基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析小分子化合物

1、MALDI-TOF MS分析小分子化合物新方法 对于分子量小于400Da的化合物, 使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS) 的常规方法难以检测，这主要是由于小分子基质带来的干扰。为此，本方法发展了一种MALDI-TOF MS分析小分子的新策略，将小分子转移到高质量区域测定，成功的分析了赤霉酸等一系列小分子化合物。1 实验部分Bruker公司AUTOFLEX III MALDI-TOF 质谱仪，氮分子激光，波长355nm，使用前用混合多肽（购自Bruker公司, 包括：血管紧张肽I, 血管紧张肽II, P物质, 蛙皮素, 促肾上腺皮质激素1-17, 促肾上腺皮质激素18

2、-39, 生长激素释放抑制激素 28）外标法校正仪器。金属酞箐化合物的合成参照已发表的文献，最终产物经过紫外可见吸收光谱（UV-Vis），质谱（MALDI-TOF MS）以及核磁（NMR）表征。样品和基质分别溶于适当溶剂，二者按照一定比例混合均匀，取1l混合溶液滴在MALDI 样品靶上，或者直接吸取1l样品溶液滴在靶上，待溶剂自然挥发样品结晶后，送入质谱仪，进行质谱分析。实验中数据采集时所用参数如下：加速电压19kV，反射模式，激光频率10Hz，使用最大激光能量的40-90%，累加30-200次。使用Bruker公司的XMASS软件，flexControl和flexAnaysis软件进行数据采

3、集和数据处理。2 结果与讨论2. 1金属酞箐基质的发现酞箐化合物是一类具有电子共轭结构的大环化合物，具有良好的热稳定性和化学稳定性一直被广泛用作染料，此外，由于其独特的光、电、磁及对某些气体的敏感性等方面的特性而被应用于化学传感器、非线性光学材料、光盘信息记录材料、太阳能电池材料、燃料电池中的电催化材料、场效应晶体管、气体检测及光动力学治疗癌症等许多方面。在用MALDI-TOF MS分析金属酞箐类化合物时，由于该类化合物在紫外可见区有吸收，可以吸收激光（波长337nm）能量，所以，在没有基质的情况下能够解吸电离得到分子离子峰。当使用常规基质，如-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）和2, 5-二羟

4、基苯甲酸（DHB）时，三价金属酞箐化合物对基质分子有加合作用，而二价和四价金属酞箐化合物与基质分子没有加合作用。因此，利用三价金属酞箐化合物用于分析小分子，它可以将小分子从低质量区域转移到不受干扰的高质量区域，从而消除传统基质带来的干扰。2. 2 无基质时MALDI-TOF MS分析金属酞箐化合物编号MR缩写准确质量摩尔分子量1Al3+(aPc)Al(aPc)+827.3608827.92692Ga3+Ga(aPc)+869.3048870.66833In3+In(aPc)+915.2831915.76334Al3+(pPc)Al(pPc)+1131.48601132.31075Ga3+Ga(

5、pPc)+1173.43001175.05226In3+In(pPc)+1219.40831220.14727Mg2+(hPc)Mg(hPc)968.2193969.20708Zn2+Zn(hPc)1008.16341010.31209SnONon(Pc)SnO(Pc)648.0469647.232410SnF2SnF2(Pc)670.0488669.229911TiOTiO(Pc)576.0926576.3894图1 金属酞箐化合物（MPcs）的结构(B)(A)(D)(C)图2 紫外-可见吸收光谱 (A) 金属酞箐化合物2 (B) 金属酞箐化合物7(C) 基质CHCA (D) 基质DHB金属

6、酞箐化合物（结构见图1所示）有Q带和B带两个吸收带，这是-*跃迁引起的。MALDI-TOF MS所用激光波长为337nm，此波长刚好位于金属酞箐化合物B带吸收带内，图2 A是酞箐化合物2在200-500nm波段的紫外可见吸收光谱，它在324nm处有较高的吸收；图2 B是酞箐化合物7在此波段的吸收光谱，它在340nm处有较高的吸收。MALDI-TOF MS所用的基质CHCA和DHB能够吸收激光能量，其紫外可见吸收光谱见图2 C和D。金属酞箐化合物的吸收峰和两个基质的吸收有很大相似之处，不同的是前者的吸收峰比较宽而后者较窄，吸收峰值不完全相同，CHCA和DHB的吸收峰值分别是340nm和339nm

7、，更接近激光波长。金属酞箐化合物能吸收激光能量，理论上在不加基质的情况下它能直接解吸电离产生分子离子峰。图3为不加基质情况下酞箐化合物2的质谱图及实验所得同位素分布与理论同位素分布的对比。从对比中看到，二者十分吻合。(A)(B)图3 无基质情况下酞箐化合物2的质谱图(A)及理论与实际同位素分布的对比(B)2. 3 使用常规基质时MALDI-TOF MS分析金属酞箐化合物表2 使用CHCA和DHB为基质分析金属酞箐化合物的MALDI结果基质编号Masscal.Massdet.CHCA1234567891011827.4869.3915.31131.51173.41219.4968.21008.2

8、648.0670.0576.11016.51058.41104.41320.61362.51408.5968.21008.2648.0670.0576.1DHB1234567891011827.4869.3915.31131.51173.41219.4968.21008.2648.0670.0576.1981.51023.41069.41285.61327.51373.5968.21008.2648.0670.0576.1(B)(A)图4 以CHCA为基质时（A）金属酞箐化合物2的质谱图以及（B）实际与理论同位素分布的对比使用CHCA和DHB作为基质，用MALDI-TOF MS对一系列金属酞箐

9、化合物进行分析，所得质谱结果见表2。其中，三价金属酞箐化合物1-6，检测得到的分子量比理论计算值大。以化合物2为例，当以CHCA为基质时（其质谱图见图4 A），检测得到的质荷比（m/z）为1058.4，而理论值为869.3。用检测值减去理论计算值得到的值是189.1，相当于CHCA的分子量。经过计算发现，其余五个化合物也是这种情况。因此认为，化合物1-6在检测的过程中与CHCA的分子发生了加合作用，且二者比例是1:1。 用XMASS对化合物2与CHCA加合物 M+CHCA+ 的同位素进行模拟，与实验得到的同位素分布相比较（见图4 B），二者吻合得很好。实际上化合物1-6是酞箐阳离子，带一个正电

10、荷M+，当它与中性的CHCA分子结合后形成M+CHCA+ 带一个正电荷。而当以DHB为基质时，化合物1-6与DHB的分子发生了加合作用，二者的比例是1:1。从表2中，还可以看到，对于金属酞箐化合物7-11，包括二价金属酞箐和四价金属酞箐，检测得到的分子量与理论计算值相符。基于以上的结果，可以大胆地设想：三价金属酞箐作为MALDI MS新基质分析小分子化合物，利用它与小分子的加合作用将小分子从低质量区域转移到高质量区域，就能解决MALDI-TOF MS无法分析赤霉素等小分子样品（<400Da）的难题。24金属酞箐用作MALDI基质分析小分子的新策略从理论上讲，金属酞箐分子（结构见图1所示）

11、具有进一步和含氧等配位原子或含大 键等分子形成络合物或加合物的潜力，它们能和小分子有机物等形成加合物，其质谱峰出现在1000Da以上的信号区域，如图5 所示。图5 A表示MALDI-TOF MS正离子模式下分析柠檬酸，使用传统基质CHCA，只能在小于500Da的质量范围内产生杂乱的谱图，很难找到样品的分子离子峰，当使用铝酞箐AlPc基质，柠檬酸以加合物 Al(pPc)(citric acid)+ 的形式在较高的质量范围检测到，信号强，分辨率高。此外，还能观察到 Al(pPc)+，可作内标或参考，用于分子量的精确测定。AlPc基质可用于更多小分子样品的分析，见表3。图 5 使用铝酞箐基质与CHC

12、A基质的对比（A）在正离子模式下分析柠檬酸（B）在负离子模式下分析硬脂酸表 3 使用铝酞箐作基质时MALDI分析结果，使用正离子模式，分析物/基质摩尔比为5:1样品 HA分子式MAl(pPc)HA aMHAbMHAc误差/ppm-cyano-4-hydroxycinnmaic acidC10H7NO31320.5295189.0435189.042652, 5-dihydroxy benzoic acidC7H6O41285.5131154.0271154.02663salicylic acidC7H6O31269.5170138.0310138.0317-5citric acidC6H8O7

13、1323.5132192.0272192.02701gibberellic acidC19H22O61477.6291346.1431346.141641,2,3,4-tetrahydro-9-acridano-neC13H13NO1330.5847199.0987199.0997-5a MAl(pPc)HA = mass of Al(pPc)HA+. b MHA = MAl(pPc)HA - MAl(pPc) = MAl(pPc)HA -1131.4860.c MHA = theoretical mass of HA.在负离子模式下(图5 B)，使用传统基质CHCA分析硬脂酸，能看到很强的与

14、基质相关的离子：188.0 (M-H-)，399.1 (2M-2H+Na-)，但是，使用铝酞箐AlPc基质，硬脂酸以 Al(pPc)(stearic acid - H)- 离子的形式检测到。此时也能观察到Al(pPc)，但是信号很弱。该方法能用于分析赤霉酸（GA3），还可以分析氨基酸、小肽、脂肪酸、黄酮等小分子样品，见表4表 4 使用铝酞箐作基质时MALDI分析结果，使用负离子模式，分析物/基质摩尔比为5:1样品 HA分子式MAl(pPc)A aMHAbMHAc-cyano-4-hydroxycinnmaic acidC10H7NO31319.5189.0189.02, 5-dihydroxy

15、 benzoic acidC7H6O1284.5154.0154.0salicylic acidC7H6O31268.5138.0138.0citric acidC6H8O71322.5192.0192.0Vitamin CC6H8O61306.5176.0176.0Vitamin ppC6H5NO21253.5123.0123.0gibberellic acidC19H22O61476.6346.1346.1cholic acidC24H40O51538.8408.3408.3PheC9H11NO21295.6165.1165.1LysC6H14N2O21276.6146.1146.1Cys

16、C3H7NO2S1251.5121.0121.0Phe-PheC18H20N2O31442.6312.1312.1Asp-PheC13H16N2O51410.6280.1280.1luteolinC15H10O61416.5286.0286.0quercetinC15H10O71432.5302.0302.0palmitic acidC16H32O21386.7256.2256.2stearic acidC18H36O21414.8284.3284.3样品 HA分子式MAl(pPc)A aMHAbMHAc4,4'-(3,6-diethynyl-9H-fluorene-9,9-diyl)

17、diphenolC29H18O21528.6398.1398.14-tert-butylphenolC10H14O1280.6150.1150.12-methyl-1,3,4,10-trtrahydro-9(2H)-acridinoneC14H15NO1343.6213.1213.11,2,3,4-tetrahydro-9-acridanoneC13H13NO1329.6199.1199.1norharmaneC11H8N21298.6168.1168.1a MAl(pPc)A = mass of Al(pPc)A-. b MHA = MAl(pPc)A - MAl(pPc) + MH = M

18、Al(pPc)A - 1131.5 + 1.0 = MAl(pPc)A - 1130.5. c MHA = theoretical mass of HA.2. 5 样品分子量的计算在新方法中，所看到的质谱峰不是样品本身的分子离子峰，而是加合物的峰,样品的分子量只要简单的计算就能得到。正离子模式下(图5 A), 样品的分子量为：M(Pc)HA+- M(Pc)+。在负离子模式下(图5 B)，样品以M(Pc)A-形式出现，这时的样品分子量应该等于M(Pc)A- M(Pc)-+H。2. 6 影响灵敏度的重要因素 在这种方法中，样品与基质的比例、 M(Pc)的取代基和中心离子以及样品pKa会影响加合物的

19、形成，进而影响质谱信号强度。基质与样品发生加合作用，因此二者的摩尔比范围比较窄，通常为10:1 - 1:10，当大于10:1的时候，正离子模式下金属酞箐化合物MPc+本身的峰强度太高，就很难检测到络合物的峰；当小于1:10的时候，大量的样品结晶会妨碍激光能量的有效吸收和目标络合物的解吸和电离。图6 使用M(pPc)和M(aPc)做基质分析水杨酸和柠檬酸的结果比较，峰高使用h/NP均一化（h: 测得的峰高，N: 累加次数，P: 激光强度）酞箐环上的取代基也会影响质谱信号强度，从图6可以看到，芳香取代的金属酞箐M(pPc)比烷基取代的金属酞箐M(aPc)产生信号强。相对于取代基而言，酞箐的中心金属离子对质谱信号有更大的影响。Sn4+、Ti4+ 等高价金属离子或Zn2+、Mg2+等较低价金属离子，都不能产生理想的质谱信号，只有第三主族的Al3+、Ga3+ 、In3+等离子才能产生较好的加合物信号。从信号强度看（图6），它们的优选顺序是 Al3+ >> Ga3+ > In3+，这和它们形成络合物的能力相一致。因为Al、Ga、In的