Western-blot-试剂配制及操作流程教学文案

1、1 Western-Blot操作流程试剂配制蛋白提取试剂.RIPA裂解液：50mMTris(MW121.14,PH7.5)3.02g150mMNaCl4.38g1%TritonX-1005ml1%脱氧胆酸钠5g0.1%SDS0.5g蒸储水至500ml。调pH值至7.5。混匀后4c保存，长期保存于-20Co使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。.蛋白酶抑制剂cooktail所需母液成分：(1)100mmol/LPMSFPMSF异丙醇溶解后，分装于17.4mg1ml1.5ml离心管中10mM亮肽素leupeptin:2.1mg/ml抑肽素Aprotinin:配制：成分PMSFLeupeptin

2、Aprotinin-20C保存。-20C保存4c保存终浓度1mmol/L（储存浓度稀释0.1mmol/L（储存浓度稀释1ug/ml（储存浓度稀释每ml裂解液所加母液量100倍）10ul100倍）10ul2000倍）0.5ul各成分直接加入所用的RIPA裂解液中，之后按照60ul/孔（12孔板）提取蛋白。蛋白定量试剂.G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）考马斯亮蓝G250100mg95%乙醇50ml85%磷酸100ml蒸储水至1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4c保存于棕色瓶中。1 .牛血清白蛋白BSA储存?夜11mg/ml）：100mgBSA

3、粉末溶于20ml双蒸水，定容至100ml,加少量防腐剂，4c保存。1. 上样用试剂.4X上样缓冲液1.0mol/LTris-HCl(pH6.8)2mlSDS0.8g澳酚蓝0.04g甘油4ml去离子水定容至10ml。混匀后，分装于1.5ml离心管中，4c保存。使用时稀释成1X。1.0mol/L二硫苏糖醇（DTT）（10X）用20ml0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09gDTT分装成1ml小份储存于-20?C。使用时稀释成1X。例如：上样量20“-4X上样缓冲液5“+DTT2“+样本蛋白13“工作液制胶用（1-6）:1.1.0mol/LTris-HClTris(MW121.14)

4、蒸储水溶解后，(用浓盐酸调(pH6.8)12.114g100mlpH至6.8),室温下保存。2. 1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）Tris（MW121.14）18.171g蒸储水100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8）,室温下保存。3. 10%SDSSDS10g蒸储水至100ml如溶解困难，可在50c水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。4. 10%过硫酸胺（AP）5. 过硫酸胺0.1g蒸储水1ml（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸储水水即可，溶解后，4c保存，保存时间为1周）四甲基乙二胺

5、原液（TEMED）：4?C保存。6. 30%丙稀酰胺：4?C保存。10%下层胶(两块胶，15ml)：依次加入去离子水5.9ml30%丙烯酰胺5ml1.5MTris-HCl(pH8.8)3.8ml10%SDS150“10%AP150“TEMED6“每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。灌胶后加正丁醇（1ml）消泡5%上层胶(两块胶，6ml):依次加入去离子水4.1ml30%丙烯酰胺1ml1MTris-HCl(pH6.8)0.75ml10%SDS60“10%AP60“TEMED6“每加一种成分随即摇匀，为了

6、加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。7.5X电泳液缓冲液Tris（MW121.14）甘氨酸（MW75.07）SDS蒸储水至1000ml溶解后室温保存，用时稀释8.10X转膜缓冲液甘氨酸（MW75.07）Tris（MW121.14）蒸储水至1000ml溶解后室温保存，用时稀释15.1g94g5.00g5倍，通常取160ml配制成800ml即可。151.1g30.3g10倍，并加入甲醇至20%。9. 通常取80ml母液，力口560ml蒸储水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。（先加甲醇易产生沉淀）10XTBS缓冲液Tris

7、（MW121.14）24.2gNaCl80.0g蒸储水至1000ml（浓盐酸调pH至7.6）,溶解后室温保存。10. 1XTBS校冲液10XTBS缓冲液100ml蒸储水900mlTween-201ml因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。溶解后室温保存。11. .封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶）：1XTBS校冲液95-100ml脱脂奶粉5g溶解后4c保存，可于一周内使用。其他商品性试剂一抗、二抗、显影液、定影液、ECL化学发光试剂操作步骤（一）蛋白样品制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液，（暂不作可将培

8、养皿存于-80度）。2、向培养皿中加入裂解液，通常6孔板150-200ul/孔，12孔板50-60ul/孔，冰上放置，摇床20min3、用勺子刮下细胞，并吸出液体至1.5ml离心管中，勺子在处理不同样本前清水洗净、擦干（注意冰上操作）4、超声处理（可选）注意蛋白悬液放于冰上，15sec处理，dutycycle50-60每次处理后清水洗探头、擦干，再作下一个5、于4c下12000rpm离心5min。6、将离心后的上清分装转移倒1.5min的离心管中放于-80C保存。（2）组织中总蛋白的提取：1 .将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（5ml离心管）。2 .匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆

9、后置于冰上。3 .10,000g,4C,10min,（5ml管）.取上清至1.5ml管，12,000g,4C,60min,.取上清至新1.5ml管,-80C储存（二）蛋白含量的测定1、从-20C取出1mg/mlBSA,室温融化后，备用。2、取7个5ml离心管，分别加入1mg/mlBSA:0、10、20、40、60、80、100ul,用蒸储水补足各管至100uL3、样本取5ul,加蒸储水95ul,使总量亦为100ul,混匀。4、各管加G-250溶液2ml混匀，室温静止2分钟。5、混匀后，在生物分光光度计上比色分析，测定595nm的光吸收，测定时浓度由低到高。6、于Excel根据标准品绘制标准曲线

10、，根据得出的公式计算样本浓度。（三）SDS-PAGE电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸储水冲洗干净后立在筐里晾干。（2）灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边）2、按前面方法配10%下层胶（15ml,两块胶，每块胶在6.5ml左右），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶后胶上加一层正丁醇（1ml左右），液封后的胶凝的更快。3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。弃去正丁醇，用水冲洗，并用吸水纸将水吸干。4、等待胶凝期间可计算含50-100ug蛋

11、白的溶液体积即为上样量（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量），目的蛋白GluT3一般在20-30“左右。取出上样样品至200“的EP管中，加入4X上样缓冲液及DTT至终浓度均为1X（上样总体积一般不超过30）。上样前要将样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性（亦可以使用PCR仪进行变性，加快速度，这样就不用将水煮沸了）。5、按前面方法配5%的上层胶（6ml,两块胶），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中（从梳子的一头开始插）。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小（也提示胶已经凝固），从而

12、使加样孔的上样体积减小，所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶（不补胶问题也不大）。等待上层胶凝固期间配制1X电泳缓冲液。6、加入1X电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。*电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的上缘（量要足够多），否则电泳期间会出现电流过低的现象，进而影响电泳的效果。7、上样（注意：最外两泳道易跑歪，尽量不用。）Marker6科l（Marker加在最边上的加样孔中）样本20-30科l实验所用Marker电泳后出现10条带：10,15,25,35,40,55,70,100,130,170KDa（3）电泳：电压100V,电流300mA，功率50W,时间1.5hour。（

13、电泳15分钟后可调节电压到130V）电泳至澳酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好）。电泳结束前20分钟配制1X转膜缓冲液。（四）转膜（1）转一张膜需准备4张滤纸和1张硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套（因为手上的蛋白会污染膜）。将切好的硝酸纤维素膜和滤纸置于1X转模缓冲液浸湿。（2）夹子黑的一面：海绵-2张滤纸-胶-NC膜-2张滤纸-海绵将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫二层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）先将玻璃板撬开，随后将浓缩胶轻轻

14、刮去，小心剥下下层胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将硝酸纤维素膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖2张滤纸并除去气泡（膜盖下后不可再移动）。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。如果同时做两块胶，转膜的时候应记住样本的位置。（3）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用100V转移1.5h。* 实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫两块硝纤膜，以免转膜过头，因为如

15、果第一张膜上蛋白质已经转过了，第二张膜上还有蛋白质可以进行检测；对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点，一般80-100V,时间也要延长一点，开始最好也用两块膜，特别是务必注意加强降温措施。当然转膜是要摸条件的，最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。如果由于时间原因来不及做下面实验，可以在4度下12V转膜过夜；硝纤膜建议使用0.22科的小孔径膜，不容易转膜过头；不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换用转膜装置，最好再摸个条件；转膜时电极方向注意是膜正胶负。如果同时做两块胶，转膜结束应在膜上做标记，以便查询相应样本。转膜结束前配制封闭液（5%脱脂牛奶）及1XTBS嗡冲液。（五）免疫反应（1）

16、封闭：将膜用移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2ho一抗a.用parafilm膜制作与膜大小相同的槽；b.从封闭液中取出膜，1XTBST5minX歆;c.将一抗用封闭液稀释至适当浓度（目的蛋白GluT31:300,actin1:2000）;d.将膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗体，室温下孵育1-2h后（目的蛋白GluT31.5h,actin1h）,4度过夜，次日用1XTBSTft室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。（3）二抗同上方法准备二抗稀释液（目的蛋白GluT31:1000,actin1:1000）并与膜接触，室温下孵育1h后，用1XTBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。（六）化学发光，显影，定影（1）将A和B两种试剂等量（常用各500“）在5ml离心管中等体积混合；打开X-光片夹，铺上保鲜膜，将NC膜面朝上放于保鲜膜上，滴加此混合液1-3min后（见到荧光），用保鲜膜包好。将1X显影液，自来水和定影液分别到入盘中；在红灯下取出X光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）;把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时