第八章蛋白质和氨基酸测定恢复

1、第八章蛋白质和氨基酸测定第八章蛋白质和氨基酸测定恢复恢复 第一节第一节 概述概述一、蛋白质的生理功能及在食品中的作用一、蛋白质的生理功能及在食品中的作用u蛋白质是生物界三大基础物质之一，是构成蛋白质是生物界三大基础物质之一，是构成生物体细胞组织的重要成分；生物体细胞组织的重要成分； u蛋白质是食品的主要成分和重要营养指标。蛋白质是食品的主要成分和重要营养指标。u蛋白质对食品的色、香、味及组织结构等具蛋白质对食品的色、香、味及组织结构等具有重要意义；一些蛋白质具有生物活性功能，有重要意义；一些蛋白质具有生物活性功能，是开发功能性食品原料之一。是开发功能性食品原料之一。二、食品中蛋白质含量及测定意

2、义二、食品中蛋白质含量及测定意义 测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。 在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说来动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。 第一节第一节 概述概述三、蛋白质的性质三、蛋白质的性质u蛋白质是复杂的含氮有机蛋白质是复杂的含氮有机化合化合物，分子量很大，大物，分子量很大，大部分高达数万部分高达数万 数百万数百万。u蛋白质蛋白质氨基酸通过氨基酸通过酰胺键酰胺键结合的高分子化合物；结合的高分子化合物；u所含的主要化学元素为所含的主要化学元素为C、H、O、N。 微

3、量元素微量元素FeFe、ZnZn、I I、CuCu、MnMn。区别其他有区别其他有机物的标志机物的标志u构成蛋白质的构成蛋白质的-氨基酸共有氨基酸共有20种。种。u必需氨基酸（必需氨基酸（EAA）为了维持机体的正为了维持机体的正常生长和健康，但人体不能合成或合成量不常生长和健康，但人体不能合成或合成量不能满足需要，必需从食物中摄取的氨基酸。能满足需要，必需从食物中摄取的氨基酸。u包括：赖氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、亮包括：赖氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸。氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸。uFAO/WHO推荐的氨基酸理想模式推荐的氨基酸理想模式 Lys:Va

4、l:Met:Try:Leu:Ile:Thr:Phe 胨胨肽肽氨基酸氨基酸v不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质含氮量不同。蛋白质的量与氮含量的关系用蛋白质系数表示。 v蛋白质系数每份氮素相当于的蛋白质的份数。一般蛋白质含氮量为16%，即MN/MPr=16%MPr= MN/16%=6.25 MN 蛋白质换算蛋白质换算系数系数 Fu根据被测食品种类选择不同的换算系数根据被测食品种类选择不同的换算系数 v与蛋白质和蛋白质检测有关的两个与蛋白质和蛋白质检测有关的两个重大食品安全事件重大食品安全事件阜阳奶粉事件阜阳奶粉事件 20042004年年5 5月，安徽省阜阳市对当地月，安徽省

5、阜阳市对当地20032003年年3 3月月1 1日以后出生、以奶粉喂养为主的婴儿进行日以后出生、以奶粉喂养为主的婴儿进行的营养状况普查和免费体检显示，因食用劣质的营养状况普查和免费体检显示，因食用劣质奶粉造成营养不良的婴儿奶粉造成营养不良的婴儿229229人，其中轻、中人，其中轻、中度营养不良的度营养不良的189189人人, ,因食用劣质奶粉造成营养因食用劣质奶粉造成营养不良而死亡的婴儿共计不良而死亡的婴儿共计1212人。人。国务院调查组通过卫生学调查证国务院调查组通过卫生学调查证实，实， 不法分子用淀粉、蔗糖等价格不法分子用淀粉、蔗糖等价格低廉的食品原料全部或部分替代乳低廉的食品原料全部或部

6、分替代乳粉，再用奶香精等添加剂进行调香粉，再用奶香精等添加剂进行调香调味，制造出劣质奶粉，婴儿生长调味，制造出劣质奶粉，婴儿生长发育所必需的蛋白质、脂肪以及维发育所必需的蛋白质、脂肪以及维生素和矿物质含量远低于国家相关生素和矿物质含量远低于国家相关标准标准 。三鹿奶粉事件 三聚氰胺是一种有机含氮杂环化合物三聚氰胺是一种有机含氮杂环化合物（C C3 3H H6 6N N6 6），是一种重要的化工原料。三聚氰胺的含），是一种重要的化工原料。三聚氰胺的含氮量很高（氮量很高（66%66%），按，食品中蛋白质的测定（凯氏），按，食品中蛋白质的测定（凯氏定氮法），乳制品的蛋白氮换算系数为，即定氮法），乳制

7、品的蛋白氮换算系数为，即1 1的蛋的蛋白氮含量，折算蛋白质含量为，这样加入白氮含量，折算蛋白质含量为，这样加入3 3三聚三聚氰胺就蛋白含量氰胺就蛋白含量“达标达标”了。了。 测定蛋白质的方法 一类是利用蛋白质的共性，即含氮量 、肽键和折射率测定蛋白质含量 ； 另一类是利用蛋白质中特定基团（氨基酸残基、酸性和碱性基团 以及芳香基团等）测定蛋白质含量。 凯氏定凯氏定氮法氮法 双缩双缩脲法脲法 方法方法紫外吸紫外吸收法收法福林福林-酚法酚法 第二节第二节 蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定（一）凯氏定氮法（一）凯氏定氮法l凯氏定氮法：总氮量凯氏定氮法：总氮量蛋白质换算系数蛋白质换算系数l测定结果：粗蛋

8、白（包含核酸、生物碱、含测定结果：粗蛋白（包含核酸、生物碱、含氮色素等非蛋白质氮化合物）氮色素等非蛋白质氮化合物）l适用范围：各类食品中蛋白质含量测定适用范围：各类食品中蛋白质含量测定l长期改进：常量法、半微量法和微量法等长期改进：常量法、半微量法和微量法等 1、常量凯氏定氮法、常量凯氏定氮法（1）原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中C和H被氧化为CO2和H2O逸出，而样品中的N转化为NH3，与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使NH3游离蒸出，用硼酸吸收后再以盐酸或硫酸标准溶液滴定。根据酸的消耗量，再乘以蛋白质换算系数，可计算出蛋白质的含量。 v反应分四个阶段：消化、蒸馏

9、、吸收、滴定（1 1）消化：）消化：2NH2(CH2)2COOH 13H2SO4 (NH4)2SO4 6CO2 12SO2 16H2O 浓硫酸的作用：浓硫酸的作用： 脱水作用使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。 氧化作用将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸被还原为二氧化硫：2H2SO4 +CCO2+2SO2+2H2O 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。v 加入硫酸钾的作用是：提高溶液沸点加入硫酸钾的作用是：提高溶液沸点而加而加快快有机物有机物的分解的分解（3383380 0C C 4004000 0C C） K K2 2SOSO4 4+H+

10、H2 2SOSO4 4=2KHSO=2KHSO4 4 2KHSO 2KHSO4 4=K=K2 2SOSO4 4+H+H2 2O+SOO+SO3 3v 加入硫酸铜的作用加入硫酸铜的作用 催化作用：加速有机物的氧化分解催化作用：加速有机物的氧化分解 C C 2CuSO4 Cu2CuSO4 Cu2 2SOSO4 4 SOSO2 2 COCO2 2 Cu Cu2 2SOSO4 4 2H2H2 2SOSO4 4 2CuSO 2CuSO4 4 2H2H2 2O O SOSO2 2消化完全指示：蓝绿色；消化完全指示：蓝绿色；消化炉消化炉(2(2） 蒸馏蒸馏 在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热

11、在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气蒸馏，即可释放出氨气 (NH(NH4 4) )2 2 SOSO4 4 + 2NaOH 2NH+ 2NaOH 2NH3 3 + Na + Na2 2SOSO4 4 + 2H + 2H2 2O O 蒸馏时碱性反应完全指示：变深蓝色或产生黑色沉淀蒸馏时碱性反应完全指示：变深蓝色或产生黑色沉淀(3)(3)吸收吸收用硼酸溶液，并加入混合指示剂，硼酸呈微弱酸性（用硼酸溶液，并加入混合指示剂，硼酸呈微弱酸性（K Ka1a1=5.8 =5.8 X 10X 10-10-10），与氨形成强碱弱酸盐，酒红色），与氨形成强碱弱酸盐，酒红色蓝绿色蓝绿

12、色(4)(4)滴定滴定 待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定, , 蓝绿色蓝绿色灰红色灰红色2 2、微量凯氏定氮法、微量凯氏定氮法（1 1）原理及适用范围同前）原理及适用范围同前（2 2）与常量法不同点：）与常量法不同点：加入硼酸量有加入硼酸量有50 ml 10 ml,50 ml 10 ml,滴定用盐酸浓度由滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L ,0.1 mol/L 0.01 mol/L ,可用微量滴定管。可用微量滴定管。凯氏自动定氮法凯氏自动定氮法 原理与上面一样，仪原理与上面一样，仪器，采用凯氏自动定氮仪：器，采用凯氏自动定氮仪：其装置内

13、具有自动加碱蒸馏其装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置，消以及自动数字显示装置，消化装置：由优质玻璃制成的化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶以及红外线装置凯氏消化瓶以及红外线装置的消化炉的消化炉。（二）双缩脲法（二）双缩脲法v 双缩脲的性质：当脲被小心地加热至双缩脲的性质：当脲被小心地加热至 150150160160时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成双缩脲，其与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色双缩脲，其与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应。的配合物，此反应称为双缩脲反应。

14、NH2CONH2 + NH2CONH2NH2CONHCONH2 + NH3（二）双缩脲法（二）双缩脲法1、原理 蛋白质分子中的肽键（CONH）与双缩脲结构相似，与碱性硫酸铜能形成紫红色络合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，在560nm处比色定量。 2、应用范围及特点v操作简单，灵敏度较低，生化领域中常用。v食品领域：可用于粮豆类（大米、油料、豆类等作物种子）和肉类等样品中蛋白质含量的测定。 3、操作方法、操作方法（1）标准曲线的绘制：取一定量的标准蛋白质样品）标准曲线的绘制：取一定量的标准蛋白质样品（如牛血清蛋白，先用凯氏定氮法测出蛋白质含量），（如牛血清蛋白，先用凯氏定氮法测出蛋

15、白质含量），标准曲线：吸光度标准曲线：吸光度-蛋白质含量。蛋白质含量。（2）样品测定：同法测定待测样品的吸光度，从标）样品测定：同法测定待测样品的吸光度，从标准曲线查出其对应的蛋白质浓度准曲线查出其对应的蛋白质浓度m。4、计算、计算)100/(1001gmgmm蛋白质含量（三）紫外线吸收法（三）紫外线吸收法（A280nm光吸收法）光吸收法）1、原理原理 蛋白质分子中存在着含有共轭双键的酪氨酸和蛋白质分子中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此，蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸色氨酸，因此，蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收峰在收峰在280nm处。在此波长范围，蛋白质溶液的光处。在此波长范围，蛋白

16、质溶液的光吸收值（吸光度）与其浓度成正比。吸收值（吸光度）与其浓度成正比。2、测定步骤、测定步骤绘制标准曲线绘制标准曲线样品测定样品测定查出查出Pr浓度浓度3、适用范围及特点、适用范围及特点适用于蛋白质浓度在适用于蛋白质浓度在0-1g/L范围样品的测定。范围样品的测定。操作简便、快速，低浓度盐类不会产生干操作简便、快速，低浓度盐类不会产生干扰。扰。待测样品所含的氨基酸与标准蛋白质中酪待测样品所含的氨基酸与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大、或含有嘌呤或嘧氨酸和色氨酸含量差异大、或含有嘌呤或嘧啶等物质时，测定结果有一定的误差。啶等物质时，测定结果有一定的误差。染料结合法染料结合法：原理：在特定

17、的条件下，蛋白质可与某原理：在特定的条件下，蛋白质可与某些染料定量的反应生成沉淀，用分光光些染料定量的反应生成沉淀，用分光光度计测定沉淀反应完全后剩余的染料量度计测定沉淀反应完全后剩余的染料量可计算出反应消耗的染料量，进而求得可计算出反应消耗的染料量，进而求得样品中蛋白质的含量。样品中蛋白质的含量。适用于牛乳、冰淇淋、乳酪、巧克力饮适用于牛乳、冰淇淋、乳酪、巧克力饮料等食品。料等食品。水杨酸比色法水杨酸比色法原理：样品中的蛋白质经硫酸消化而转原理：样品中的蛋白质经硫酸消化而转化成铵盐溶液后，在一定的酸度和温度化成铵盐溶液后，在一定的酸度和温度条件下可与水杨酸和次氯酸钠作用生成条件下可与水杨酸和

18、次氯酸钠作用生成兰色化合物，在兰色化合物，在660nm660nm处比色测定，求出处比色测定，求出样品的含氮量，进而计算出蛋白质的含样品的含氮量，进而计算出蛋白质的含量。量。（四）其他常用方法（四）其他常用方法v福林福林-酚比色法酚比色法；v考马斯亮蓝染料比色法；考马斯亮蓝染料比色法；v红外光谱法；红外光谱法；v比浊法；比浊法；v我的是毛线我的是毛线是棉线？是棉线？是毛线？是毛线？蛋白质灼烧时，会有烧焦羽毛的气味。蛋白质灼烧时，会有烧焦羽毛的气味。感知生活感知生活你对蛋白质知多少？你对蛋白质知多少？1、你知道怎么鉴别吗、你知道怎么鉴别吗?感知生活感知生活你对蛋白质知多少？你对蛋白质知多少？2、你

19、知道如何鉴定豆腐富含蛋白质吗、你知道如何鉴定豆腐富含蛋白质吗?浓硝酸浓硝酸呈黄色呈黄色第三节第三节 氨基酸的定量测定氨基酸的定量测定（一）甲醛滴定法（一）甲醛滴定法1、双指示剂甲醛滴定法、双指示剂甲醛滴定法(1) (1) 原理原理 氨基酸具有酸性的-COOH和碱性的-NH2。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，从而使其碱性消失，使-COOH显示出酸性，用碱标准溶液来滴定-COOH，并用间接的方法测定氨基酸的总量。方法特点及应用方法特点及应用 此法简单易行、快速方便。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏高；酪氨酸含有羟基，滴定时会消耗碱液使结果偏

20、高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果高。 特别适合浅色样品的测定（2 2） 操作方法操作方法 移取含氨基酸约2030mg的样品溶液2份。 中和游离酸（用中性红作指示剂，先测定其他游离酸的含量）：1份加入3滴中性红指示剂，用氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点；记录消耗的碱液ml数，V1 。 滴定氨态氮（用百里酚酞作指示剂测定氨基酸和游离酸的总含量）：另1份加入3滴百里酚酞指示剂+中性甲醛20ml，摇匀，静置1分钟，用氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点，记录消耗的碱液ml数，V2 。 （3 3）结果计算）结果计算X =(V2- V1)c0.014/m100X样品中氨基态氮的含量，

21、样品中氨基态氮的含量，%（g/100ml）c 氢氧化钠标准溶液的浓度，氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；V1用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准 溶液的体积，溶液的体积，mL；V2用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标 准溶液的体积，准溶液的体积，mL； m测定用样品溶液的质量（或体积），测定用样品溶液的质量（或体积），g(ml) 0.014氮的毫摩尔质量，氮的毫摩尔质量，g/m mol 说明及注意事项说明及注意事项1、此法适用于测定食品中游离的氨基酸2、固体样品应先进行粉碎，准确称取后用水萃 取， 50水浴中萃取

22、即可。液体样品可直接进行测定。3、若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。4、与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和-COOH 时的pH为，但分析结果稍偏低，即双指示剂法的结果更准确。2、电位滴定法、电位滴定法(1) (1) 原理原理 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用氢氧化氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判值判断和控制滴定终点。断和控制滴定终点。 -COOH被完全中和时，被完全中和时，pH值

23、约为。值约为。（2 2）操作方法）操作方法 取样取样m定容定容100ml取取20ml，加水，加水60ml 用碱滴定至用碱滴定至pH8.2加入甲醛加入甲醛10.0ml 用碱用碱滴定至滴定至pH9.2记录碱消耗体积记录碱消耗体积V1 空白试验：取水空白试验：取水80ml 碱消耗体积碱消耗体积V0（3 3）结果计算）结果计算100)100/20(014. 0)(01mcVVX磁力搅拌器磁力搅拌器v酸度计的使用操作规程酸度计的使用操作规程v调节开关调节开关v用缓冲溶液校正用缓冲溶液校正pHpH计计v清洗电极清洗电极 v吸干电极上面的水吸干电极上面的水 v把电极插入被测溶液中把电极插入被测溶液中v测定测

24、定 v清洗并擦干电极清洗并擦干电极（4 4）说明）说明v 甲醛的作用：固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性。v 若样品中含有铵盐，测定结果偏高。v 浑浊和色深样液不经处理可直接测定。v结果要求精密度10% ，即在重复条件下两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%。（二）茚三酮比色法（二）茚三酮比色法v原理：氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮生成蓝紫色化合物，其颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，在570nm处测吸光度进行定量。v操作方法 绘制标准曲线样品测定查出氨基酸质量样品溶液需澄清，通常采用活性炭脱色处理。（三）其他常用方法（三）其他常用方法v 邻苯二甲醛法邻苯二甲醛法v 三硝基苯磺酸法三硝基

25、苯磺酸法v （四）氨基酸的分离和测定（四）氨基酸的分离和测定v 1、薄层色谱法、薄层色谱法v 2、氨基酸自动分析仪法、氨基酸自动分析仪法v 3、气相色谱法、气相色谱法v 4、HPLC氨基酸自动分析仪分析氨基酸自动分析仪分析v食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，缬，蛋，异亮，亮，酪，苯丙，组，赖和精氨酸等16种氨基酸，其最低检出限为10pmol。v蛋白质氮和非蛋白质氮的测定蛋白质氮和非蛋白质氮的测定 样品溶液样品溶液+ +沉淀剂沉淀剂（Cu2+、Hg2+、Pb2+等）等） 过滤或离心过滤或离心 沉淀：蛋白