第一篇c4细菌耐药性检测

1、第四章第四章 细菌耐药性检测细菌耐药性检测 本章学习目标本章学习目标1. 概念：概念：AST、MIC、敏感、耐药、中介、敏感、耐药、中介2. 抗菌药物的主要种类及其代表药物和作用对象抗菌药物的主要种类及其代表药物和作用对象3. 抗菌药敏试验的方法有？分别的优缺点是？抗菌药敏试验的方法有？分别的优缺点是？ 4. KB法和稀释法（原理、操作方法、注意事法和稀释法（原理、操作方法、注意事项及影响因素）项及影响因素）5. 临床常用抗菌药物种类临床常用抗菌药物种类一、青霉素类一、青霉素类 二、头孢菌素类二、头孢菌素类 三、其他三、其他- -内酰胺类内酰胺类 四、四、氨基糖苷类氨基糖苷类五、喹诺酮类五、喹

2、诺酮类 六、大环内脂类六、大环内脂类七、糖肽类和环脂肽类七、糖肽类和环脂肽类 八、磺胺类八、磺胺类九、四环素、氯霉素、林可霉素类九、四环素、氯霉素、林可霉素类 十、其他抗菌药物十、其他抗菌药物 作用机制：作用机制：与与PBP结合，抑制细胞壁合成。结合，抑制细胞壁合成。抗菌效果：抗菌效果：G+球菌：一代强；球菌：一代强；G-杆菌：三代强杆菌：三代强作用机制：作用机制：与与PBP结合，抑制细胞壁合成结合，抑制细胞壁合成作用机制：作用机制：与与PBP结合，抑制细胞壁合成或溶解结合，抑制细胞壁合成或溶解细菌；抑制由质粒或染色体介导细菌；抑制由质粒或染色体介导-内酰胺酶。内酰胺酶。作用机制：作用机制：依

3、靠离子吸附作用，损伤细胞膜；依靠离子吸附作用，损伤细胞膜；与细菌核糖体与细菌核糖体30S小亚基结合，抑制细菌蛋白质的小亚基结合，抑制细菌蛋白质的合成或产生无意义的蛋白质；合成或产生无意义的蛋白质；作用机制：作用机制：通过外膜孔蛋白和磷脂渗透菌细胞；通过外膜孔蛋白和磷脂渗透菌细胞；作用于作用于DNA旋转酶干扰旋转酶干扰DNA复制修复和重组；复制修复和重组；抗菌药物敏感试验抗菌药物敏感试验( (AST) )是是指在指在药物抑制或杀死细菌能力药物抑制或杀死细菌能力或或细菌对抗菌药物的敏感性和耐药性细菌对抗菌药物的敏感性和耐药性的的。AST的意义：的意义：预测抗菌治疗的效果；指导抗菌药物的临床应预测抗

4、菌治疗的效果；指导抗菌药物的临床应用；发现或提示细菌的耐药机制用；发现或提示细菌的耐药机制 ，选择合适的药，选择合适的药物，避免产生或加重细菌的耐药；物，避免产生或加重细菌的耐药； 监测细菌耐药监测细菌耐药性变迁，控制和预防耐药菌的流行；性变迁，控制和预防耐药菌的流行； 鉴定细菌：鉴定细菌：如杆菌肽试验、新生霉素试验等如杆菌肽试验、新生霉素试验等一、一、AST抗菌药物的选择抗菌药物的选择选择原则：选择原则：遵循遵循临床实验室标准化委员会临床实验室标准化委员会( () )制制定的标准执行。定的标准执行。药物分组：药物分组：A组：组：对特定菌群对特定菌群常规常规试验并试验并常规常规报告的药物；报告

5、的药物；B组：组：临床上重要的、针对院内感染的、在临床上重要的、针对院内感染的、在A组耐药组耐药/ 过敏过敏/无效无效/多部位感染时的多部位感染时的选择性选择性报告药物。报告药物。C组：组： A、B组耐药时选用的组耐药时选用的替代性替代性或或补充性补充性的药物；的药物；U组：组：仅用于仅用于治疗泌尿道感染治疗泌尿道感染的药物。的药物。O组：组：对该组细菌有临床适应证但一般对该组细菌有临床适应证但一般不允许常规试不允许常规试 验并报告验并报告的药物的药物 根据菌株选择的建议抗菌药物根据菌株选择的建议抗菌药物肠杆菌科：肠杆菌科：氨苄西林氨苄西林 阿米卡星阿米卡星 哌拉西林哌拉西林/ 他唑巴坦他唑巴

6、坦 头孢噻肟头孢噻肟 环丙沙星环丙沙星 亚胺培南亚胺培南 氨曲南氨曲南 庆大霉素；庆大霉素；铜绿假单胞菌：铜绿假单胞菌：头孢他啶头孢他啶 庆大霉素庆大霉素 哌拉西林哌拉西林 阿米阿米卡星卡星 环丙沙星环丙沙星 头孢吡肟头孢吡肟 亚胺培南；亚胺培南；葡萄球菌属：葡萄球菌属：头孢西丁头孢西丁 青霉素青霉素 红霉素红霉素 万古霉素万古霉素 环环丙沙星丙沙星 庆大霉素庆大霉素 利福平利福平 ；肠球菌属：肠球菌属：青霉素青霉素 万古霉素万古霉素 甲氧苄啶甲氧苄啶/ /磺胺异噁唑磺胺异噁唑 庆大霉素庆大霉素 环丙沙星环丙沙星 红霉素红霉素 氨苄西林氨苄西林不动杆菌属：不动杆菌属：头孢他啶头孢他啶 亚胺培南

7、亚胺培南 阿米卡星阿米卡星 头孢吡肟头孢吡肟 哌拉西林哌拉西林/ /他唑巴坦他唑巴坦 头孢曲松头孢曲松 环丙沙星环丙沙星 米诺环素米诺环素洋葱伯克霍德菌：洋葱伯克霍德菌：头孢他啶头孢他啶 米诺环素米诺环素 甲氧苄啶甲氧苄啶/ /磺胺磺胺异噁唑异噁唑 美罗培南；美罗培南；嗜麦芽窄食单胞菌：嗜麦芽窄食单胞菌：甲氧苄啶甲氧苄啶/磺胺异噁唑磺胺异噁唑 左氧氟沙星左氧氟沙星 米诺环素；米诺环素；嗜血杆菌属：嗜血杆菌属：氨苄西林氨苄西林 甲氧苄啶甲氧苄啶/磺胺异噁唑磺胺异噁唑 头孢他头孢他啶啶 美罗培南美罗培南 阿奇霉素阿奇霉素 环丙沙星环丙沙星 头孢克洛；头孢克洛；淋病奈瑟菌：淋病奈瑟菌：头孢曲松头孢曲

8、松 环丙沙星环丙沙星 青霉素青霉素 大观霉素大观霉素 四环素四环素 ；肺炎链球菌：肺炎链球菌：红霉素红霉素 苯唑西林苯唑西林 甲氧苄啶甲氧苄啶/磺胺异噁唑磺胺异噁唑 克林霉素克林霉素 左氧氟沙星左氧氟沙星 四环素四环素 万古霉素万古霉素 ；其他链球菌：其他链球菌：红霉素红霉素 青霉素青霉素 克林霉素克林霉素 万古霉素万古霉素 头头孢曲松孢曲松 左氧氟沙星。左氧氟沙星。AST常用方法：常用方法：纸片扩散法纸片扩散法、稀释法稀释法、E-test法法、自动化仪器法自动化仪器法临床微生物实验室应选择先进、方便的方法进行临床微生物实验室应选择先进、方便的方法进行常规的常规的AST： 需氧菌及兼性厌氧菌：

9、需氧菌及兼性厌氧菌：K-B法法、稀释法稀释法、E-试验法试验法 结核分枝杆菌：结核分枝杆菌：绝对浓度法、绝对浓度法、1%溶血液体培养基溶血液体培养基快速法快速法 厌氧菌的厌氧菌的AST：稀释法稀释法 真菌的真菌的AST：液体稀释法、琼脂斜面法液体稀释法、琼脂斜面法nWHO推荐的推荐的AST的的、方法；方法；n是目前是目前的的AST法；法；n优点：优点：操作简单，选药灵活，成本低廉操作简单，选药灵活，成本低廉n缺点：缺点：不能用于厌氧菌；只能定性不能定量。不能用于厌氧菌；只能定性不能定量。n相关概念：相关概念：敏感敏感(S)(S)：是指是指所分离菌株能被测试药物所分离菌株能被测试药物使用推使用推

10、荐剂量时在感染部位通常可达到的抗菌药物浓度荐剂量时在感染部位通常可达到的抗菌药物浓度所抑制所抑制。耐药耐药(R)(R)：是指是指所分离的菌株不被测试药物所分离的菌株不被测试药物常规常规剂量可达到的药物浓度剂量可达到的药物浓度所抑制所抑制。中介中介(I)(I)：是指抗菌药物在生理浓集的部位具有是指抗菌药物在生理浓集的部位具有临床效果，还表示临床效果，还表示S与与R之间的缓冲区之间的缓冲区MIC(MBC)MIC(MBC)：最低抑最低抑(杀杀)菌浓度菌浓度(U/ml 或或 ug/ml)，是是某种抗菌药物抑制某种抗菌药物抑制(杀灭杀灭)待测菌的待测菌的最低浓度最低浓度。 P52P52 K-B法药物纸片

11、周围无菌生长的透明圈。法药物纸片周围无菌生长的透明圈。 抑菌圈大小抑菌圈大小与该药对测试菌的与该药对测试菌的MIC 呈负相关呈负相关( (即抑即抑菌圈越大，菌圈越大，MIC越小，则药物抗菌力越强越小，则药物抗菌力越强) )抑菌圈大小抑菌圈大小反映测试菌对测定药物的反映测试菌对测定药物的敏感程度敏感程度呈正呈正相关相关( (即抑菌圈越大，细菌对该药越敏感即抑菌圈越大，细菌对该药越敏感) )药物药物纸片纸片抑菌圈抑菌圈已接种菌已接种菌的平板的平板2.培养基培养基要求：要求：水解酪蛋白水解酪蛋白( (M-HM-H) )培养基；培养基；PH 7.2PH 7.27.47.4；注意事项：注意事项：琼脂琼脂

12、厚厚4mm4mm；密封密封置置4C4C冰箱可保存冰箱可保存7 7天；天；使用前置使用前置35C35C温箱温箱1515分钟待其分钟待其表面干燥表面干燥。1.药敏纸片：药敏纸片：要求：要求：直径直径6.35mm6.35mm；吸水量；吸水量20l20l；含药量含药量达规定达规定所示；所示；注意事项：注意事项：含药纸片含药纸片密封贮存密封贮存于于-20C-20C无霜无霜冰箱或冰箱或4 48C8C冰箱保存冰箱保存( (短期短期) )；用前用前室温平衡室温平衡1 12h2h，有，有效期内使用。效期内使用。 1.1.配制菌悬液配制菌悬液 浓度：浓度：0.5麦氏比浊标准麦氏比浊标准( (相当于含菌量相当于含菌

13、量108CFU/ml) ) 配制方法：配制方法：直接菌落调配法直接菌落调配法、细菌液体生长法、细菌液体生长法比浊仪比浊仪配好的菌液应在配好的菌液应在15min内接种内接种平板平板用无菌棉拭子醮取菌液，用无菌棉拭子醮取菌液，在管壁拧压在管壁拧压 在琼脂表面均在琼脂表面均匀匀涂抹涂抹3次次, ,每次每次平板转角平板转角60+ 内缘一周内缘一周2. 接种接种 涂布法涂布法平板室温平板室温干燥干燥35min贴药敏纸片贴药敏纸片( (片间距片间距24mm；距平板内缘；距平板内缘15mm；纸处贴上后纸处贴上后不可再不可再移动移动) ) 平板平板放置放置15min3. 贴纸片贴纸片置置35C培养箱培养箱16

14、18h( (苯唑西林和万古霉素敏感等苯唑西林和万古霉素敏感等应孵育应孵育24h)24h)；孵育时平板尽量；孵育时平板尽量不叠放不叠放 判读结果判读结果4. 孵育孵育 用直尺或游标卡尺测量用直尺或游标卡尺测量抑菌圈直径抑菌圈直径 1. 测量时注意：测量时注意：自自平板背面量平板背面量抑菌圈直径，抑菌圈直径，血平板则开盖血平板则开盖正面正面借光借光观察；观察；抑菌圈的边缘应是抑菌圈的边缘应是无明显细菌生长无明显细菌生长的区域，圆心为的区域，圆心为药物药物纸片中心纸片中心；如果出现不规则圆形，则取如果出现不规则圆形，则取最近似圆形的一侧最近似圆形的一侧测量测量（如只能测出半径（如只能测出半径2）2.

15、 根据根据CLSI所公布的最新判断标准所公布的最新判断标准(查表查表)作出结作出结果（果（“S”“R”“I”）判断）判断抑菌圈直径抑菌圈直径(mm)敏感度敏感度20及以上及以上极敏极敏1520高敏高敏1014中敏中敏10以下以下低敏低敏0不敏不敏纸片扩散法结果判断标准纸片扩散法结果判断标准(CLSI)(CLSI)但具体对于不同的菌株，及不同的抗生素纸但具体对于不同的菌株，及不同的抗生素纸片需参照片需参照更详细的更详细的CLSI标准标准( () ) 1. 影响因素影响因素（总结前述）（总结前述）培养基（成分、含量、酸碱度、琼脂含量）培养基（成分、含量、酸碱度、琼脂含量）纸片（重量、吸水性、直径、

16、保存）纸片（重量、吸水性、直径、保存）菌量（浓度、接种量）菌量（浓度、接种量）操作方法（接种后放置及时间、堆放情况、纸片操作方法（接种后放置及时间、堆放情况、纸片贴放？涂布细菌方法？贴放？涂布细菌方法？）培养条件、温度、时间培养条件、温度、时间抑菌环测量工具的精度级测量方法抑菌环测量工具的精度级测量方法2. 质控标准株质控标准株相同条件下相同条件下，质控菌与待测菌，质控菌与待测菌同时操作同时操作，以质控菌的抑菌圈为标准，抑菌圈质控范围为以质控菌的抑菌圈为标准，抑菌圈质控范围为 “95%的可信限的可信限”质控菌向可靠机构索购（质控菌向可靠机构索购（ATCC）优点：优点：直接测直接测MIC（定量定

17、量）；）； 是目前厌氧菌等的最佳测定方法是目前厌氧菌等的最佳测定方法缺点：缺点：操作烦琐操作烦琐 常用方法常用方法 ：肉汤稀释法肉汤稀释法、琼脂稀释法、琼脂稀释法1.1.材料材料培养基：培养基：M-HM-H肉汤肉汤n需氧菌、兼性厌氧菌在此培养基中生长良好；需氧菌、兼性厌氧菌在此培养基中生长良好；( (流感嗜血杆菌、链球菌等需补充生长所需成分流感嗜血杆菌、链球菌等需补充生长所需成分) )n校正培养基校正培养基pHpH为为7.27.27.47.4n离子校正的离子校正的M-HM-H肉汤肉汤(CAMHB)(CAMHB)为目前推荐的药敏为目前推荐的药敏试验培养液试验培养液药物原液：药物原液：遵照遵照CL

18、SICLSI的指南进行稀释的指南进行稀释 菌液：菌液：0.50.5麦氏浓度菌液麦氏浓度菌液最终菌液浓度最终菌液浓度( (每管每管或每孔或每孔) )为为5 510105 5CFU/mlCFU/ml 2. 2.操作操作用用M-HM-H液体培养基将抗菌药物做不同浓度的稀释液体培养基将抗菌药物做不同浓度的稀释( (试管试管法或微量板法法或微量板法)每管接种待测菌每管接种待测菌孵育孵育结果判断结果判断（参考实验指导）（参考实验指导）试管号试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M-HM-H液液(ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 (ml) 1 1 1 1 1

19、1 1 1 药物稀释药物稀释(ml) 1 1 1 1 (ml) 1 1 1 1 类推类推接种菌液接种菌液(ml) (ml) 每管每管0.050.05混匀混匀351218h351218h培养培养每管含药物浓度每管含药物浓度g/ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 512 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 1 弃去弃去 微量稀释法微量稀释法在微量聚乙烯微板孔中加入各种不同浓度的抗生素在微量聚乙烯微板孔中加入各种不同浓度的抗生素100l100l，从低浓度往高浓度加样从低浓度往高浓度加样，不需要更换吸管，不需要更换吸管 MIC：无肉眼可见细菌生长

20、的管或孔的最低药物浓度。无肉眼可见细菌生长的管或孔的最低药物浓度。MBC：无菌生长各管中分取：无菌生长各管中分取0.01ml(定容接种环定容接种环)移种移种血平板血平板, 35C过夜，过夜，99.9%原始种入菌被杀死管的药物原始种入菌被杀死管的药物浓度即为该菌的浓度即为该菌的MBC。3. 结果判断结果判断4. 质量控制质量控制 同同K-B法法 琼脂稀释法（自学）琼脂稀释法（自学）E- test法是一种法是一种定量定量的抗生素药敏测定技术。的抗生素药敏测定技术。该系统包含有一个预先制备好的抗生素浓度梯度，该系统包含有一个预先制备好的抗生素浓度梯度，可用于在琼脂培养基上判读某抗生素对微生物的最可用

21、于在琼脂培养基上判读某抗生素对微生物的最小抑菌浓度（小抑菌浓度（MIC），用），用g/ml表示。表示。 是扩散法和稀释法的结合是扩散法和稀释法的结合n是结合稀释法和扩散法原理的是结合稀释法和扩散法原理的直接定量直接定量AST法法 n优点：优点：可以定量；操作简单可以定量；操作简单n缺点：缺点：不能用于厌氧菌不能用于厌氧菌1. 原理：原理：P542. 培养基：培养基：M-H琼脂琼脂nMRSA/MRSE：+2%NaCln肺链：肺链：+5%脱纤维羊血脱纤维羊血n厌氧菌：用布氏菌血琼脂厌氧菌：用布氏菌血琼脂n嗜血杆菌：嗜血杆菌：HTMn淋球菌：淋球菌：GC+1%添加剂添加剂1.1.菌液制备及涂布接种同

22、菌液制备及涂布接种同K KB B法法2.2.用镊子将用镊子将E-test试条的试条的含抗菌药物的一面贴向琼脂含抗菌药物的一面贴向琼脂表面表面，有刻度的一面向外，直径，有刻度的一面向外，直径140mm140mm的平板可放置的平板可放置6 6条，条，90mm90mm平板只能放置平板只能放置1 12 2试条试条。3.3.孵育，置平板于孵育，置平板于3535孵育孵育161624h24h 3.操作方法操作方法椭圆形椭圆形抑菌圈；抑菌圈和试条的抑菌圈；抑菌圈和试条的交界点值交界点值即为抗菌药物的即为抗菌药物的MIC 4.结果判断和报告结果判断和报告 MIC 2. 结果结果 无关作用无关作用等于活性最大的单

23、药的药效等于活性最大的单药的药效 拮抗作用拮抗作用低于单药活性低于单药活性 累（相）加作用累（相）加作用等于单药之和等于单药之和 协同作用协同作用大于单药抗菌活性总和大于单药抗菌活性总和 3. 方法：方法：稀释法：稀释法：如如“棋盘法棋盘法”（定量）（定量）扩散法：单药纸片搭桥法或纸条扩散法扩散法：单药纸片搭桥法或纸条扩散法纵向稀释一种药物纵向稀释一种药物横横向向稀稀释释另另一一种种药药物物稀释法稀释法 结果判读结果判读以以FIC为依据：为依据： 0.5 协同；协同； 0.51 累加；累加； 12无关；无关； 2拮抗；拮抗； 扩散法扩散法无关无关拮抗拮抗协同协同累加累加 n产生一种或多种水解酶

24、、钝化酶和修饰酶等产生一种或多种水解酶、钝化酶和修饰酶等n抗菌药物的靶位改变抗菌药物的靶位改变n细菌膜的通透性下降细菌膜的通透性下降n细菌主动外排系统的过度表达细菌主动外排系统的过度表达第一、二种机制具有专一性第一、二种机制具有专一性第三、四种机制不具专一性第三、四种机制不具专一性n主要指主要指(P55 (P55 表表4-2 )4-2 )广谱酶、广谱酶、金属酶、金属酶、AmpC酶等酶等n临床以临床以产产ESBL的的G-杆菌杆菌最受重视最受重视产产ESBL大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等n碳青霉烯酶碳青霉烯酶引起国际的广泛关注引起国际的广泛关注鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等n主要是细菌菌体膜蛋白主要是细菌菌体膜蛋白的改变的改变n主要是主要是细菌膜的选择透过性细菌膜的选择透过性的改变的改变n主要易化家族；耐药小节分裂家族；链霉素主要易化家族；耐药小节分裂家族；链霉素耐药或葡萄球菌多重耐药家族；耐药或葡萄球菌多重耐药家族；ATP结合盒结合盒转运器转运器n该酶位于该酶位于G+球菌菌体外球菌菌体外；位于；位于G-杆菌间质中杆菌间质中n头孢硝噻吩纸片法头孢