乳猪料用原料检测方法

1、第一部分:乳猪料用原料检测方法 山东六和集团技术部编辑 2006-01-05目 录1: 饲用玉米脂肪酸值的测定2: 油脂碘价的测定3: 油脂的酸价及过氧化值的测定4: 鱼粉中酸价的测定5: 乳清粉中乳糖的测定.6: 油脂TBA值的测定方法.7: 呕吐毒素(DON)的检测ELISA法.8: 黄曲霉毒素的测定ELISA法.9: 鱼粉中组胺的测定.10:挥发性盐基氮的测定(VBN).11:饲料中免疫球蛋白lgG的测定.12:玉米副产品中二氧化硫残留量的测定.13:鱼粉中脲醛聚合物的鉴别.14:谷物中淀粉含量的测定.15:次粉中泥沙及矿物质的测定.16:镜检过程中的定性实验(鱼粉、肉骨粉、玉米蛋白粉、

2、豆类蛋白粉、大米蛋白粉)17:淀粉糊化度分析方法.18:大豆制品中尿素酶活性分析方法(PH增值法).19:油脂定性试验.20:乳糖测定附表.一.饲用玉米脂肪酸值的测定1.试剂：1.1 KOH乙醇标准溶液C(KOH)=0.01mol/L取KOH溶液C(KOH)=0.1mol/L 100ml，用乙醇（95%）稀释到1 升，然后按GB601标定。1.2 酚酞指示剂：2g/l乙醇溶液1.3 无水乙醇2 步骤：将平均样品按四分法制得约80g样品粉碎，过0.45mm孔径筛（40目），立即称取10g样品（精确到0.01g），于150ml具塞三角瓶内，加50ml无水乙醇，加塞振动10分钟，过滤，并用无水乙醇洗

3、3次，每次15ml，然后加酚酞3滴，用0.01mol/lKOH乙醇标准溶液滴定到溶液呈微红色，同时取90ml乙醇作空白。3计算：脂肪酸值(mgKOH/100g)按下式计算（V-V0）×C×56.1脂肪酸值= ×100 m 式中：V-样品耗碱标准溶液的体积，mlV0空白耗碱标准溶液的体积，mlC-KOH标准滴定溶液的浓度，mol/lm-样品质量,g二、油脂碘价的测定1 试剂与溶液1.1 韦氏液的配制：称取三氯化碘7.9g和纯碘8.7g分别溶于冰乙酸中，合并两液，再用冰乙酸稀释至1L，贮于棕色瓶内。1.2 KI溶液 150g/L1.3硫代硫酸钠标液滴定溶液C（NaS2

4、O3）=0.1mol/L）1.4 三氯甲烷CHCl3 AR2.步骤：按附表称取试样（准确至0.0002g）于干燥的碘量瓶中，加20ml CHCl3溶解试样，加25.00ml韦氏液立即加塞，以KI溶液封口，摇匀后，在20±5条件下，置黑暗处30min（碘价在130以上时放置1h），到时立即加入KI溶液20ml和水100ml,用C（NaS2O3）=0.1mol/L）硫代硫酸钠标液滴定至浅黄色时，加入1ml 5g/L淀粉指示剂，滴定至兰色消失。同样条件做空白两个，取平均值。结果的表示和计算：碘价按下式计算碘价=×100 式中：V1试样消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积；mlV2空白消耗

5、硫代硫酸钠标准溶液的体积；mlC-硫代硫酸钠标准溶液的浓度；mol/Lm-试样的质量；g0.1269与1.00ml硫代硫酸钠标准溶液(C（NaS2O3）=1.000mol/L)的相当的以克表示的碘的质量。附表：碘价数值与试样用量碘价试样用量范围（g）碘价试样用量范围（g）200.84611.58651200.21150.2644400.63460.79351400.18130.2266600.42310.52881600.15870.1983800.31730.39661800.14100.17621000.25380.31732000.12690.1586三、油脂的酸价及过氧化值的测定一.油

6、脂的酸价的测定：1 试剂与溶液1.1乙醚-乙醇溶液（2+1）配制时加入酚酞，并用碱调至中性1.2 NaOH标准滴定溶液C（NaOH）=0.1mol/L1.3酚酞指示剂 1g/L2 步骤将需用的锥形瓶烘干；分别移取油脂上层、中层、下层液各12ml置于烘干的锥形瓶中精密称量。加入50ml乙醚-乙醇溶液使其溶解，可以微热，加入酚酞指示剂3-5滴,然后用NaOH标准溶液进行滴定至粉红色，且1分钟不褪色为终点。同时做空白计算：酸价(mgKOH/g)按下式计算酸价=C×(V-V0 )×56.1/m式中： CNaOH标准溶液的浓度；mol/LV消耗标准溶液的体积；mlm样品的重量；g 5

7、6.1与1.00mlC（NaOH）=1.000mol/L相当的以mg表示的KOH的质量。说明： 酸价是指中和1.0g油脂所含游离脂肪酸所需KOH的毫克数,同一种油若酸价高，表明油脂因水解而产生更多的游离脂肪酸。二.油脂的过氧化值的测定1.原理：油脂氧化过程产生过氧化物，与KI作用，生成游离碘，以淀粉作指示剂，用硫代硫酸钠标准溶液滴定。2试剂与溶液2.1三氯甲烷冰乙酸的混合液（4+6）2.2硫代硫酸钠标准滴定溶液C（Na2S2O3）=0.01mol/L2.3淀粉指示液10g/L2.4碘化钾KI AR3 步骤：称取2- 3g(准确到0.0002g)混匀的样品，置于250ml烘干的碘量瓶中，加入30

8、ml三氯甲烷冰乙酸（4+6）的混合液，使样品完全溶解，加入约2g的碘化钾，紧密塞好瓶塞，并轻轻振摇30秒钟，然后在暗处放置3分钟，取出加100ml水，摇匀，立即用的硫代硫酸钠标准溶(C（Na2S2O3）=0.01mol/L)液滴定至淡黄色时，加1ml淀粉指示液（10g/L），继续滴定至兰色消失为终点，同样条件做空白。4计算：过氧化值（I2%）按下式计算过氧化值（I2%）=（V1V0）×C×0.1269×100/m式中： V1-样品消耗硫代硫酸钠的体积；mlV0-空白消耗硫代硫酸钠的体积；mlC-硫代硫酸钠标准溶液的浓度；mol/Lm-样品的重量；g 0.1269与

9、1.00mlC（Na2S2O3）=1.000mol/L相当的以克表的I2的质量 g5 过氧化值二种单位的换算:meq/kg = I2 % * 78.9四、鱼粉中酸价的测定1 试剂与溶液1.1乙醚-乙醇溶液（2+1）配制时加入酚酞，并用碱调至中性1.2 NaOH标准滴定溶液C（NaOH）=0.05mol/L1.3酚酞指示剂 1g/L2.步骤 称取23g（准确到0.0002g）鱼粉于干燥带塞的三角瓶中，加40ml乙醚与乙醇（2+1）混合溶液，在振荡器上振摇30min，干过滤于150ml三角瓶中，并用少量乙醚乙醇溶液洗涤三角瓶三次，加3滴的酚酞，用氢氧化钠标准溶液C（NaOH）=0.05mol/L滴

10、定至粉红色，半分钟内不褪色为终点，同样条件做空白。3.结果的表示和计算：酸价（mgKOH/g）按下式计算酸价（mgKOH/g）= 式中：CNaOH标准滴定溶液的浓度；mol/LV鱼粉消耗标准溶液的体积；mlV0空白消耗标准溶液的体积；mlm鱼粉样品的质量；g56.1与1.00mlNaOH标准滴定溶液C（NaOH）=1.000mol/L相当的以mg表示的KOH的质量。mg五、乳清粉中乳糖的测定1 试剂与溶液1.1酒石酸铜甲液：34.639gCuSO4溶于水，加入0.5ml浓H2SO4，稀释到500ml。 酒石酸铜乙液：173g酒石酸钾钠，加50gNaOH，稀释到500ml。1.2 氢氧化钠溶液c

11、(NaOH)= 1mol/L1.3硫酸铁溶液 50g/L1.4高锰酸钾标准滴定溶液c（1/5 KMnO4）=0.1mol/L2 步骤：称2g样品（准确到0.0002g）于200ml烧杯中，加50ml水，电炉加热到80，加酒石酸铜甲液10ml，加NaOH（1mol/L）5ml，搅拌后放置到室温，用水定容于250ml容量瓶中，摇匀，静止1h后干过滤。吸取滤液25.00ml于三角瓶中，加25ml酒石酸铜甲液，再加25ml酒石酸铜乙液，在电炉上加热并煮沸2min（要保证在3min内煮沸），取下过滤，并用水洗涤沉淀45次，之后将滤纸及沉淀物（Cu2O）一起放入三角瓶中，加入硫酸铁（50g/L）25ml，

12、再加25ml水，用玻璃棒搅拌并微热到看不到Cu2O的红色为止，然后用高锰酸钾标准滴定溶液(c（1/5 KMnO4）=0.1mol/L)的标准溶液滴定到呈微红色为终点。同样条件做空白3.结果的表示和计算：乳糖含量按下式计算Cu2O=（V-V0）×C×71.54由Cu2O的质量查表求乳糖的质量m乳：样品中乳糖的含量:乳糖%=m乳/m样×100式中： m乳样品中乳糖的质量；gm样-样品的质量；V-样品消耗KMnO4的体积；mlV0-空白消耗KMnO4的体积；ml71.54常数；C-KMnO4标准溶液的浓度，mol/L六、油脂TBA值的测定方法原理：油脂受到光、热、空气中

13、氧的作用，发生酸败反应，分解出醛、酸之类的化合物。丙二醛就是分解产物的一种，它能与硫代巴比妥酸(TBA)作用生成粉红色化合物，在532nm波长处有吸收高峰，利用此性质即能测出丙二醛含量，从而推导出油脂酸败的程度。1 试剂2.1硫代巴比妥酸(TBA)水溶液：准确称取TBA 0.288g溶于水中，并稀释至100ml（如TBA不易溶解，可加热至全溶澄清，然后稀释至100ml），相当于0.02mol/L；2.2 三氯乙酸混合液：准确称取三氯乙酸（分析纯）7.5g及 0.1g EDTA，用水溶解，稀释至100.00ml；2.3 氯仿（分析纯）；2.4 丙二醛标准溶液：称取0.315g 1，1，3，3-四

14、乙氧基丙烷，溶解后稀释至1000.00ml，此溶液每ml相当于丙二醛100g，置于冰箱内保存。准确吸取10ml，稀释至100.00ml，此溶液每ml相当于丙二醛10微克(g)，备用。2 操作步骤3.1标准曲线的绘制准确吸取每ml相当于丙二醛10g的标准溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml置于纳氏比色管中，加水至总体积为5ml，加入5ml TBA溶液，然后按样品测定步骤进行，测得光密度绘制标准曲线。3.2样品测定：准确称取融化均匀的油脂样品5.0g，置于100ml具塞三角瓶内，加入50.0ml三氯乙酸混合液，振摇半小时（保持油脂融溶状态，如冷结可在70水浴上略微加热使之

15、融化后继续振摇）用双层滤纸过滤，除去油脂。滤液重复用双层滤纸过滤一次。准确移取上述滤液5.0ml置于25ml比色管内，加入5.0 mlTBA溶液，混匀，加塞，置于90水浴内保温40min，取出，冷却1h，移入小试管内，离心5min，上清液倾入25ml纳氏比色管中，加入5.0ml氯仿，摇匀，静置，分层，吸出上清液于532nm波长比色，对照标准曲线得到微克数（同时作空白试验）。3 计算丙二醛含量（mg/kg）按下式计算 丙二醛含量（mg/kg）=式中:C-从标准曲线查得丙二醛的微克数(ug) m-样品质量（g）七、呕吐毒素(DON)的检测ELISA法测试前请仔细阅读本说明在28冷藏不要冻结1.简介

16、 DON毒素脱氧瓜萎镰菌醇（DON，）是单端孢菌素烯烃中的一种，它通常是由生长在谷类物品（如小麦、玉米、大麦和秣草）霉菌镰红菌素生成的。脱氧瓜萎镰菌醇的毒性效应包括：呕吐、不想进食、胃肠炎、腹泻、免疫抑制和血液病。研究表明猪对脱氧瓜萎镰菌醇很敏感。当脱氧瓜萎镰菌醇含量1ppm时，它们就拒绝进食。其毒性也会对其他物种产生毒性效应，各种物种对脱氧瓜萎镰菌醇的敏感性各不相同。研究表明脱氧瓜萎镰菌醇会使已加工食物发生问题，包括使可吃的谷类制品产生臭味、对生面团质量产生负面影响。因此，精确测定可能含有脱氧瓜萎镰菌醇的食物和食品就现得十分重要。FDA（美国食品和药品管理局）已经制定了脱氧瓜萎镰菌醇含量的强

17、制标准。美国食品药物管理局已经颁布的DON毒素建议限量如下：适用对象限量物质人1 ppm麦制品(面粉、麸和胚芽)反刍动物牛肉饲养的牛和鸡10 ppm 在<50%的食入量(全食入量时为5ppm)所有谷物及其副产品猪5 ppm 在<20%的食入量(全食入量时为1ppm)所有谷物及其副产品所有其它动物5 ppm 在<40%的食入量(全食入量时为2ppm)所有谷物及其副产品2.方法原理本测试盒的测试原理是一种竞争性的直接酶联免疫吸附剂测试方法（ELISA），可准确检测出样品中ppm级的DON毒素。样品和标准控制液中游离的DON毒素与轭合物中的DON毒素竞争抗体结合位置。清洗后，加入底

18、物，底物与轭合物反应出现兰色，兰色越深表明DON毒素越少。将其置于微型孔阅读器中可读出透光度，以控制标准液的透光度作标准曲线，将样品的透光度与标准曲线比较计算出样品中DON毒素的准确浓度。 3.贮存要求本试剂盒存放在28时，可以一直使用到标签上注明的到期日期。4.试剂与仪器4.1已提供的材料1. 48个包被了抗体的孔。2. 48个红色标记的混合孔。3. 5瓶1.5ml浓度为0、0.25、0.5、1、3 ppmDON毒素控制标准液(黄色标签) 。4. 1瓶DON毒素-HRP轭合物溶液(兰色标签)。5. 1瓶24ml底物溶液(绿色标签)。4.2需要但未提供的材料1 提取材料：a. 蒸馏水或去离子水

19、。b. 100ml量筒c. 150ml的具塞三角瓶d. 滤纸e. 样品收集具塞试管f. 漏斗2. 粉碎机3. 称量为525克的秤4. 带450nm滤光片的微型孔阅读器5. 200l移液器6. 200l吸咀7. 纸巾或等效的吸水材料8. 计时器9. 防水记号笔10. 洗瓶11. 移液器用的试剂槽12. 蒸馏水或去离子水13. C（1/2H2SO4）=1mol/L的硫酸终止液5.注意事项1. 本测试盒不使用时应在28下存放。2. 不要使用过期的测试盒。3. 不要把不同测试盒中的试剂混合使用。4. 遵守正确的移液技术，包括取液前先用该液润洗一次。5. 放置时间与本说明不一致时，可能会出现错误的结果。

20、6. 测试盒应先恢复到室温状态(1830)后才开始使用。7. 避免测试盒在室温下长时间放置。8. 不要使测试盒冻结。9. 待测样品的pH值应为68。酸碱过大的样品应进行调整。应将包括样品提取液在内的所有废液和实验器皿进行处理（如同已被DON毒素污染一样）。应始终穿戴手套和其它防护服。10. 为了避免交叉污染，每个样品应使用清洁的吸咀和玻璃器皿，并在样品之间彻底清洗所有的玻璃器皿。6.程序性的提示底物：底物随时可用，底物为清亮的浅兰色，如果变成了深兰，则弃去。使用时，只倒出所需量到试剂槽中，未用完的不要再倒回试剂瓶中。不使用时应盖住试剂槽，以避免光的照射。7.操作步骤7.1样品制备和提取1.待测

21、样品应按公认的采样技术采集。样品应磨碎并充分混合后再提取。测试前，将样品在28存放。2.将30ml硫酸缓缓注入1000ml水中，冷却摇匀，配成的硫酸(C（1/2H2SO4）=1mol/L)终止液。3.取1份代表性样品。研磨样品至至少有75%的样品通过20目的筛子，颗粒尺寸大约相当于细的速溶咖啡。4.将10克研磨过的样品加入50ml 水或去离子水中，用手或震荡器剧烈混合15分钟。 5.将静置2-3分钟，使一些物质沉淀下来。6.用滤纸过滤出至少5ml的提取液。收集该滤液即为样品的待测液。7.2测试程序测试前应将所有的试剂恢复至室温（1830）。1.从箔包中取红色标记的混合孔，放在孔架上。2.取同样

22、数量的包被了抗体的孔。把暂不使用的孔放回到箔包中，并重新密封，以保护抗体。在带子的一端标上“1”，然后放到孔架上，将有标记的一端放在左边。不要在孔的里面和底部写标记。3.在使用之前摇动试剂瓶，混合每种试剂。4.从兰色标签的瓶内吸取100l轭合物加到每个红色标记的混合孔内。 5.每次使用新吸咀，吸取100l控制标准溶液和样品液按下列顺序加到红色标记的混合孔内6 用移液器吸入、排出3次使孔内溶液彻底混合，吸取100l加到相应的包被了抗体的孔内，在平的表面上将板前后滑动确保充分混合1020秒钟，不要溅出试剂，混合后于室温下（1830）放置5分钟。弃去红色标记孔。7倒掉包被了抗体孔内的溶液。在每个孔内

23、加满蒸馏水或去离子水，再倒出，如此重复5次，将板朝下，在吸水材料上拍击以去除所有的水滴。8从绿色标签试剂瓶中倒出所需量的试剂到绿色试剂槽中。9用移液器和新吸咀，吸取100l底物加到每个孔内，在平的表面上将板前后滑动确保充分混合1020秒钟。10混合后放置2.5分钟。11从试剂瓶中倒出所需量的硫酸(C（1/2H2SO4）=1mol/L)终止液到试剂槽中。12吸取100l终止液加到每个孔内，在平的表面上将板前后滑动确保充分混合。13用干净的布擦净板底，将板置于微型孔阅读器于450nm滤光片下读数。由于气泡会影响结果，应削除溶液中气泡。应在加入红色终止剂后20分钟内完成读数。14用Log/logit

24、软件计算结果。8.特性参数检出限：0.1 ppm(10次阴性样品的平均值加2倍标准偏差)。定量检测限：0.25 ppm(以标准曲线的最低浓度点表示)。定量范围：0.25-2.5 ppm(大于2.5 ppm时,见样品制备和提取程序)八、黄曲霉毒素的测定ELISA法测试前请仔细阅读本说明在28冷藏不要冻结1.简介 黄曲霉毒素黄曲霉毒素是一种剧毒且致癌的物质，它是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌A的某些菌株产生的。黄曲霉毒素有四种类型：B1，B2，G1和G2。黄曲霉毒素B1是毒性最大且最常有的。最容易产生黄曲霉毒素污染的物质是谷物、花生、棉子、高梁和大多数的树果。动物食入过量黄曲霉毒素的影响从慢性健康直到死亡

25、，已经证明黄曲霉毒素能引起肝损坏或癌症、降低奶和蛋的产出、免疫抑制和干扰再生效率。美国食品药物管理局已经规定了食品和饲料中最大黄曲霉毒素限量。因此，准确测定黄曲霉毒素的含量，对于监测可能发生黄曲霉毒素污染的食品和饲料的质量来说，是非常重要的。测试程序包括仔细的采样、化学提取、卫生学评价和定量分析。美国食品药物管理局已经颁布的黄曲霉毒素限量如下：适用对象限量物质人20ppb除牛奶外的所有食品所有动物20ppb所有饲料（下列除外）除外：种牛，种猪，成熟的家禽100ppb谷物育肥期的猪（100磅）200ppb谷物育肥期的菜牛300ppb谷物育肥期的菜牛、猪、家禽300ppb棉籽粉2.方法原理本测试盒

26、的测试原理是一种竞争性的直接酶联免疫吸附剂测试方法（ELISA），可准确检测出样品中ppb级的黄曲霉毒素。样品和标准控制液中游离的黄曲霉毒素与轭合物中的黄曲霉毒素竞争抗体结合位置。清洗后，加入底物，底物与轭合物反应出现兰色，兰色越深表明黄曲霉毒素越少。将其置于微型孔阅读器中可读出透光度，以控制标准液的透光度作标准曲线，将样品的透光度与标准曲线比较计算出样品中黄曲霉毒素的准确浓度。 3.贮存要求本试剂盒存放在28时，可以一直使用到标签上注明的到期日期。4.试剂与仪器4.1提供的材料4.1.1 48个包被了抗体的孔。4.1.2 48个红色标记的混合孔。4.1.3 4瓶1.5ml浓度为0、5、15、

27、50ppb黄曲霉毒素控制标准液(黄色标签)（甲醇溶液的处理，见注意事项）。4.1.4 1瓶7ml黄曲霉毒素-HRP轭合物溶液(兰色标签)。4.1.5 1瓶24mlK兰底物溶液(绿色标签)。4.1.6 1瓶32ml红色 (红色标签)。4.2需要但未提供的材料4.2.1 提取材料：a. 70%甲醇溶液b. 100ml量筒c. 150ml的具塞三角瓶d. 滤纸e. 样品收集具塞试管f. 漏斗4.2.2 粉碎机4.2.3 称量为525克的秤4.2.4 带450nm滤光片的微型孔阅读器4.2.5 200l移液器4.2.6 200l吸咀4.2.7 纸巾或等效的吸水材料4.2.8 计时器4.2.9 防水记号

28、笔4.2.10 洗瓶4.2.11 移液器用的试剂槽4.2.12 蒸馏水或去离子水4.2.13 硫酸终止液C（1/2H2SO4）=1mol/L5.注意事项5.1 甲醇易燃，其容器应密闭并远离热、火花、明火和烟。如果吞下或吸入蒸气，它是有毒的。应避免与皮肤接触。5.2 本测试盒不使用时应在28下存放。5.3 不要使用过期的测试盒。5.4 不要把不同测试盒中的试剂混合使用。5.5 遵守正确的移液技术，包括取液前先用该液润洗一次。5.6 放置时间与本说明不一致时，可能会出现错误的结果。5.7 测试盒应先恢复到室温状态(1830)后才开始使用。5.8 避免测试盒在室温下长时间放置。5.9 不要使测试盒冻

29、结。5.10应将包括样品提取液在内的所有废液和实验器皿进行处理（如同已被黄曲霉毒素污染一样）。应始终穿戴手套和其它防护服。5.11为了避免交叉污染，每个样品应使用清洁的吸咀和玻璃器皿，并在样品之间彻底清洗所有的玻璃器皿。5.12待测样品的pH值应为68。酸碱过大的样品应进行调整。关于pH值的调整，请与Neogen代表或技术服务部门联系。6.程序性的提示K-兰底物随时可用，底物为清亮的浅兰色，如果变成了深兰，则弃去。使用时，只倒出所需量到试剂槽中，未用完的不要再倒回试剂瓶中。不使用时应盖住试剂槽，以避免光的照射。7.操作步骤7.1样品制备和提取待测样品应按公认的采样技术采集。样品应磨碎并充分混合

30、后再提取。测试前，将样品在28存放。按以下程序进行：1 将7份分析级甲醇与3份蒸馏水或去离子水混合配成70%的甲醇溶液。2 将30ml硫酸缓缓注入1000ml水中，冷却摇匀，配成硫酸(C（1/2H2SO4）=1mol/L) 的终止液。2 取1份代表性样品。研磨样品至至少有75%的样品通过20目的筛子，颗粒尺寸大约相当于细的速溶咖啡。3 把5克研磨过的样品加入到25ml 70%的甲醇中，然后用力摇动15分钟。4 用滤纸过滤出至少5ml的提取液。该滤液即为样品的待测液。5 该待测液即可用于测试。7.2测试程序测试前应将所有的试剂恢复至室温（1830）。1.从箔包中取红色标记混合孔，放在孔架上。2.

31、取同样数量的包被了抗体的孔。把暂不使用的孔放回到箔包中，并重新密封，以保护抗体。3.在使用之前摇动试剂瓶，混合每种试剂。4.从兰色标签瓶内吸取100l轭合物加到每个红色标记的混合孔内。弃去吸咀。5.每次使用新吸咀，吸取100l控制标准溶液和样品液按下列顺序加到红色标记的混合孔内 6.用移液器吸入、排出3次使孔内溶液彻底混合，吸取100l加到相应的包被了抗体的孔内，在平的表面上将板前后滑动确保充分混合1020秒钟，不要溅出试剂，混合后于室温下（1830）放置2分钟。7.倒掉包被了抗体孔内的溶液。在每个孔内加满蒸馏水或去离子水，再倒掉，如此重复5次，将板朝下，在吸水材料上拍击以去除所有的水滴。8.

32、从绿色试剂瓶中倒出所需量的试剂到试剂槽中。9.用移液器和新吸咀，吸取100l底物加到每个孔内，在平的表面上将板前后滑动确保充分混合1020秒钟。10.混合后放置1.5分钟。11.从试剂瓶中倒出所需量的硫酸(C（1/2H2SO4）=1mol/L)终止液到试剂槽中。12.用移液器吸取100l终止液加到每个孔内，在平的表面上将板前后滑动确保充分混合。13.用干净的布擦净板底，将板置于微型孔阅读器于450nm滤光片下读数。由于气泡会影响结果，应削除溶液中气泡。应在加入终止液后20分钟内完成读数。14.用Log/logit软件计算结果。8.特性参数检出限：2ppb(10次阴性样品的平均值加2倍标准偏差)

33、。定量检测限：5ppb(以标准曲线的最低浓度点表示)。定量范围：5-50 ppb(大于50 ppb时应稀释)九、鱼粉中组胺的测定 原理简介:鱼粉中组胺用三氯乙酸提取，之后调PH=9，将游离的组胺用正戊醇提取出，之后再用HCl反萃取，用偶氮试剂显色。组胺+三氯乙酸盐（溶于水）-PH=9-组胺（溶于正戊醇）-HCl-正戊醇（组胺溶于稀HCl）1试剂与溶液1.1偶氮试剂的配制甲液：称取0.5g对硝基苯胺，加5ml盐酸（1+1）溶解，再加水释到200ml，置冰箱中（28度）保存。乙液：亚硝酸钠溶液5g/l，临用现配甲液5ml、乙液40ml混合后立刻使用。1. 2三氯乙酸 100 g/L1.3氢氧化钠

34、250g/L1.4盐酸 1mol/L1.5正戊醇 分析纯1. 6碳酸氢钠溶液 50g/L1.7磷酸组胺（Sigma公司）2.步骤 2.1样品处理 称取1-3克鱼粉于具塞三角瓶内，加入25.0ml三氯乙酸（100g/L）每隔30分钟摇动一次，提取3小时，过滤，取滤液2.00ml或1.00ml于15ml试管内，加氢氧化钠（250g/L）5滴，振荡一下，再加5ml正戊醇振荡2分钟，静止分层（如出现乳化现象可滴加2-3滴无水乙醇），用移液枪小心吸取上清液（正戊醇层）于50ml分液漏斗内，下层沉淀再下层沉淀再分别用正戊醇5ml、3ml、3ml反萃取3次。将正戊醇全部收集到50ml分液漏内,分别用盐酸(1

35、mol/L)6 ml、6 ml、3 ml反萃取3次,收集水相（下层）于20ml刻度试管内，用水定容至刻度(20.00ml)，摇匀，吸取1.00ml（或2.00ml）盐酸提取液于10 ml比色管中，加入碳酸氢钠溶液（50g/L）3.0ml摇匀，振荡下加入偶氮试剂3.0ml，用水定容到刻度，室温下显色10min，用1cm比色皿于480nm下测定吸光度。2.2标准曲线称取磷酸组胺样品（Sigma公司）2.7671mg，置于100ml容量瓶内，用水溶解并定容到刻度，此液组胺含量为10ug/ml，分别取此标液0.00、1.00、2.00、4.00、6.00ml于5支10ml比色管内，各加盐酸（1mol/

36、L）1.0ml，振荡，用水定容到刻度，摇匀后放置10min（室温下），用1cm比色皿于480nm下测吸光值。参比液：试剂空白3计算鱼粉中组胺按下式计算公式：组胺（mg/100g）= C*100 (m/25.0)*(1.00/15.0)*1000实例：鱼粉2.3455，取三氯乙酸提取液1.00ml，吸光度A=0.257标准曲线:A=0.012380*C+0.01310计算: C =(A-0.0131)/0.012380=19.70ug组胺=(19.70*100)/(2.3455/25)*(1.0/15)*1000=315mg/100g=3150ppm应用：进口白鱼粉：组胺<10mg/100

37、g(1-5mg/100g)进口水产级蒸汽鱼粉<100mg/100g(50mg/100g)优质国产鱼粉<150mg/100g(50-150mg/100g)新鲜度差的鱼粉(国产,进口)组胺200340mg/100g用于乳猪料的鱼粉 组胺<100mg/100g十、挥发性盐基氮的测定(VBN)原理简介:蛋白质分解时，氨基酸脱胺基生成氨，氨基酸脱羧基生成胺，氨与胺(挥发性的胺)在碱液(氧化镁)中被蒸发出来，用硼酸吸收，用标准盐酸反滴定，测出其含量。1试剂与溶液1.1氧化镁溶液 10g/L2.步 骤称取5-10g样品于250ml具塞三角瓶内，加入100.0ml水，振荡30min，过滤，取

38、虑液10.00ml，按粗蛋白蒸馏操作，但加入的碱为氧化镁溶液（10g/L）7-10ml。3.计算：挥发性盐基氮（VBN）（mg/100g）按下式计算VBN（mg/100g）= C（V-V0）*14/m*（10/100）*100实例:鱼粉样品8.6706g，VHCl=0.0200mol/L V=3.93ml V0=0.15ml VBN=0.0200*14* (3.93-0.15)/8.6706*(10/100)*100=122.1mg/100g应用：新鲜度好的鱼粉VBN<100mg/100g（40-80 mg/100g） 新鲜度差的鱼粉VBN>150mg/100g（180-350 m

39、g/100g）乳猪料鱼粉VBN<100mg/100g十一、饲料中免疫球蛋白lgG的测定(高效液相色谱法)1 范围本标准规定了用高效液相色谱法仪测定饲料中免疫球蛋白IgG含量的方法本标准适用配合饲料、浓缩饲料、含Ig的饲料原料（包括血浆蛋白粉、鸡蛋粉等）中免疫球蛋白IgG的测定本方法检出限：当取样1g，稀释至25ml，进样量20ul，检出浓度为0.2mg/ml2 原理根据高效亲和色谱的原理，在磷酸盐缓冲液条件下免疫球蛋白IgG与配基连接，在PH2.5的盐酸甘氨酸条件下洗脱免疫球蛋白IgG。3 试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，水为去离子水或相当纯度的水，应符合CB/T66

40、82三级用水的规定3.1磷酸二氢钾3.2 磷酸氢二钾3.3流动相A：PH6.5，0.05mol/L磷酸盐缓冲液3.4流动相B：PH2.5，0.05mol/L甘氨酸盐酸缓冲液3.5 IgG储备标准液：称取IgG标准品（Sigma公司）0.0100g，用流动相A（3.3）溶解并定容至10ml，摇匀，浓度为1.0mg/ml3.6 IgG工作标准溶液：取IgG标准储备液，用流动相A（3.3）稀释成含IgG 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/ml的标准系列。临用时配制。4 仪器和设备4.1 实验室常用仪器设备4.2 PH计4.3超纯水装置4.4匀浆机4.5高效液相色谱仪：具紫外检测器和梯度洗脱

41、装置5 试样制备按GB/T14699饲料采样，选取饲料样品至少500g，四分法缩减至少100g，磨碎，通过0.28 um(80目)孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。6 分析步骤6.1试样处理：称取一定量试样（精确至0.0001），配合饲料、浓缩饲料时，称取试样25g；血浆蛋白粉称取试样0.1g；鸡蛋粉称取试样0.5g，于茄形瓶中，准确加入25ml流动相A（3.3），用匀浆机匀浆5分钟，取溶液10ml 于离心管中，以3500 r/min离心10min，通过0.45um微孔滤膜后进样6.2 测定：6.2.1 HPLC测定参数的设定：色谱柱：Pharmacia HI-Trap Prote

42、in G柱，1 ml波长： 280nm进样量：20ul6.2.2梯度洗脱条件梯度洗脱见表1表1时间流速(ml/min)A(%)B(%)04.55.515.018.526.00.50.50.50.50.50.51001000010010000100100006.2. 3测定先用5倍柱体积的重蒸馏水或去离子水洗柱，再用10倍柱体积流动相A（3.3）平衡柱，按洗脱程序进行洗脱。分别取6.1试样处理液和3.6标准工作液进行测定，以色谱峰面积积分值做单点或多点校准定量。7 结果计算7.1试样中IgG含量(g/100g)按下式计算：w= P1×V×c×Vst×100

43、Pst×m×Vi×V1×100式（1）中：w-试样中IgG含量，g/100g； c标准工作液（A.2.3）中IgG的浓度,mg/ml; P1 标准工作液峰面积值； Vst标准工作液进样体积，ul； Pst试样峰面积值； Vi-试样进样体积；ul； V-试样体积，ml； m-称取试样的质量，g；7.2 平行测定结果用算术平行值表示，保留小数点后两位有效数字。8 重复性在重复性条件下获得的两次独立测试结果的测定值的绝对差值不得超过算术平均值的15%。十二 、玉米副产品中二氧化硫残留量的测定方法1:GB/T5009.34-1996方法2:称取样品10g于三角烧

44、瓶内,加入少量水(约10ml),加入20ml浓盐酸,5g锌粉,瓶口用乙酸铅试纸扎紧,放在沸水浴上加热,若瓶中变黑则含SO2 ,标准样品可用无水亚硫酸钠(Na2SO3)代替,同上操作,根据黑班的大小,确认含量. 方法3:称样品20g于具塞三角瓶内,准确加入100ml水,振荡5分钟,静止待瓶内液体澄清后,准确吸取上清液20ml,置于250ml碘量瓶内,加入1mol/L NaCl 25ml,振荡2分钟,静止10分钟,然后加入硫酸(1+3)10ml,边加边振荡,之后加淀粉(10g/l)1ml,用碘标准滴定溶液(C(1/2I2)=0.1mol/L)滴定到溶液呈兰色,同时作空白试验.SO2 % =C

45、15;(V-V0)×0.032/(m×1/5)×100十三、 鱼粉中脲醛聚合物的鉴别1 原理脲醛聚合物在浓硫酸的作用下分解成甲醛与氨，甲醛与变色酸（铬变酸 ,1.8二羟基萘3.6二磺酸）的浓硫酸溶液一起微热，形成一种紫色 紫红色化合物2 试验部分 试剂与仪器立体显微镜（160倍可连续变焦，带光源）眼科镊子烧杯 50 ml变色酸 2g/L称取变色酸0.2g于200ml干燥的烧杯中，加入100ml浓硫酸，电炉上微热(50-60)2min并搅拌使之溶解，冷却后，移入120ml棕色滴瓶内。3 结果与讨论3.1反应的干扰情况和检出限量 变色酸的浓硫酸溶液对乙醛、丙醛、丁醛、

46、异丁醛、异戊醛、庚醛、巴豆醛、水合氯醛、乙二醛及芳香族醛类物均无此反应，与甘油醛、糠醛、阿拉伯糖、果糖及蔗糖反应显黄色，其它糖类、丙酮及羧酸类都不与变色酸的浓硫酸溶液发生反应。此方法的检出限量为0.05mg (脲醛聚合物)3.2加热温度 滴加变色酸的浓硫酸溶液后，加热的温度应在150 以下，温度过高部分“蛋白精”被炭化成黑色，影响判断。3.3 夹取可疑物时应注意的问题由于“蛋白精”的粒度很小，而且易碎，虽然在体视镜下看到了，镊子也夹到了，但在转移到烧杯的过程中易丢失，因此，在夹取了数粒后，要将烧杯放到体视镜下确认可疑物已放到烧杯中，并轻轻振动烧杯或用探针拨动可疑物，使之集中在烧杯底部的某个点上

47、，滴加变色酸时要对准此点。3.4 依据氨基酸总量来判断是否掺有“蛋白精”通常根据鱼粉氨基酸总量明显偏低（小于粗蛋白质的85%），而水溶性非蛋白氮(NPN)为阴性来判断鱼粉中有脲醛聚合物“蛋白精”，这并不能说明样品中一定含有脲醛聚合物“蛋白精”，只能证实含有难溶性的非蛋白氮(NPN)。3.5 此方法也适用于肉骨粉、玉米蛋白粉、豆类蛋白粉、大米蛋白粉中蛋白精的检测十四、 谷物中淀粉含量的测定1 试剂与溶液1.1 酒石酸铜甲液(菲林甲液)：34.639gCuSO4溶于水，加入0.5ml浓H2SO4，稀释到500ml。 1.2 酒石酸铜乙液(菲林乙液)：173g酒石酸钾钠，加50gNaOH，稀释到50

48、0ml。1.2 氢氧化钠溶液c(NaOH)= 1mol/L1.3 硫酸铁溶液 50g/L1.4 高锰酸钾标准滴定溶液c（1/5 KMnO4）=0.1mol/L1.5 乙醇溶液85% v/v1.6 HCl 1+1 和 1+3NaOH溶液40%乙酸铅溶液20%硫酸钠10%2 步骤：称取样品（粉碎过40目筛）2.05.0g，准确至0.0002g，置于放有慢速滤纸的漏斗中，用30ml乙醚分三次洗去样品中脂肪，再用150ml 85%乙醇溶液分数次洗涤残渣，以除去可溶性糖类物质，滤干乙醇溶液，将滤纸连同残渣一并转移至250ml锥形瓶中，加100ml水，加30ml（1+1）HCl，在沸水浴上回流2h，回流完

49、毕后，立即在流水中冷却，待样品水解液冷却完全后，加3滴甲基红指示剂，先用40%NaOH溶液调至黄色，再用(1+3)的HCl调至水解液刚变红色为宜，使水解液的PH值约为5，然后加20ml 20%的乙酸铅溶液，摇匀，放置10min，再加20ml 10%的硫酸钠溶液，摇匀后，将全部溶液及残渣转入500ml容量瓶中，用水洗涤锥形瓶，洗液合并于容量瓶中，定容，摇匀，过滤，弃去初滤液20ml，滤液供测定用。吸取25.00ml滤液于三角瓶中，加25ml菲林甲液，再加25ml菲林乙液，在电炉上加热(在3min内煮沸)并煮沸2min，取下过滤，并用水洗涤沉淀45次，之后将滤纸及沉淀物一起放入三角瓶内，加入硫酸铁

50、（50g/L）25ml，再加25ml水，用玻璃棒搅拌到看不到Cu2O的红色为止，然后用高锰酸钾标准溶液C（1/5KMnO4）=0.1mol/L滴定到呈微红色30s不褪色为终点。同样条件做空白。3计算：以质量百分含量表示的淀粉含量按下式计算：（1） Cu20=（V-V0）×C×71.54（2） 用Cu20的质量查表求转化糖的质量：淀粉含量 % = ×100式中： V-样品消耗KMnO4的体积；mlV0空白消耗KMnO4的体积；ml , m-试样的质量,g十五 、 次粉中泥沙及矿物质的测定1 步骤：称取20g样品（准确至0.1g）于250ml干燥的分液漏斗中，加约10

51、0ml的四氯化碳，振荡几分钟，静止0.5h以上，小心地将下层沉淀物放出到已在105烘至恒重的小烧杯中，水浴上蒸干溶剂后，放到105烘箱内烘0.5h，取出，冷却，称重。2 沉淀物分析（定性）如沉淀物为白色、灰白色物质，且不溶于盐酸，则为滑石粉；反之，沉淀溶于盐酸，并放出大量的气泡，则为石粉。如沉淀物外观如泥砂状物质，则沉淀为混入或掺入的泥砂。如沉淀外观很白，并有荧光性，则沉淀物为增白剂。3 计算：沉淀物 % = ×100式中：m2烘后沉淀物烧杯的质量；gm1烧杯的质量；gm样品的质量；g说明：此方法也适用于豆粕、棉粕及菜粕中泥砂的测定。十六、鱼粉、肉骨粉、玉米蛋白粉、豆类蛋白粉、大米蛋

52、白粉镜检过程中的定性实验定性检查A . 掺入植物类物质（如小麦麸、稻谷粉、豆类蛋白粉和大米蛋白粉）试剂： 碘-碘化钾溶液配制：称1g的碘及5g碘化钾于烧杯内，加100ml水搅拌2分钟，待溶解后将其移入120ml棕色的滴瓶内。步骤：取约5g样品放在烧杯内，加约70ml水，在电炉上煮沸，取下静止2分钟，滴加碘碘化钾溶液ml，如溶液变成蓝色则掺入植物性的物质。B. 掺入尿素试剂：(1)生黄豆粉:将大豆磨成粉末（注意:防止粉碎中升温）(2)酚红:g/L。称取酚红（苯酚红）0.1g溶于100ml乙醇中。步骤：取约0.5g鱼粉样品，于50ml比色管内，再加约0.1-0.2g生黄豆粉，35滴酚红，40ml水

53、，塞好塞子，摇动30秒，静止，如溶液变成红色，则样品中掺入尿素。C. 掺入铵盐类物质（氨化铵，碳酸氢铵）试剂 (1)氢氧化钠溶液:称g氢氧化钠加ml水。(2)PH 试纸步骤：取鱼粉3-5g于100ml 烧杯内，表皿内侧沾一条湿的PH试纸，向烧杯内加约5-10ml 氢氧化钠，将表皿迅速盖上，如试纸迅速变蓝，则含铵盐。D. 掺入蛋白精（脲醛聚合物）试剂 :变色酸(0.1%硫酸溶液 )称取0.1g变色酸于干燥的烧杯内，加入100 ml浓硫酸，电炉上加热到（70-80），待溶解后，降温，移入120 ml棕色的滴瓶内。步骤: 将可疑物从显微镜下夹出数粒于干燥的小烧杯内，滴加约1 ml变色酸，电炉上加热到

54、刚刚产生微烟，取下，加入20 -30ml水，如变成紫色，则样品中有蛋白精。E. 掺入植物性物质（含大量粗纤维类物质：如锯末、稻草、麦芽根）试剂: (1) 间苯三酚2%:称间苯三酚2 g，加100 95%乙醇，溶解后放入棕色滴瓶内。(2) 浓盐酸 36% 分析纯试剂步骤：称1-2g鱼粉于培养皿内，滴加间苯三酚使样品湿润，放置5-10分钟后，滴加浓盐酸约0.5ml，放置2-3分钟，如样品显现深红色，则样品中含木质素，在显微镜下进一步确认为何物。F. 掺入皮革粉试剂:(1)稀硫酸C(H2SO4)=2mol/L,将取10ml浓硫酸慢慢加入到90ml水中。(2) 二苯基卡巴腙0.2%,称0.2g二苯基卡巴腙，加入100ml 95%乙醇，溶解后，移入棕色滴瓶内。步骤：取1-3 g鱼粉于坩埚内，在电炉上炭化