实验一酶催化蔗糖转化反应

1、 实验一 酶催化蔗糖转化反应（28学时）一、 目的和要求1 用旋光仪对酶催化蔗糖转化反应进行测定。2 了解掌握蔗糖酶的制备和酶活力的测定。3 学会米氏常数的测定。二、 实验原理蔗糖转化反应蔗糖 水 葡萄糖 果糖这个反应在H+或蔗糖酶的催化下可以很快的进行。蔗糖及其转化产物都有不对称的碳原子，它们都有旋光性，但是它们的旋光能力不同，所以可以利用体系在反应过程中旋光度的变化来描述反应进程。溶液的旋光度与溶液中所含旋光物质的旋光能力、溶剂的性质、溶液的浓度、测量样品管的长度等均有关系。当其他条件不变时，旋光度a与反应物浓度C成线形关系，即akC作为反应物的蔗糖是右旋性物质，其比旋光度为66.6；生成

2、物的葡萄糖也是右旋性的物质，其比旋光度为52.5，但是果糖是左旋性物质，其比旋光度为91.9。由于生成物中果糖左旋性比葡萄糖右旋性大，所以生成物呈现左旋性质。因此，随着反应的进行，体系的右旋角不断减小，反应到某一时刻，体系的旋光度可恰好等于零，而后就变成左旋，直到蔗糖完全转化，这时体系的左旋角达到最大值。三、 仪器和试剂旋光仪1台恒温槽1套葡萄糖、果糖、蔗糖（均为分析纯）醋酸醋酸钠缓冲溶液四、 实验步骤1 蔗糖酶的提取取鲜酵母20 g于100 mL三角瓶中，加入1.6 g NaAc，搅拌1520分钟后使团块液化，再加3 mL甲苯，混和后摇动10分钟，放在恒温箱中37保温60小时左右。取出后加入

3、3.2 mL 4 M醋酸和100 mL水使pH值在4.5左右。将混合物以每分钟3000转的速度离心30分钟，离心后形成三层，取中层黄色液体，再以同样速度离心30分钟，所得澄清的黄色液体即为蔗糖酶粗品。将此蔗糖酶用pH4.6的缓冲溶液稀释10倍，过滤后冷冻保存。2 作蔗糖转化体系旋光度和浓度的工作曲线 根据蔗糖转化体系的蔗糖和果糖、葡萄糖的比例关系，可以制作不同浓度下混和体系的旋光度的工作曲线。例如0.1 M蔗糖转化体系的旋光度和葡萄糖浓度的工作曲线，实际上是制作0.1 M蔗糖转化进程工作曲线，不同的蔗糖浓度有不同的进程工作曲线，从若干不同蔗糖浓度的进程工作曲线得到这些工作曲线直线关系很好，且直

4、线的斜率与蔗糖的浓度无关，经过线性拟合，其直线方程为：y60.28xa其中x蔗糖转化成葡萄糖的浓度（M）y蔗糖转化进程中体系的旋光度值a不同浓度蔗糖溶液的旋光度值，其值可以测定，也可以通过下式计算。a66.6×L×C（L10cm，C是蔗糖浓度g/mL）通过上述的直线方程，可以测定任何浓度蔗糖转化体系的旋光度值，求出其转化成葡萄糖的浓度x，从而可以求得不同反应时间的葡萄糖浓度。3 酶比活性的测定配制2.5的蔗糖溶液100 mL，测定其旋光度。在20的条件下加入蔗糖酶5 mL，反应3分钟测定体系旋光度值y，用公式 y60.28xa 求出葡萄糖浓度x，及生成葡萄糖的毫克数，即可求

5、出酶的比活性。（上述方法制备的酶，其活性约每毫升20单位。）比活性(单位/mL)(生成葡萄糖的毫克数)/(酶的体积)4 蔗糖酶进程曲线的制作取200 mL 0.1 M的蔗糖溶液，在35水浴条件下恒温，加10 mL蔗糖酶溶液，每5分钟取出20 mL反应液加5滴5 M NaOH灭活后，测定一次体系的旋光度。求出葡萄糖的浓度，用葡萄糖的浓度对时间作图，得到蔗糖酶催化反应的进程曲线。时间（分）510152025303540旋光度葡萄糖浓度5 蔗糖酶米氏常数的测定 用缓冲溶液稀释0.5 M的蔗糖溶液成为一系列不同浓度的蔗糖溶液各50 mL，在35恒温条件下加入10 mL已知活性的蔗糖酶，反应5分钟，加入

6、1 mL 5 M NaOH溶液终止反应，测定此时溶液的旋光度，从而求出葡萄糖的生成速度V，根据米氏方程用反应速度V对（V/S）作图，直线的斜率-Km，直线的截距为Vmax，从而可以求出米氏常数Km。加入蔗糖体积(mL)蔗糖浓度（M）起始旋光度结束旋光度葡萄糖浓度（M）反应速度V(M/分)V/S11.200.0123.600.0337.200.06410.80.09514.40.12618.00.15721.60.18825.20.21五、 数据处理1 利用(3)中的数据计算酶的比活性。2 利用(4)中的数据作酶催化反应进程曲线。3 利用(5)中的数据计算蔗糖酶米氏常数。六、参考文献1 沈同等，

7、“生物化学”，上册，人民教育出版社，1980年版。2 复旦大学，“物理化学实验”，上册，人民教育出版社，1979年版。3 朱俭等，“生物化学实验”，上海科技出版社，1981年版。附录一直线直线方程一般可表示为：yabx（1）式中y和x为由实验数据可确定的量；a和b为待定参数或函数。例如，对Arrhenius公式指数式，y和x分别为lnk和1/T；a和b分别为lnA和（E/k）。对式lnr=lnknlnC，y和x分别为lnr和lnC；a和b分别为lnk和n。由于有实验误差，用n对由实验确定的yi与xi值作y对x图时，一般说来，所得各点并不严格的在同一直线上，于是存在着这样的问题：应如何更合理地作

8、出直线，从而更准确地求解a和b的值？应当指出，若直线选择不当（直线位置画的不当），不大的偏离，将可能导致a和b重大偏差。尤其是当试验测定的x区间范围相对较小时，外推至x0，将可使截距a产生较大的误差。例如依Arrhenius对数式以lnk对1/T作图，由实验测定的温度范围外推至1/T0，即T时，所选的直线斜率的较小的偏差将会引起截距lnA产生很大的偏差，致使指前因子A产生更大的偏差。怎样方能使直线位置选择（画）的得当呢？通俗地说，实测点（yixi）应均匀分布在直线两侧。严格的说，可采用下述“最小二乘法”确定最佳a、b值，作出最佳直线。若取得的数据实验值yi与xi（i=1、2、n），一般来说，y

9、i与abxi值并不相等，令其误差为di，则di=yiabxi线性回归，要求适当选择a与b之值，使各对元数据的偏差di之平方和之值为最小。即（2）（3）式中yi、bxi均为已知值。令与分别为yi与xi的平均值。则式（2）、（3）联立，可得（4）（5）由式（4）、（5）确定的a和b，称之为线性回归系数。用线性回归系数确定的直线方程yabx，称为回归直线方程。其对应的直线，称为回归直线。回归直线有下列性质1 当x时，由式（1）、（5）可知y，即回归直线必通过（，）点。2 由式（2）知，回归直线要求y的各次实验值yi与计算值abxi偏差之总和为零，即各实验点均匀分布于回归直线的两侧。欲度量一组实测点与

10、回归直线的相符程度，常引用所谓的相关系数“g”作为定量指标，其定义为：（6）当|g|值在01之间，|g|值越接近于1，表明该组实测点与回归直线吻合性越好。当|g|=1时，表示所有的实测点均严格地落在回归直线上；|g|<0.482，则该组x、y间线性关系不明显，此时推求回归直线方程已无意义了。较精密的小型计算器一般配有直线方程的回归计算标准程序，使用十分方便。附录二酶催化反应一、 酶酶与其他催化剂不同，能在机体内十分温和的条件下高效率地起催化作用，使生物体内的各种物质处于不断的新陈代谢之中。所以说，酶在生物体的生命活动中占有极为重要的地位，研究酶的化学性质及其作用机理，对于人们了解生命活动

11、的规律，从而进一步指导有关的医学实践及工农业生产具有重大意义。酶的本质是蛋白质，酶是具有催化作用的蛋白质。酶蛋白主要由氨基酸组成，同其他蛋白质一样，具有两性电解质的性质，并具有一、二、三、四级结构，也受热、紫外线照射等物理因素及酸、碱、有机溶剂等化学因素的影响而变性或沉淀，丧失酶活性。酶的分子量也很大，其水溶液具有亲水胶体的性质，不能透析。在体外，酶能被胰蛋白酶等水解而失活。根据酶的组成，酶可以分成简单蛋白质和结合蛋白质两类。脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等属于简单蛋白质，其活性仅仅取决于它的蛋白质结构；另一类酶，其中的蛋白质部分酶蛋白不具有活性，需要加入非蛋白的组分辅助因子后，才表

12、现出酶的活性，这就是结合蛋白质。酶蛋白与辅助因子结合后形成的复合物称为全酶。例如酪氨酸酶就是以Cu+或Cu2+为辅助因子的全酶。在催化反应中，酶蛋白与辅助因子所起的作用不同，酶反应的专一性及高效率取决于酶蛋白本身，而辅助因子则直接对电子、原子或某些化学基团起传递作用。酶的辅助因子包括金属离子（Zn+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+等）及小分子复杂有机化合物。它们本身无催化作用，但参与氧化还原或运载酰基载体的作用。在大多数情况下，可以通过透析等方法将全酶中的辅助因子除去，这种与酶蛋白分子松弛结合的辅助因子称为辅酶。在少数情况下，有一些辅助因子以共价键和酶蛋白较牢固地结合在一起，

13、难以透析除去，这种辅助因子称之为辅基。细胞色素氧化酶与铁卟啉辅基就结合的比较牢固。酶母提取物经透析除去辅酶I(Co I)后，便失去了催化葡萄糖发酵的能力。根据酶蛋白分子的特点可将酶分为单体酶、寡聚酶和多酶体系。单体酶只有一个多肽链，分子量在1.3万到3.5万之间，一般是催化水解反应的多肽链。寡聚酶由几个甚至几十个亚基组成，亚基之间不是共价键结合，彼此很容易分开，分子量从3.5万到几百万，如磷酸化酶a。多酶体系是由几种酶彼此嵌合形成的复合体。多酶复合体的分子量一般都在几百万以上，它有利于一系列反应的连续进行，如在脂肪酸合成中的脂肪酶合成酶复合体。在酶促反应中被酶作用的物质称为酶的底物。根据酶促反

14、应的性质可将酶分为六大类：1 氧化还原酶类催化氧化还原反应A·2HBAB·2H例如黄嘌呤氧化还原酶（习惯称为黄嘌呤氧化酶）2 移换酶类催化功能基团的转移反应ABCABC例如丙氨酸酮戊二酸转移酶（习惯称为谷丙转氨酶或丙氨酸氨基转移酶）3 水解酶类催化水解反应ABHOHAOHBH这类酶包括淀粉酶、蛋白酶等。例如ATP磷酸水解酶：ATPH2OADP 正磷酸ATP是腺苷三磷酸（腺三磷），ADP腺苷二磷酸（腺二磷）。4 裂合酶类催化从底物上移去一个基团而留下双键的反应或其逆反应，这类酶包括水化酶、脱羧酶和脱氨酶等。5 异构酶类催化异构反应AB例如催化D、L互交，a、b互交的酶6 合成

15、酶催化合成反应，催化一切必须与ATP分解相偶联，并由两种物质（双分子）合成一种物质的反应XYATPXYADPPi二、 酶的分离提纯及活性测定药物用酶、生化试剂用酶，对酶的纯度要求较高；对酶的物理化学性质和催化反应进行研究，亦需要纯度较高的酶或纯酶，所以必须对酶进行分离和提纯。生物体内的酶分为胞内酶和胞外酶两类。胞内细胞存在于细胞之内，必须使细胞破碎才能进行分离。胞外酶则容易分离，例如由动物胰液可分出各种蛋白酶和酯酶。因为酶是蛋白质，故可以用提纯蛋白质的方法来提纯酶。盐析法是最常用的，盐析沉淀的蛋白质保持其天然构象，能再溶解。用于盐析的中性盐以硫酸铵为最好，因为它在水中的溶解度很高（20，760

16、g/L）且其温度系数较小。其他提纯方法还有调节pH、等电点沉淀、有机溶剂（乙醇、丙酮、异丙醇等）分级分离等。因为酶是生物活性物质，所以在提纯时必须要减少活性的损失，全部操作需在05低温下进行。用有机溶剂分级分离则在-15-20进行。为防止重金属使酶失活，有时需在抽提溶剂中加入少量的EDTA螯合剂；为了防止酶蛋白SH基被氧化失活，需要在抽提溶剂中加入少量的巯基乙醇；为避免产生大量泡沫使酶变性，在分离提纯过程中不能过度搅拌。为进一步提纯得到纯度更高的酶制剂，常用磷酸钙凝胶吸附、离子交换纤维素分离、葡聚糖凝胶层析、离子交换葡聚糖凝糖胶层析，凝胶电泳分离及亲和层析分离法。为便于保存，需将酶制品浓缩、结

17、晶。有三种保存方法：1、保存浓缩的酶液：用硫酸铵沉淀或硫酸铵反透析法使酶浓缩，使用前再透析除去硫酸铵。2、冷冻干燥：对于已除去盐分的酶液可以先在低温结冻，再减压使水分升华，制成酶的干粉，保存于冰箱中。3、浓缩液加入等体积甘油，于-20保存。在分离提纯过程中，必须经常测定酶的比活性，以指导提纯工作的进行。酶活性的大小也称为酶活力，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活性的高低是研究酶的特性、进行酶制剂的生产及应用时的一项必不可少的指标。酶的活性的大小可以用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的反应速度来表示。酶催化的反应速度愈大，酶的活性就愈高。所以测定酶的活性就是测定酶促反应的速度，这实质上就是酶

18、的定量测定。酶反应速度可用单位时间内底物浓度的减少或产物浓度的增加来表示。以产物浓度C对反应时间t作图（见图11）。酶反应速度即为该曲线的斜率。图1-1 酶反应的速度曲线从酶反应的速率曲线可以看出，反应速度在开始一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶反应速度逐渐下降。下降的原因是由于底物浓度的降低、酶在一定pH及温度下部分失活、产物对酶的抑制、产物浓度的增加而加速了逆反应的进行等。因此，研究酶的反应速度应以酶促反应的初速度为准。这时上述各种干扰因素尚未起作用，速度保持不变。在测定酶反应速度时，常常测定的是产物浓度的增加而不是底物浓度的减少。这是由于实验中，底物的浓度往往是过量的，反应时底物

19、浓度的减小微乎其微，难以准确测定；而产物则从无到有，只要方法足够灵敏，其浓度就可以准确测定。酶活性的高低用酶活性单位来表示。酶含量可以用每克或每毫克酶制剂含有多少个活性单位来表示（单位/克或单位/毫克）。例如a-淀粉酶，可用每小时催化1克可溶性淀粉液化所需要的酶量来表示，也可以用每小时催化1毫升2可溶性淀粉液化所需要的酶量作为一个酶单位。酶的比活性是指每毫克酶蛋白所具有的酶活性，一般用单位/毫克蛋白来表示。它常用来比较每单位重量酶蛋白的催化能力。比活性愈高，表明酶愈纯。三、 酶促反应的动力学1 酶作为生物催化剂除具有一般催化剂的共性外，还有其特性：（1） 催化效率高。以分子比表示，酶催化反应的

20、反应速度比非催化反应高1081020倍，比其它催化反应高1071013倍，以转换数每分钟每个酶分子能催化多少个反应物分子发生变化表示，大部分酶为1000，高的可达106以上。（2） 酶作用的专一性。一种酶只能作用于某一类或某一种特定的物质，即一种酶只作用于一个或一类底物。（3） 酶易失活。强酸、强碱、高温等条件都能使酶受到破坏而完全失去活性，所以酶作用的条件一般都比较温和，如常温、常压、接近中性的酸碱度等。（4） 酶活性的调节控制。调节控制的方式很多，包括抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素控制等，这里不予详细讨论。（5） 酶的催化活性与辅酶、辅基和金属离子有关。有些酶是复合蛋白

21、质，其中的小分子物质（辅酶、辅基及金属离子）与酶的催化活性密切相关。若将它们除去，酶就失去活性。（6） 在酶促反应中存在着酶被底物所饱和的现象。高效率、专一性以及温和的作用条件使酶在生物体新陈代谢中发挥强有力的作用，酶活性的调控使生命活动中各个反应得以有条不紊地进行。为了最大限度地发挥酶反应的高效率，寻找最有利的反应条件，为了了解酶在代谢中的作用和某些药物的作用机理等等，都必须掌握酶促反应速度的规律。酶促反应的动力学是研究酶促反应的速度及其影响因素的科学。2 底物浓度对酶反应速度的影响底物浓度的改变对酶反应速度的影响比较复杂，参见图12酶反应和速度（v）对底物浓度S的关系。图12 酶反应速度与

22、底物浓度的关系当底物浓度较低时，反应速度与底物浓度的关系是正比关系，表现为一级反应；随着底物浓度的增加，反应不再按正比升高，这一段反应表现为混合级反应；再继续增加底物浓度，曲线表现为零级反应，这时尽管底物浓度还在不断增加，但反应速度却不再上升，趋向一个极限，说明酶已被底物所饱和。所有的酶都有此饱和现象，但各自达到饱和时所需的底物浓度并不相同，甚至差异极大。Michaelis和Menten提出了酶促动力学的基本原理，Briggs和Haldan又加以补充和发展。v对S的定量关系，他们作了如下假设与推导。他们借用“中间产物假设”比较合理地解释了上述现象。此假设认为，酶与底物先络合成一个络合物，此络合

23、物再进一步分解成产物和游离态的酶。第一步快速可逆ESES（1）第二步较慢可逆ESPS（2）由于酶促反应的速度与酶底物中间物ES的形成及分解直接相关，所以必须考虑ES的形成速度和分解速度，即ES的形成量与ES和PE有关。但PE形成ES的速度极小（特别是在反应处于初期阶段时，P很小），故可忽略不计。因此，ES的形成速度可表示为（3）这里E0为酶的总浓度；ES为酶底物中间物的浓度；E0ES为游离状态的酶的浓度。S为底物浓度。通常底物浓度比酶浓度过量得多，即S>>E0。S等于底物的总浓度S减去被酶结合的S量（亦即ES），而ES的分解速度则是与二者之和为ES分解的总速度： （4）当整个酶反应

24、体系处于稳态时，ES的形成速度与分解速度相等，即ES保持恒定，所以 k1(E0ES)S=k2ES+k3ES（5）令则（6）从而（7）因为酶反应的速度v与ES成正比，所以 v=k3ES（8）即（9）当底物浓度很高时，所有的酶都被底物所饱和，而转变成ES复合物，即E0=ES时，酶促反应达到最大速度Vmax，所以Vmax=k3ES=k3E0（10）（9）式除以（10）式，得故（11）这就是米氏方程（Michaelis-Menten equation），Km为米氏常数（Michaelis-constant），该方程表明了当已知Km及Vmax时，酶反应速率与底物浓度呈正比的定量关系。当酶促反应处于v=1

25、/2Vmax的特殊情况时，显然这里S=Km。由此可以看出Km值的物理意义，即Km值是当酶反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，它的单位与底物浓度的单位一样。Km是酶学研究中的一个极为重要的数据，下面再对Km作如下分析：（1） Km值是酶的特征常数之一，只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。不同的酶，Km值不同，如苹果酸酶为0.05mmol·L-1，脲酶为25 mmol·L-1（2） 如果一个酶有几种底物，则对每一种底物，各有一个特定的Km值。Km值还受pH值及温度的影响。因此，Km值作为常数只是对一定的底物、一定的pH值、一定的温度条件而言。测定酶的Km值可以作为鉴别酶的

26、一种手段。Km值随不同底物而异的现象可以帮助判断酶的专一性，并助于研究酶的活性中心。（3） 同一种酶有几种底物就有几个Km值，其中Km值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。如蔗糖是蔗糖酶的天然底物。（4） Km不等于Ks，Ks是ES的解离平衡常数，由于，所以只有在特殊情况下（k1、k2>>k3，即形成ES的平衡迅速建立，ES形成的速度大大超过ES分解为产物的速度）下，Km值才可看作Ks。1/Ks用来表示酶与底物亲和力的大小，1/Ks愈大，表示亲和力愈大。当k3极小时，可近似地用1/Km来表示酶与底物结合的难易程度，因为1/Km愈大，Km愈小，达到最大反应速度一半所需的底物浓

27、度就愈小。显然，最适底物与酶的亲和力最大，不需很高的底物浓度就可以很容易地达到Vmax。（5） Km值与米氏方程的应用可由所要求的反应速度（反应达到Vmax的百分数），求出应当加入底物的合理浓度；反过来，也可以根据已知的底物浓度，求出该条件下的反应速度。例如，要求反应速度达到Vmax的90，其底物浓度应为则S=9Km根据米氏方程，从酶的vS图上可以得到Vmax，再从1/2Vmax可求得相应的S，即Km值。实际上，即使用很大的底物浓度，也达不到真正的Vmax，从而也测不准Km值。为了准确地得到米氏常数，可用如下两种方法。（1） 双倒数作图法。米氏方程可改写为实验时选择不同的S测定相对应的v，以1

28、/v对1/S作图，得一直线，外推至与横坐标相交，得图13中的“-x”值，即为1/Km，则Km=-1/x。这是求米氏常数最方便也是最常用的方法。图13 双倒数作图法（2） v对v/S作图，得一直线，如图14所示。该直线的斜率=-Km。根据米氏方程，以v对v/S作图，可得到与实验结果（见图12）相符的曲线。这种一致性，从一个侧面反映了“中间产物假说”的正确性。几十年来，还积累了很多其他的依据，直接或间接地证明了中间产物学说的正确性。必须指出，现在的酶促反应动力学还只能较好地反映较为简单的酶作用过程，对于更复杂的酶作用过程，特别是对生物体中的多酶体系则还不能全面地概括和解释。米氏方程只假定形成一个E

29、S，但实际上许多酶在催化时包括几个中间物过程，再加上许多酶促反应不只有一种底物，也不只产生一种产物，对这种过程的动力学分析是很复杂的，必须借助电子计算机才能进行计算。图14 v对v/S作图法3 酶的浓度对酶反应速度的影响在酶促反应中，如果底物浓度足够大，足以使酶饱和，则反应速度与酶的浓度成正比。从米氏方程（9）式即可看出，当S维持不变时，vE。这里使用的酶必须是纯酶制剂或不含抑制物的粗酶制剂。4 pH对酶反应速度的影响大部分酶活力受环境pH的影响，在一定的pH下，酶反应具有最大的速度，高于或低于此值，反应速度便下降，通常称此pH为酶反应的最适pH，示例如图15。图15 胰蛋白酶活性与pH底关系酶的最适pH并不是一个常数，有时因底物种类、浓度及缓冲液成分不同而改变。动物酶的最适pH多在6.58.0之间，植物及微生物酶的最适pH多在4.56.5之间。（1） 过酸过碱会影响酶蛋白的构象，甚至使酶变性而失活。（2） pH会影响底物分子和酶分子以及中间产物ES的解离状态，往往只有某一种解离状态最有利于酶与底物的结合，如果影响到ES的形成，酶的活性便降低了。（3） pH值影响分子中另一些基团的解离，这些基团的离子化状态与酶的专一