实验4 淡水绿藻分离纯化与种群增长影响因素分析

1、实验四 淡水绿藻分离纯化与种群增长影响因素分析一、实验目的1.1了解常用的藻类培养基配方、适用性及其配置方法。1.2 掌握常用的藻类分离纯化技术，熟悉藻类的培养设施。1.3 测试光照、温度、盐分、pH值等不同生态因子对藻类种群增长速率的影响。1.4 了解藻类的分子系统学等鉴定方法。二、实验原理2.1纯培养藻类培养首先要有藻种。从天然水域的混杂生物群中，用一定方法把所需藻类个体分离来，而获纯种培养。真正的“纯种培养”是指在排除包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。这是进行科学研究不可缺少的技术，而在生产性培养中不排除细菌的称之为“单种培养”。用作预备培养的培养液，各种藻类是不同的，对一些难以

2、培养的藻类一般加入土壤抽出液较好。预备培养液营养成分浓度应小些，一般只有原配方的1/41/2。如水样中藻类种类较多，就应使用几种不同的培养液，使藻类在适合于自己繁殖的培养液中繁殖起来。可用三角烧瓶或试管作培养容器，加入容量1/41/3培养液。然后把经筛绢过滤除去大型浮游生物的水样接种进去，放在合适温度下或室内靠北窗口下培养。在培养附着藻类时，容器可静止不动；而培养浮游藻类时，应该每天摇动一次。有的藻类在普通培养液中完全不能繁殖，有的繁殖非常困难。此时需改变培养液浓度，加入葡萄糖、蛋白胨等有机物，补充微量元素和辅助生长物质，加入土壤抽出液，就有可能获较好效果。2.1 培养基配方的选择藻类培养基的

3、配方极多，每种配方主要适用于一定藻种，表1列举的是比较常用的几种。 水生4号和克诺普（Knop）培养液，一般用于绿藻；蓝藻可用朱氏10号或水生105号无氮培养基（后者适于固氮蓝藻）；硅藻可用朱氏10号和水生硅1号培养基；另外还有海产绿藻、硅藻的培养基。2.2 培养基的配制原则1）要有适量氮源（除固氮蓝藻外），如氨盐、硝酸盐、有机氮等；2）应包括主要元素钾、磷、镁、硫、钙等；3）要考虑各种盐类总浓度和pH是否适合藻类需要，可用碳酸氢钠调节pH；4）要加入各种藻类需要的微量元素，如铁、锰、铜、锌等（后几种包括在土壤抽出液中）；5）要满足某些藻类特殊需要，如蓝藻需钼，硅藻需硅；6）要添加适量生长物质

4、如维生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。2.3 基础培养基的配制方法表1各种培养基的用水量都是加至1000mL，海藻培养液用海水，如无海水可用淡水1000mL加30克食盐代替。土壤抽出液用菜园土1份和水2份比例混合搅匀，静置，取上清液；海泥抽出液也可用同样比例制备。如配制固体培养基，可在培养液内加入1.5琼脂。2.4 土壤抽出液制作方法1）先在试管底部，加入高约1cm土壤（采用腐殖化的农田和庭院土）；2）再加入水使达5cm，塞上棉塞，采用蒸气间隙灭菌，每天灭菌1小时，连续二天（备注：由于气泡上升，棉塞可能弄脏，因此最好先在水中煮一段时间，使气泡跑掉后，再加棉塞进行灭菌）。三、实验仪器药品移

5、液器 (200 ul， 1000 ul)，15 ml试管及配套试管塞，1.5ml EP管，9cm玻璃平皿，封口膜，保鲜袋，手套，口罩，超净工作台，显微镜，温度计，电导率仪，pH计，光强测试仪，光照培养箱，表1所列全部试剂。四、实验内容和步骤4.1 培养基的配制按表1配制水生4号培养液，调节pH值至7.5（左右）。固体培养基则在培养液内加入2.0%琼脂。配好的培养基于高压灭菌锅内121灭菌20分钟，待用。液体培养基可分装入已灭菌的试管中；固体培养基待冷却至50后，在超净台中倒入预先灭过菌的玻璃平板中。4.2 样品的采集与富集培养采集湖泊或池塘中藻类的水样，置于干净的三角烧瓶中，放在合适温度下或室

6、内靠北窗口下培养。在培养附着藻类时，容器可静止不动；而培养浮游藻类时，应该每天摇动一次。 4.3 藻类的分离培养（1）稀释分离法 把含有需要分离的藻类而又混杂有其他生物的水样，取其一定量，用培养液稀释。通过稀释到适宜程度的方法，达到把原混杂生物单个分离培养的目的。在无菌条件下采用逐步稀释的方法， 边稀释，边在显微镜下镜检，直到镜检视野中每滴样品只含有23 个细胞时，即停止稀释，开始分接培养。具体过程如下：1）取已灭菌的1.5 mlEP管数个，在第一个试管中加藻液样品1ml，其他EP管中加入一定体积的无菌富集培养液0.5ml；2）从第一管中取藻液0.5ml 加到第二管中，充分振荡，使均匀稀释，此

7、时藻液被稀释了2倍；3）再用一支新的消毒刻度移液管，吸取第二管中的稀释藻液0.5ml 加入第三支试管中， 如前振荡，使均匀稀释，此时藻液被稀释了4 倍；4）以后依次同样滴入第四管、第五管中，充分均匀稀释，当滴至第五管时，此时藻液被稀释了16 倍，镜检发现每滴稀释样品中只有2-3 个细胞， 可以用这样的藻液进行培养；5）从稀释16 倍的藻液中各取0.2 ml滴入1个含5 ml新鲜培养基的灭菌的试管中培养，在培养过程中，将试管放在有漫射阳光的地方，每日轻轻摇动几次；6）1-2周后镜检，有的则既含绿藻，又有杂藻，将之舍弃；7）又过1-2周， 藻体不断繁殖， 培养液颜色变绿，再次镜检了所有的试管，有的

8、试管中含有大量的单一绿藻A，有的含单一绿藻B，有的多种绿藻并存，有的含有绿藻与杂藻并存，再次舍混，留纯。此时已达到了分离、纯化的目的。（2）平板划线分离法1) 采回后经富集培养的含藻水样， 不用稀释， 用一支无菌接种环蘸取一滴，在无菌平板培养基上轻轻划线，划3-4 条以后，把接种环在火焰上灭菌后，再通过第一次划线区，以70 度左右的夹角，换一个方向第二次划线3-4 条。2) 以同样的方法做第三次、第四次划线。然后盖上培养皿，用封口膜封口后，置于恒温、恒湿，具有适宜散射光照的培养架上培养。3) 两周后可见到第一、二划线区有连成一片或密集的藻落出现，而第三、四划线区则零星地出现一些颜色不同的孤立的

9、藻落。4) 培养2-4周时， 用接种针从第三、第四划线区挑取离相邻藻落较远的、绿色的藻落，在显微镜下检查，找到纯种藻落时，将该藻落用无菌解剖针挑入含有新鲜培养基的无菌试管中，在适宜条件下在恒温光照摇床上继续培养。5) 1-2周试管中的液体呈均匀绿色时，再一次镜检，确定没有其他藻类、其他生物侵染时，即成功地得到单种培养的绿藻藻种。4.4 藻类鉴定和种群增长影响因素分析通过上述分离培养获得的藻种，显微观察和画示意图，通过藻分类学参考书进行藻种鉴定。测试光照、温度、盐分、pH值等不同生态因子对藻类种群增长速率的影响，具体实验过程由同学们自主设计试验方案，待与老师讨论后执行。4.5 藻类的分子鉴定（有

10、深厚兴趣的、实验技术扎实的，学习态度好的同学可以找老师选做）分子鉴定实验大致流程：将纯养藻类10-50 ml离心后，藻细胞沉淀采用CTAB法提取基因组DNA，之后采用真核细胞通用引物对备注：4条基因核基因组rDNA的18S rRNA gene、内转录间隔区(ITS)、内转录间隔区2(ITS-2)和叶绿体rbcL基因中筛选出最为适用的引物对，进行PCR扩增和测序鉴定，具体实验步骤参见环境生物技术实验实验一甲基营养菌的分离与鉴定。五、实验结果分析与讨论六、作业1. 除了本讲义所列2种藻类分离纯化方法外，再列举2种以上其它的藻类分离纯化方法。2. 你认为藻类的分离培养成功与否的关键是什么？3. 影响

11、藻类种群生长的生态因子有哪些？结合试验结果谈谈藻类种群增长的规律？4. 通过期刊网查找藻类的鉴定方法？成功案例中国藻类学会第八次会员代表大会暨第十六次学术讨论会论文摘要集2011年加入收藏 获取最新产油微藻O.multisporus的分子生物学鉴定杨勋 刘平怀 时杰 郝宗娣 张森 【摘要】：从海南淡水水体分离得到一株富油微藻,通过形态观察及分子生物学鉴定其为Ourococcus multisporus。微藻DNA提取采用生工SK1375真菌基因组DNA抽提试剂盒,所提DNA于-4冰箱保存备用。DNA扩增采用真核生物18S rDNA扩增通用引物18SF(5-CCTGGTTGATC CTGC CAG-3)和18SR(5-TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3)。PCR反应条件为98预变性5min,然后9535 S,5535 S,7240 S,35个循环后于72延伸8min。PCR产物经电泳后采用生工SK1131胶回收试剂盒回收,将目标片段连接到PUCm-T载体上克隆,选择阳性载体测序。获得测序结果后,用BLAST软件对基因序列的同源性进行分析,从数据库下载相似的18S rDNA部分序列,