不适合分析得率。响应曲面的因素方差分析和参数估计与显著性分析主要用来评价独立变量对响应值的影响，以及各变量系数对响应值的影响程度，从而得出主要影响因素。由表 5 可知，浓度和温度对纯度和蛋白质含量影响极其显著，但对得率不显著，而用量和时间对这 3 个指标影响均不显著。由表 6 可知，对于纯度，常数项、温度的一、二次项系数以及时间的二次项系数极其显著，浓度的一次项系数显著，二次项系数极其显著，其他均不显著；对于蛋白质含量，常数项、浓度的一次项、温度的一、二次项系数是极其显著的，浓度的二次项系数是显著的，其他均不显著；对于得率，仅有常数项、浓度

15、和处理温度的一次项ß X1X2X3X4Y1Y2Y31 -1 -1 0 0 62.31 2.34 12.102 -1 1 0 0 71.93 2.10 11.873 1 -1 0 0 70.15 2.24 10.114 1 1 0 0 81.21 1.73 9.035 0 0 -1 -1 90.40 1.26 11.006 0 0 -1 1 84.47 1.38 10.587 0 0 1 -1 82.35 1.23 10.138 0 0 1 1 81.33 1.21 10.019 0 0 0 0 88.42 1.23 10.3110 -1 0 0 -1 77.30 2.64 10.42

16、11 -1 0 0 1 74.99 2.23 10.3212 1 0 0 -1 82.09 1.28 10.0513 1 0 0 1 79.25 1.15 10.1014 0 -1 -1 0 66.60 2.01 10.8815 0 -1 1 0 70.37 2.99 10.1516 0 1 -1 0 83.78 1.22 9.5517 0 1 1 0 80.52 1.21 8.9818 0 0 0 0 88.62 1.23 10.3119 -1 0 -1 0 80.80 2.69 10.6520 -1 0 1 0 78.25 2.34 10.4221 1 0 -1 0 80.02 1.22

17、10.2622 1 0 1 0 83.46 1.19 9.4623 0 -1 0 -1 61.15 2.33 11.3124 0 -1 0 1 60.27 2.23 11.5125 0 1 0 -1 81.44 1.93 10.1226 0 1 0 1 80.48 1.15 9.9127 0 0 0 0 88.60 1.23 10.31R2P4 755.045 0.4132 <0.00014 925.022 0.5062 <0.0001 6 27.9425 0.0153 0.8191Y1 14 1708.01 0.9347 <0.00014 4.63795 0.5133 0.

18、00204 2.26574 0.2508 0.0273 6 0.43585 0.0482 0.7870Y2 14 7.33954 0.8123 0.01434 8.66381 0.6095 0.00624 1.00214 0.0705 0.5982 6 0.33840 0.0238 0.9827Y3 14 10.0043 0.7038 0.1119 Á Â Ã x1 x2 x3 1x4 x1 x2 x3 2x4 x1 x2 x3 3x4 ÁÂÃÁ Â Ã Ä ÁÂ Â

19、;Â ÃÂ ÄÂ ÂÁ ÃÁ ÃÂ ÄÁ ÄÂ ÄÃ Â 98Y1Y2NaOH (%) 2.05 2.02( ) 73.68 88.87(mL) 30.46 102.27( h) 5.72 9.41 Max Min (%) 90.60 0.72 (%) 88.14 0.75图 3 浓度和温度对蛋白质含量的响应曲面和等高面图 2 浓度和温度对纯度的响应曲面和等高面马 森，卢家炯,高俊永，初兰娜，杜林繁·超声-

20、酶-碱法提取啤酒废酵母 -1,3-葡聚糖的研究极其显著，其他均不显著。 因此，浓度和温度的一、二次项系数是影响 -1，3-葡聚糖的主要因素。2.3.3 响应曲面模型建立应用 SAS9.1.3 通过最小二乘法拟合得到二次多项式回归模型：Y1=88.5466 -2.55x1-7.3758x2-0.8158x3-1.1616x4-5.9250x12+0.36x2x1-12.3687x22+1.4975x3x1-1.7575x3x2-0.8512x32-0.1325x4x1-0.02x4x2+1.2275x4x3-4.205x42Y2=1.233333 -0.460833x1-0.401667x2+0

21、.032500x3-0.108333x4+0.472083x1x12- 0.0675x1x2+ 0.515833x22+0.08 x3x1- 0.2475x3x2+ 0.072083x32+ 0.07x4x1- 0.175x4x2-0.035000x4x3+0.083333 x422.3.4 响应面分析三维响应曲面图可以直观反映影响因素对响应值的影响，曲面较陡说明影响显著，曲线平缓说明影响不显著。 等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆表示两因素交互作用显著，而圆形则表示不显著。 浓度和温度对纯度的响应曲面和等高面见图 2，浓度和温度对蛋白质含量的响应曲面和等高面见图 3。由图 2图 3 的

22、曲面图所示，温度（X2）对纯度（Y1）的影响较大，浓度（X1）对蛋白质含量（Y2）的影响较大 ，浓度和温度的交互作用对纯度较明显。为进一步确定稳定点，对模型进行了典型分析。 运用数学的方法来查找响应曲面的稳定点，能够检验出稳定点是最大点、最小点还是鞍点，结果见表 7。由表 7 可知，纯度的稳定点是最大值，蛋白质含量的稳定点是最小值。 在浓度为 2.05 %、温度为 74 、用量为 30.50 mL 和时间为 5.7 h 条件下，纯度理论最大值达到 90.60 %；当浓度为 2.02 %、温度为 88.87 、用量为 102.27 mL 和时间为 9.41 h 时，蛋白质理论含量最小值为 0.7

23、2 %。 因此，为了得到高纯度、低蛋白质含量、合适的得率以及节约试剂和便于控制等问题，选取浓度为2.05 %、温度为 74 、用量为 30.50 mL 和时间为 5.7 h进行分析是合适的。 此时，实际测定 3 次，得纯度平均值为 88.14 %，于预测值相比，相对偏差为 1.04 %；蛋白质含量为 1.19 %，得率为 10.21 %。3 结论提出了超声-酶-碱法提取酵母 -1,3-葡聚糖的工艺。 采用 Box-Behnken 设计， 响应曲面分析法研究NaOH 浓度、温度、用量和时间对 -1,3-葡聚糖的影响，并建立了纯度和蛋白质含量的二次多项式回归模型。 通过相关方差分析证明模型是合理可靠的，能够较好地预测啤酒酵母 -1,3-葡聚糖的评价指标。得到最优工艺条件为：功率为 140 W 的超声波处理 60 min 后，破壁率达到 94.22 %；添加 208 u/g 底物的木瓜蛋白酶，在 50 、pH6.0 的条件下酶解 8 h， 蛋白质去除率达到最大值62.82 %； 加入 30.50 mL 浓度为 2.05 %的 NaOH，74 处理 5.7 h，最终 -1,3-葡聚糖的得率为 10.21 %，纯度为