克隆载体的特征及类型

1、第四章克隆的载体载体的功能及特征质粒（p asmid）DNA噬菌体或粘粒（cosm d）与噬菌粒人工载体载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。能够运载外源DN段（目的）进入受体细胞，具有自我能力，使外源DN段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA。第一节 载体的功能及特征载体的功能运送外源高效转入受体细胞为外源提供能力或整合能力为外源的扩增或表达提供必要的条件载体应具备的条件有起点，在受体细胞中能自我，或整合到DNA上随DNA的而同步；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点；具有筛选转化子的选择性标记；量小，拷贝数多；具有较高的外源DNA的载装能力；安全，不含对受体

2、细胞有害的胞以外的其它生物细胞中。，任意转入受体细型载体和附加载体的扩增方式载体的类型n 应用范围：克隆载体、表达载体。n 应用对象：原核载体、穿梭载体。载体（酵母、植物和动物）n 构建来源：质粒载体、或噬菌体载体、质粒DNA与或噬菌体DNA组成的载体、质粒DNA与段组成的载体。DN克隆载体(cloning vector)用于在受体细胞中进行目的扩增的载体。一般具有较低的制子。量、较高的拷贝数和松弛表达载体(expression vector)使目的在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载的目的能够、转录和翻译。穿梭载体(shuttle vector)n 又称双功

3、能载体，能在两种不同的生物体内的载体。n 同时具有细菌质粒的原点和生物可识别的原点或酵母菌的细胞中序列(ARS)，它既能在原核细胞中扩增又能在和表达。n 主要用于原核细胞与细胞之间进行转移，通常是将载体和待克隆的生物DN段先在细菌中克隆，再转移到的表达效率。细胞中表达，并可提高外源第节 质粒质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能于寄主而、并；绝大多数的质粒是DNA型被稳定遗传的一类核酸质粒DNA的量范围：1 - 200 kb天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccD(ocDNA)和线性(lDNA)构型。)绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的即cccDNA结构，Plasmid

4、chromosome质粒质粒的基本特征1. 质粒的性质粒能利用寄主细胞的DNA系统进行质粒DNA的受质粒和宿主细胞双重遗的根据在每个细胞中的数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大类型：的质粒 1 - 5 拷贝stringent plasmid严紧制的质粒 10 - 60 拷贝stringent plasmid松弛制质粒质粒的基本特征质粒DNA质粒的性：拷贝数的机制启动引物与模板的结合方向RNA II3553oriropRNA I（+）E.coliCo E1 p asmidRopRNAII是的正向调节，RNAI是的负调节物质粒质粒的基本特征机制 质粒DNA质粒的性：拷贝数的启动起始位点（ori）的结合

5、起始因子与CopRepPcopcop质粒DNA上的P/Oreprepori子结构决定了质粒与寄主的对应关系质粒质粒的基本特征2. 质粒的不相容性任何两种含有相似子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1 拥有相似的p15A及其衍生质粒拥有相似的子结构，彼此不相容子结构，彼此不相容亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。质粒质粒的基本特征质粒的不相容性：机制两种含有不同子结构的不同质粒，在时各受的拷贝数系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干周期和细胞周期后仍能共处于同

6、一细胞内(亲和性质粒)两种含有相似子结构的不同质粒，在时受到同一种拷贝数系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞周期中更具优势质粒质粒的基本特征3. 质粒的可转移性革兰氏菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等非接合型质粒不能在天然条件下地发生接合作用如Col、R的其它成员值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob决定质粒质粒的基本特征4. 质粒的重组性由rec，使质粒整合到组上。在工程应用的是重组缺陷型（rec

7、）的质粒和菌株。质粒质粒的基本特征5. 携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带个或多个遗传标记，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质抗生素、细菌毒素、有机碱对DNA重组这些标记的筛选具有重要意义利用抗性进行重组子的筛选质粒编码的特性n Fertility /F质粒：只含有tra外没有其他功能。，除了促进接合转移/ R质粒：含有氯霉素、青霉素等抗性。如RP4，发现于假单胞杆菌。n Col 质粒：编码大肠菌素，可以杀死其他细菌，如存在于E. coli 中的CoE1。n 降解质粒（Degradative plasmids）:可以

8、降解特殊的分子如：甲苯，水杨酸。n 致瘤质粒（Virulence plasmids）：农杆菌Ti质粒。n质粒质粒的构建天然存在的两种质粒colE1宿主细菌大肠杆菌，6.5kb，松弛30/cell制20-pSC101宿主细菌沙门氏菌，8.8kb，严谨制5/cell，标记为Tcr理想的质粒载体应具备的条件量较小。松驰型，在受体细胞中有较多的拷贝数。1.2.3.具有一个以上的选择标记一个强的选择标记。，形成重组质粒后，至少还要有具有内，外源DN段克隆的位点，并且位于选择标记区4.外源片段不影响质粒的功能。能够导入寄主细胞，具备转化的功能。操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用途的质粒载体。

9、5.6.质粒人工构建的目的天然存在的野生型质粒由于量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作进行改造构建：工程的载体，必（1）加入合适的选择标记，如两个以上，易于用作选择（2） 增加或减少合适的酶切位点，便于重组（3） 缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量（4） 改变（5） 根据子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝工程的特殊要求加装特殊的元件方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。质粒质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：拷贝数1000-3000高拷贝质粒低拷贝质粒质粒质粒整合质粒穿梭质粒表达质粒探针质粒突变拷贝数来自pSC101扩增拷贝数小

10、于10表达某些毒性在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质通用引物互补序列和多酶接头polylinker含有装有整合促进及位点便于外源的整合克隆装有两种不同受体的子便于装有强化外源装有报告表达的转录、翻译、纯化的元件便于启动子等元件的克隆筛选质粒重要的大肠杆菌质粒载体EcoR ICla IHind IIIpBR322：Pst IBamH IPvu I松弛制st IAprTcr拷贝数 50 - 100 / cellSal IpBR3224363 bp氯霉素可扩增用于克隆ROIBal IROPHind IIOrigin of Replication优点：n量小：4363bp, 容易纯化。n 含有2

11、个抗生素抗性Ampr和Terr，可以作为选择标记。而且每一个标记都含有单一的酶切位点，可以DNA，amp内可被Pst I, Pvu I, Sac I切开，而四环素抗性基因可被BamH I, Hind III切开，通过失活筛选重组子。n 受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到50-100个，而在蛋白质可达到1000-3000拷贝。缺点：抑制剂存在条件下，如氯霉素，n 有迁移的可能，不够安全。n 抗生素标记失活筛选为负筛选法，比较麻烦。质粒重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 / 19：EcoRISstIKpnISmaIBamHI XbaISalIPstISphIHindIII39

12、6452lacZ拷贝数 2000 - 3000 / ce loripUC182686 bpApr装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZ用于克隆和GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTpUC18也来自于pBR322，但只保留了起点和am因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位点集中在lacZ内的一个小片段上。pUC18的优点：1）突变位点位于起点，提高了拷贝数。2) 重组子的鉴定可一步完成，固体培养基中添加amp和X-gal,IPTG，节约了一半的时间。3）多克隆位点，可以使具有不同粘端的DN必连接lin

13、ker。段载体，而不4）载体中的多克隆位点与M13mp系列的载体是相同的，因此，插入pUC系列的克隆DNA可以直接转入M13mp载体，可以进行DNA体外定点突变。和质粒重要的大肠杆菌质粒载体pUC8 / 19：正选择标记 lacZ 的显色原理PlacMCSlacZpUC18/195-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-galb-半乳糖苷酶的a-肽段CH2OHOClClOHOBrNHBrOOHHHHNBrNHOHCl质粒重要的大肠杆菌质粒载体lacZPT7MCSpGEM-3Z：多拷贝PSP6pGEM-3E装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZ装有两个噬菌体的强启动子743 bp

14、Aprori用于外源的高效表达注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等在重组的pGEM3Z载体中加入相应的RNA 聚合酶，可以发生外源转录。质粒载体总体评价n 操作简便n 克隆容量有限（10kb）DNA第二节 噬菌体或噬菌体或是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或繁殖，或整合入宿主组中潜伏起来。高效率的性能使外源高效导入受体细胞繁殖性能使外源在受体细胞中高效扩增DNA噬菌体或大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl 噬菌体的生物学特性： 生物结构l 噬菌体由外壳包装蛋白和l

15、-DNA组成l-DNA全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61个约有20kb的区域为为噬菌体生长非必需的或被外源DN，可以段所取代。l 噬菌体生物学特性： 生物结构黏性末端cos溶菌头部晚期DNA阻遏l - DNA早期尾部阻遏重组删除与整合COS3CCCGCCGCGGA 55 TCCAGCGGCGGGG3COSDNA噬菌体或大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl 噬菌体生物学特性：周期E.coli裂解LamB受体吸附包装注入DNA噬菌体或大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl 噬菌体生物学特性：周期100个左右的拷贝包装范围为原DNA的75 - 105%即 36 - 51 kb体内包装DADNA噬菌体或大

16、肠杆菌的 l 噬菌体DNAl 噬菌体生物学特性： 溶原状态l噬菌体大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。人们可以根据需要改变l-DNA 或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于裂解状态DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态DNA噬菌体或大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有的外源DN段不大于2.5kb时，才能被包装成有当力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50

17、%的片段是和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：型载体取代型载体DNA噬菌体或大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度型载体位点体外包装载体长度 37 kb片段体外包装片段大小：0 - 14 kb（51 37）重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记。DNA噬菌体或大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度取代型载体载体长度 26 kb片段体外包装最小装载长度 10 kb（36 26）片段体外包装最大装载长度 25 kb（51 26）DNA噬菌体或大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点野生

18、型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1 - 2个同时，为了便于各种来源的DN些单一的酶切位点段的克隆，还需要增加一除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点DNA噬菌体或大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：加装选择标记与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记颜色反应类标记DNA噬菌体或大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：加装选择标记imm434l-噬菌体imm434编码一种进入溶菌

19、循环的阻遏物。含有完整标记的l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA活， l-重组透明斑到标记中，灭便进入溶菌循环，形成DNA噬菌体或大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：加装选择标记lacZ编码b-半乳糖苷酶lacZ能催化无色的X-gal生成化合物。当外源基到lacZ因中，灭活，不能化合物；而空载体l-DNA则产透明斑生DNA噬菌体或大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA重组l-DNA重组的体外包装：需在体外人工包装成有力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞了l噬菌体的大肠杆菌中提用于体外包装的蛋白质可直接从取，现已商品化。这些包装蛋白通常分

20、为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的DNA噬菌体或大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA及其重组的分离纯化：将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37培养1小时用新鲜培养基稀释继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒密度已达1013 -1014 / L，大肠杆菌细胞已完全裂解超速离心，沉淀噬菌体l-DNA苯酚抽提，乙醇或异丙醇沉淀l-DNADNA噬菌体或大肠杆

21、菌的 l 噬菌体DNAl-DNA作为载体的优点：l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量重组l-DNA重组l-DNA的筛选较为方便的提取较为简便l-DNA载体适合克隆和扩增外源DN外源段，但不适合表达第三节质粒是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。n 将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA是构建在体外仍被包装成有力的颗粒，这便质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白，因此重质粒（cosmid）质粒载体的构建：BamHITcrSalIPstIApr质粒是类人工构建的含有l-DNA cos序列和质粒特殊类型的载体cos site - carrying plasmid子的pHC796400 bp1978年Collins和Hohn发明构建ori1.8 kb的l-DN段 + pBR322片段l fragmentcos装载范围为31 - 45 kb质粒（cosmi