[精品]基因工程复习重点

1、基因工程的概念：利用 DNA体外重组或 PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分了，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程同裂酶（isoschizomer）来源于不同的生物，能识别相同顺序的限制酶同尾酶（isocaudamer）有些限制酶识别序列不同，但切割产生的末端是相同的Klenow片段：用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大肠杆菌 DNA聚合酶I而得到的该酶的大片段，称为 Klenow片段分子克隆载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。哺乳动物人工染色体

2、 （MAC ）:哺乳动物人工染色体指从哺乳动物细胞中分 离出 复制 起始区、端 粒以 及着 丝粒构 建而 成的 克隆 载体。它可 以克隆大 于OOOkb的外源DNA片段。酵母杂交系统载体：一类载体中存在一个DNA-结合序列（BD ），它与已知的钓饵序列融合；另一类载体则含有基因表达激活序列（AD ），它则与未知或已知的捕猎序列融合。细菌人工染色体 （BAC BAC:是基于大肠杆菌的 F质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌F因子（致育 因子）的严谨型控制的复制子 oriS （ Shizuyaetal. 1992 ）, 一个易于 DNA

3、复制的山 ATP驱动的解旋酶（RepE）以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA, parB ,和parC ）。装载片段 100 300kb。Pl人工染色体载体（PAC P1噬菌体载体的改造，结合了 P1噬菌体载体和BAC载体的 优点。克隆外源片断130-150kb酵母菌人工染色体 （YAC）广泛用于构建高等动植物基因组文库的构建，山YLp经适当改造 后构 建成pYAC载体。装载片段为 200 500kb。DNA寡核昔酸或 DNA片段（称 为探DNA芯片技术：DNA芯片（或基因芯片）是将许多特定的针）固定在芯片的每个预先设置的区域内，将待测样本标记后同芯片进行杂交分析，利用碱

4、基互补配对原理进行杂交，通过检测杂交信号并进行计算机分析，从而检测对应片段是否存在、存在量的多少，以及用于基因的功能研究和基因组研究、疾病的临床诊断和检测等众多方面基因组文库：含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分了的克隆总和cDNA文库：从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部mRNA经反转录成cDNA后再重组和增殖所产生的无性繁殖系的总和 限制性内切酶的识别特点：11绝大多数酶的识别序列是特异的，仅有少数有变动【2】识别序列一般为 4? 6个碱基对，一般都富含GC【3】大多数识别序列具有180。旋转对称的回文结构（Palindrome ）限制性内切酶的切割方式：【1】切点大多数在识别顺序

5、之内【2】少数在识别顺序之外DNA经限制酶切后，产生2种类型的末端：粘性末端（ sticky end ）和平整末端（blunt end）限制酶反应条件： DNA（DNA的纯度与甲基化程度）、限制酶、反应缓冲液（ Tris-Cl、NaCl、 Mg2+ ）、反应时间与温度：限制酶星反应：在变化的条件下，限制酶识别序列特异性降低限制性内切酶的分类：I型：识别特定序列，切割位点在距识别位点至少1000 bp处随机切割II型：识别特定序列并在识别位点处或附近切割III型：识别特定序列，切割位点在距识别位点3,端25? 27bp处随机切割DNA连接酶的特点：DNA连接酶广泛存在于各种生物体内，其催化的基本

6、反应是：将DNA双链上的相邻碱基的5' -P04和3' -OH共价结合形成3' -5'磷酸二酯键连接反应是一个吸能的反应，E.coli及其它细菌以 NAD为能源，动物及噬菌体以ATP为能源连接酶的最佳反应温度是 37° C,但在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此连接反应的温度一般在 4? 15°C基因工程中常用的 DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶2、限制酶产生的末端的连接【1】相同粘性末端的连接 1、由同一种限制酶产生的带相同突岀末端的两个片段2、由不同的限制酶酶切但带有相同突岀末端的两个片段2平整末端的连接1、平整末端可

7、直接进行连接，但连接效率比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多S1核酸酶：特异性降解单链DNA和RNA,在最适条件下，降解单链的速度比双链快75000倍。最佳pH 4.5核糖核酸酶 特异性降解 RNA用于除去DNA样品中的RNA分子RNase H 降解DNA-RNA 杂交分子中的 RNA 链用于cDNA文库建立时除去 RNA链以便第二条链 cDNA链的合成脱氧核糖核酸酶I （ DNase I）降解ss剂ds-DNA用途：制备 RNA样品时除去 DNA分子切口移位，制备 DNA探针01、5' 3' DNA聚合酶活性，要求 3' -OH的引物和模板 DNA 2、5

8、9; 3'核酸外切酶活性，具有 双链特异性3、3' -5'核酸外切酶活性，具有单链特异性，对ds-DNA的降解活性很低，是ss-DNA的过剩反应用途：除去3'-端突起的单链 DNA （在无dNTP时）；补齐5'-突起端合成第二条 cDNA ;切口 移位制备探针Klenow片段用途：用同位素标记具5,端突起的DNA片段末端；补平 5,粘性末端第二条cDNA链的合成；DNA序列测定标记基因的作用1 ）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞2 ）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。.标记基因的种类1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子

9、）a. 抗生素抗性基因： Apr , Ter , Cmr, Kanr, G418r, Hygr , Neorb, 重金属抗性基因：Cur , Znr , Cdr ； c.代谢抗性基因：TK,抗除草剂基因2）营养标记基因（可直接用于选择转化子）：主要是参与氨基酸，核昔酸及其他必需营养物合成酶类的基因，这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1, URA3, LEU2, HIS43） 生化标记基因其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ,GUS,CAT4）噬菌斑常用的遗传标记基因：1）四环素抗性基因（Ter）； 2）氨节青霉素抗性基因（ Apr）3）氯霉素抗性基因（Cmr） ；4）卡那霉素

10、（Kanr）,新霉素（Neor ）和G418抗性（G418r ）基因5） p半乳糖昔酶基因（lacZ和lacZa或lacZ，）； 6）葡萄糖昔酸酶基因（ GUS）7）荧光素酶基因；8）发光蛋白质基因穿梭载体范围：细菌一细菌（放线菌），细菌一酵母菌，细菌一真菌，细菌一动物表达型载体（expression vector）1）特点：a.基因的启动了序列和终止了序列；b. 一般无检测标记基因；c.克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）；d.重组分子用凝胶电泳检岀（依赖于分子量差异）。2） 结构：a.转化单元-宿主细胞转化；b.表达单元-外源基因表达3） 类型： I 型：转录起始区（调控序列+启动了）

11、+终止了II 型：转录起始区 +翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）+终止子III 型：转录起始区 +翻译起始区 +信号肽链编码区 +终止子（常称之为表达分泌型载体）4） 用途：a.表达外源基因以产生大量外源基因产物；b.用于构建cDNA文库5） 注意事项：a.启动子来源；b.终止子来源；c.启动子的启动效率；d.信号肽来源与结构；e.调控类型3. 失控型质粒载体 4.探针型载体 5 、定序型载体：主要用于核昔酸的序列测定6,整合型载体：结构与复制起点探针型载体相同，仅是用于不同目的，该类载体转化频率低，但转化体十分稳定。E.coli 克隆载体的种类1. 质粒载体一复制起点来自一些天然质粒

12、。2.噬菌体载体一入，P1和M13、fd载体，复制起 点来自噬菌体。 3. COS 质粒载体一质粒载体中插入 'cos 片段，以利于体外包装4. 噬粒载体（phagemid ） 一有质粒和 M13、fd的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制噬菌体X载体入噬菌体侵入菌体后，把自身 DNA 加进细菌 DNA 里（整合），作为细菌基因的一部分，随 菌 的细胞分裂而增殖，这种生活状态称为溶原（ lysogen ）。入噬菌体从溶原转为裂解是一 种可诱 导过程。 2、入噬菌体可以容纳较大的目的基因：基因文库构建常使用入载体；入噬菌体的缺陷：基因组太大（49kb）（ 2）酶切点太多野生型只能接纳一定长度

13、的DNA入噬菌体的改造：切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因去掉太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口增加标记基因（4）引入无义突变核酸包括 DNA 、 RNA 两种分了，在细胞中都是以与蛋白质结合的方式存在的真核生物 95%DNA 存在于细胞核内， 5%在细胞器75%的 RNA 存在于细胞质， 10%在核内， 15%在细胞器rRNA （80-85%） , tRNA 及核内小分了 RNA （ 10? 15%） , mRNA （1-5%）核酸分离提取的原则 1.保证核酸一级结构的完整性 2 .排除其它分子的污染质粒载体的分离与纯化关键：如何使质粒 DNA 与宿主染色体 DNA 分开碱变性法提

14、取质粒DNA的步骤：收集细胞沉淀一加入溶液I （50mM葡萄糖，25mMTris-HCI,10mM EDTA, 45mg/mL 溶菌酶）一加入溶液 II （0.2M NaOH, 1%SDS （在强碱性环境中暴 露 时间过长， cccDNA 可发生不可逆变性）一加入溶液 III （3M NaAc pH4.8 离心除去沉淀， 得 含质粒 DNA 的上清液一苯酚抽提去除蛋白质一乙醇沉淀收集质粒DNA染色体DNA的分离纯化关键：尽可能地保持其高分子量RNA的分离与纯化关键：防止内外源RNase的作用RNase 的特点：抗酸抗碱 , 具很广 pH 作用范围；抗高温严寒（ 0? 65°C 均具活

15、性， 100°C 也不能使之完全失活）；抗变性剂（变性剂只能使之暂时失活，去除变性剂后又可恢复活性）；酶活 性不需要辅助因子；存在范围广核酸贮存 ： DNA： 溶于 TE 中，放置于 4°C、 -20°C、 -70°CRNA： 溶于 0.3M NaAc （pH5.2）或ddH2O中，-70 °长期保存可以沉淀形式贮存于乙醇中，-20 °C凝胶电泳：脉冲场凝胶电泳、琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子杂交技术：Southern 杂交( DNA ) , Northern Blotting ( RNA ) , Western Blottin

16、g (蛋白质)PCR技 术一个标准的 PCR 反应体系( 50-100 P1)50 mmol/L KC1 ； lOmmol/L Tris-HCl ( pH=8.4)；1.5mmol/L MgC12 ；100 u g/ml 明胶或牛血清白蛋白( BSA )； 2 个引物，各 0.25 u mol/L ；dNTP=dATP+dCTP+dGTP+dTTP ）各 200u mol/L ；模板 DNA （人基因组 DNA ） 0.1-1 u g ； TaqDNA 聚合酶 2U ； Denaturation 94 °C, 0.5min ； Primer annealing 55 °C,

17、 1.5mion ；Extension 72 C, °Imin ； 30 cycles 变性（模板）一退火（引物与模板）一延伸（新合成 DNA 链） 建立基因组文库的一般程序1. 载体 DNA 片段的制备： DNA 分离纯化一限制酶切一脱磷酸化反应2. 供体 DNA 片段的制备：总 DNA 分离纯化一机械剪切法一分离特定大小 DNA 片段DNA 浓度和两种DNA 分了导入 宿3. 供体与载体 DNA 连接：要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA 分子的克分子比率4. 重组 DNA 分了的转移和基因组文库的扩增：利用转化或感染方法将连接 主细胞，让其自主复制，重组 DNA 分了

18、被扩增（重组了比率可能发生变化）5. 基因组文库质量的评价1）文库规模 - 随机挑取一些转化了或重组了，提取质粒DNA, 电泳测定插入片段大 小，然后根据上述公式计算文库大小。2 ） 重组频率 - 频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。 利用质粒载体构建基因组文库该法简单、快速、易于操作，但仅适合一些低等真核生物和原核生物。CDNA文库的特点：1.基因特异性；2.器官特异性；3.代谢或发育特异性处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同； 4. 不均匀性； 5.各 cDNA 均可获得表达（一般 选用的载 体都是表达型的）建立cDNA文库的一般程序：1.载体DNA片段的制备

19、；2.多聚（A） RNA的分离与纯化；3. 双链 CDNA 的合成： 1）单链 CDNA 的合成：反转录法；2）第二条cDNA的合成：碱解或酶解（ RNaseH）法除去 RNA分子cDNA 第一链的合成cDNA 第二链的合成 自身引导法：获得的双链 cDNA 5' 端会有几对碱基缺失 置换合成法：获得的双链 cDNA 5' 端也会有几对碱基缺失 引导合成 法：获得的双链 cDNA 能保留完整的 5'端序列4. ds- cDNA 与载体 DNA 相连1 ） 人工接头：要求具平端 ds- cDNA, 酶切时可能导致某些 cDNA 链断裂2） 同聚物加尾：可大大减少载体 DN

20、A 自身连接； 3） cDNA 的定向插入5. 重组 cDNA 分了的转移和文库的建立选用载体为质粒，可直接转化 E.coli ；若为入载体，则需进行体外包装、感染等。 获得基因的一般方法1. 化学合成方法：主要用于较小基因的合成，或需改变密码子的基因。2. 半化学合成法： mRNA 一 cDNA - 加人工接头或合成一段 DNA 与载体相连3. 筛选法：用于各种方法从基因组文库或 cDNA 文库中选择目的基因甲基化酶活性对限制酶活性的影响11 .dem 和 dam 甲基化酶对限制酶的影响（1）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还是边界重叠（2）不能抑制某些限制酶活性，不

21、管两者的识别顺序为何种重叠2 II型甲基化酶对限制酶活性的影响（1）抑制同种限制酶的活性（2）抑制不同种限制酶的活性（3）抑制不同种限制酶的部分活性甲基化酶的用途（1 ）改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成（2 ）在建立基因文库时，可先使 DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切分子克隆载体的功能：为外源基因提供进入受体细胞的转移能力；为外源基因提供在受体细胞的复制能力或整合能力；为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力载体特点：1至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。2. 至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。3. 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组D

22、NA分了是否进入宿主细胞分子克隆载体的转化频率和稳定性.影响转化频率的因素：1）复制起点类型：尽可能选择高拷贝复制起点2）标记基因：尽可能选择局效表达的标记基因影响稳定性的因素：1）复制起点类型一低拷贝载体稳定，高拷贝载体稳定性差2）选择压力3）载体在宿主细胞中的状态一自主复制型和整合型；4）宿主细胞的遗传特性和生理特性质粒的特点：1）质粒DNA复制与染色体复制无关 2）质粒DNA以超螺旋形式存在 3）质粒DNA 可以接合转移 4）质粒的不相容性和不相容群5）质粒 DNA的消除一化学和物理法仆丫嚏染料，EtBr,高温等）6）质粒的整合一 F因子又可整合到 E.coli染色体中质粒DNA的类型：

23、接合型和非接合型；含大肠杆菌素Col质粒和含抗菌；素抗性基因的R质粒；F因子和F'因子等。cos质粒载体优点i.容量大（可达45 kb），用于基因簇的克隆ii.形成的重组DNA分了可进行体外包装，并能感染E.coli细胞iii.操作简便，可直接转化细胞 iv.对重组DNA分子长度具有选择性包装 遗传标 记：与质粒载体相同，利用抗生素抗性选择转化了革兰氏阳性菌 （G+）克隆载体1. 枯草杆菌克隆载体1） B.subtilis作为宿主菌的优点i.芽抱形成过程可用于阐明细胞发育过程ii.遗传背景较清楚，可直接导入外源 DNA iii,非致病细菌，因而安全iv.研究结果可用于其它芽泡杆菌v.存

24、在各种分泌蛋白质2）B.subtilis作为宿主菌的缺点i .存在多种蛋白酶基因和相应产物ii.外源DNA导入细胞后不稳定，易发生重组反应核酸提取的基本要求：尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；减少化学因素对核酸的降解（过酸、过碱）；减少物理因素对核酸的降解（机械剪切力、高温）；防止核酸的生物降解提取核酸的?般程 序:破碎细胞去除与核酸结合的蛋白质及多糖等一去除其它核酸分子一淀核酸，去除盐灯有机溶剂等杂质纯化核酸核酸的质量评估（电泳、D260/OD280,酶切）DNA序列分析1.双脱氧核昔酸链终止法Sanger法双脱氧（2 3，）-核昔酸可以象 2-脱氧核昔酸那样直

25、接掺入新合成的DNA链中，但因3'端不具0H基，DNA链合成至此中断。山于双脱氧核吾酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的 DNA片段测定岀核昔酸序列2. Maxam-Gilbert 化学法原理： DNA 链上的不同碱基可以和碱基修饰剂发生反应，然后发生 1? 2 个碱基的脱落 或 取代，最后发生链断裂，不同位置断裂的 DNA 分子经凝胶电泳就可确定其核昔酸序列 化学法 测序的一大优点是不需要模板，弓I物和DNA聚合酶。待测 DNA链的检测用32P末端标记引物设计的一般原则 : ：引物的长度常为 17? 30； GC 含量为 40%? 60%； Tm 值高于 55 &#

26、176;C； 两条引物间配对碱基数小于 5 个；引物自身配对（特别是在引物的3'端）形成的茎环结构，茎的碱基配对数不大于 3 （通常采用计算机辅助设计）建立cDNA文库的一般程序：1.载体DNA片段的制备；2.多聚（A） RNA的分离与纯化3. 双链 cDNA 的合成： 1）单链 cDNA 的合成：反转录法2）第二条cDNA的合成：碱解或酶解（ RNaseH）法除去 RNA分子cDNA 第一链的合成； cDNA 第二链的合成自身引导法：获得的双链 cDNA5 ;端会有几对碱基缺失；置换合成法：获得的双链 CDNA5' 端也会有几对碱基缺失；引导合成法：获得的双链 cDNA 能保

27、留完整的 5'端序列4. ds- cDNA 与载体 DNA 相连： 1）人工接头：要求具平端 ds-cDNA, 酶切时可能导致某些cDNA 链断裂 2）同聚物加尾：可大大减少载体DNA 自身连接 3） cDNA 的定向插入5. 重组 cDNA 分了的转移和文库的建立选用载体为质粒，可直接转化 E.coli ；若为入载体，则需进行体外包装、感染等。 基因的筛选方法1. 遗传互补法 优点：简便，快速，可靠，是首选方法。获得的基因一定是完整基因。缺点：适用范围较窄。 必备条件：外源基因不仅能在受体细胞表达，而且必须具备生物学活性。分离步骤分离基因组文库重组 DNA 分子一转化适当宿主细胞一涂

28、布在选择培养基上一随机挑选阳性克隆，分离重组 DNA 分子一再转化相同受体细胞一高频转化子一基因的进一步证实和鉴定2. 核酸杂交法原理：利用核酸探针与待分离 DNA 的同源序列可进行杂交的特点分离目的基因（同源序列不是完全相同序列）优点：不需要基因表达必备条件：合适的核酸探针或有关资料，外源 DNA 能在宿主细胞中扩增 分离步骤：基因（基因组或 cDNA ）文库一制备 DNA 样品膜一与标记探针杂交一杂交斑点（阳性克隆）一分离重组 DNA 分子一作斑点杂交 阳性克隆 Southern 杂交以确认杂交 结果一 DNA 进一步证实和鉴定：核酸序列分析，与蛋白质一级结构比较；分离插入片段进行基因表达，用免疫方法或其他方法检测表达产物3. 免疫法原理：外源 DNA 引人宿主细胞后表达出蛋白质，以此为抗原与相应的抗体发生免疫反应, 然后利用二抗与一抗反应，用二抗偶联的酶反应筛选目的DNA优点：不依赖于基因表达产物的生物学活性 , 只要抗原决定序列能被正确表达。分离步骤：基因文库一蛋白质样品膜制备一免疫法筛选一有色斑点（阳性克隆）一进