westernblot操作步骤

1、westernblot操作步骤背景：蛋白质印迹的发明者是斯坦福大学GeorgeStark。NealBurnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中首次被称为WesternBlot。最开始做印迹的是一个叫Southern的科学家，但印迹的对象是DNA链，他把这种技术称为Southernblot,后来出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对RNA,一个对蛋白质，人们分别把这两种技术的称为Northern和Western,与这两个技术的发明人没有关系了。一、蛋白质的样品制备由于这一步方法各异，具体步骤请参考试剂盒的说明书即可。蛋白质的样品制备是Wester

2、nBlotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（加入合适的蛋白酶抑制剂）。样品建议分装成合适的量（比如分装出20ul检测蛋白质定量用），然后保存与-20或-80C中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。若蛋白提取过程存在问题或蛋白发

3、生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了。除此之外loadingbuffer的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时也应注意将样品与loadingbuffer混合均匀。二、蛋白质定量如果要定量的话，一般选择BCA或者Bradford方法，BCA要求检测波长为562nm,Bradford为595nm。具体方法见各试剂盒说明书。为避免假阳性结果，建议先把lysisbuffer加入BCA工作液或考马G250混合看是否产生颜色。测完蛋白含量后，计算含50100ug蛋白的溶液体积即为上样量（一般8cm宽的迷你胶每个泳道最大能承载的蛋白质量为150ug,所以如果从组织提取蛋白

4、的话上样量不宜过大）。网上有人喜欢等质量上样（即每个泳道的上样体积不一但质量一定），也有使用等体积上样（即先把各个样品稀释到某一固定浓度，然后等体积等质量上样，计算上样体积时需包含loadingbuffer的体积）。按分子克隆的说法，还是使用等体积上样比较好。上样总体积一般不超过15ul,加样孔的最大限度可加20ul样品。上样前要将样品置于烧杯内，将烧杯置于石棉网上用酒精灯加热至沸腾，在沸水中煮35min使蛋白充分变性。也可以使用PCR仪95°加热5min,效果佳，操作方便。之后样品可以在4c冰箱短时间保存，也可在-20冰箱保存数月，但是反复冻融会使蛋白质的抗原特性改变。三、SDS-

5、PAGE电泳1,清洗玻璃板：蘸点洗洁精轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸储水冲洗干净后立在筐里晾干。若不继续使用，需用无水乙醇擦拭后晾干再妥善收起来，玻璃板之间垫玻璃纸隔开。梳子应用水洗干净，临用前用无水乙醇擦拭晾干。2,灌胶与上样玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶（操作前先往玻璃板间灌水，检查是否漏）。按配胶试剂盒说明书选择合适的分离胶浓度配置，最后加入TEMED,之后摇匀即可灌胶。配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜，特别是过硫酸镂。灌胶时掌握好速度，避免气泡产生（注意浓度越小的胶含水越多，凝固后胶体积缩小越多）。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快（灌胶时

6、开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形）。未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴手套防护。梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡。注意给积层胶留出足够的空间（分子克隆推荐长度为插入的梳齿长再加1cm）。当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等几分钟觉得差不多的时候就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。聚合时间由AP以及TEMED决定，通常在30min左右，AP不新鲜会导致聚合变慢，气温较低时胶是会凝得慢一些，必要时可适当增加AP以及TEMED的量，但通常不会超过1h,若超过1h甚至更长仍未聚合，应检查配

7、制的操作有无错误。由于TEMED催化APS释放相关化学基团，再由APS释放的基团催化Acr/Bis聚合，所以如果APS不新鲜的话加再多的TEMED效果也不佳，这就是为什么推荐APS每周新鲜配置的原因。按说明书配积层胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固前最好在两边补胶至刚刚冒顶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。趁积层胶聚合的这段时间，取适当体积样本混合1XSDSloadingbu

8、ffer（最好事前分装好，每次从冰箱里取一管即可），95100°加热5min,若有沉淀可用稍低温度，比如4555°加热1h达到变性的目的。我一般习惯分装20ul到PCR管里，先和loadingbuffer混合好，临用前用PCR仪加热95C5min,效果不错。胶做好后连同玻璃板一起安装到电泳槽上，加入电泳缓冲液后开始准备上样（我们使用的是大连竞迈科技公司的MV-III型小型单垂直板电泳槽，电泳液至少要漫过内测的小玻璃板，电泳槽下面不用倒太多电泳液）。加样前可用5ml注射器或加样器先冲洗一下加样孔。用微量加样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加

9、入样品（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。目前我们做的mini胶上有10个上样孔，一般在第一个孔加入marker（我用的是Fermentas预染marker）,其余9个孔加入样品，也可在头尾孔内加入marker,中间8个孔加样品。加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品。在未加样的孔中应加入等量的样品缓冲液。上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。也可使用10ul的枪头就行，比用微量加样器快很多，用枪头时注意不要插得太深，容易把玻璃板撑开，样品就落到胶和玻璃板之间的空隙了。3.电泳电泳槽内加入电泳缓冲

10、液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺，网上有资料建议低电压短时间的预电泳，清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通，但是在分子克隆上却反对这种做法，理由是会破坏缓冲系统pH的不连续性。请各位按照实际经验来做即可。电泳时间和电压说法各异。按照各实验室的惯例或者电泳槽的使用说明来操作。电泳至澳酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应直接或者转印。四、转膜我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。对于转印90kd以下的蛋白，转膜液都不用加SDS,如果是蛋白分子量大的话可以加入0.037%的SDS。1.在电泳Z束前20min开始准

11、备转膜所需的东西。转一张膜需准备6张的滤纸（长一般为8.18.3cm,宽度根据裁的胶大小实际测量，但胶一般会缩水，所以裁8cm就行）和1张PVDF膜。切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。PVDF膜使用前用无水甲醇中浸泡1min2min。目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。.将玻璃板撬开才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附带的塑料除霜铲，效果出奇的好）。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶

12、刮破。也可取10ml注射器吸满转印缓冲液，往玻璃板与凝胶之间注水，使液体的压力将两者自然分开。取出凝胶后应注意分清上下，可以在右上角裁一个小角。之后有两种方法供选择，一是按照marker指示，把含有自己感兴趣的蛋白的胶裁下来，二是把整张胶转膜，前一种方法更加节约材料，但操作稍微麻烦了一点。在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇白PPVDF膜和滤纸，平衡10min左右，也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的SDS。.带上手套，平放转移槽的底座，依次在石墨电极上叠放3张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF膜（此时可在PVDF右上角减去一个角，以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面）、刚刚完成电泳的凝

13、胶和另外3张浸泡过缓冲液的滤纸。用枪头或移液管在叠层的滤纸上滚动，除去气泡。注意每叠一层就要用玻璃棒或圆筒试管赶去气泡，因为一个气泡的厚度对于蛋白来说都是十万八千里的。用干净纱布将叠层上面和周围的多余缓冲液吸干（这一步很重要，宁可太干也不能太湿，太干容易烧胡，太湿的话多余的缓冲液会导致电流短路，大大降低转移效率，如果同时转好几条胶的时候更要小心，有一个胶短路就会影响整体的转移效率）。最后将转移槽的上盖扣上，接通电源开始转膜。由于设备昂贵，第一次操作应向熟手请教，否则短路可能烧坏设备！转完后立即清洗设备，特别是金属上盖，转膜液特别容易在金属上盖上形成结痂，影响设备的正常使用，我们实验室今年做we

14、stern的同志因为忽略这一点，转膜仪烧坏了好几次。2 .依据分子量大小电泳1560min。如果初次转膜，可以根据一般经验，即多少kD的蛋白就转多少分钟，再根据结果调整时间。之后断开电源，取出转移膜进行后继实验。.为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染。传统方法是将膜用1X丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。实际上更常用且简便的方法是先将膜晾干，然后浸入20%的甲醇，待完全浸湿后取出透光观察即可看到蛋白条带（此方法仅仅适合PVDF膜）。将膜晾干备用。使用预染marker话可以看见marker的颜色转印到了膜上，但是

15、凭借这个颜色来判断是否转印完全或转印过头是不可靠的。五、免疫杂交反应.将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h即可。如果是自己配置的封闭液，最好过滤一下以消除固体杂质。实际经验表明与其封闭过夜，不如一抗孵育过夜，具体原因可以参考这个帖子：稀释后应在2-3天内使用，4度保存，避免反复冻融。）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡（也可使用手术室的病理袋，质量不错，减去下面的折叠部分，用封口器（4080元一个）封上，不漏液即可）。

16、37°孵育1h之后转移到室温下再孵育1h（或者4°孵育过夜），用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min;再用TBS洗一次，10min。也可以多洗几次，比如4次，每次5min。.在培养皿内加入二抗稀释液（10ml足够了，一般1:1000甚至1:10000用TBST稀释），放在摇床上，室温下孵育12h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min,进行化学发光反应。选择好一个合适的条件不要轻易改变，另外相比一抗，二抗作用的时间应严格控制，实践证明一抗时间长点可能没什么关系，而二抗时间若过长过短都将会直接影响结果。二抗孵育之后还要注

17、意好好洗涤，否则显影是背景可能脏。1 六、化学发光（ECL）,显影，定影.现在工作台上铺一张保鲜膜，将PVDF膜放在保鲜膜上。将ECL的A和B两种试剂在EP管内等体积混合（注意吸完A试剂后吸B试剂前要患枪头），然后均匀滴在PVDF膜的蛋白面，反应12min后，将PVDF膜上多余的ECL工作液吸干，之后转移到在X片夹中预先铺好的保鲜膜上一侧，把另一侧翻过来盖在其上。用透明胶把保鲜膜固定在片夹上。.在暗室中，将1影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）;打开X-光片夹，把X-光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据

18、信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min到2min,也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果（也有人重叠压好几张片，固定曝光510分钟，从这好几张片中选出最合适的底片）；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为12min（2025C）,温度过低时（低于16C）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为510min,以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干（注意：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响）。X光片一般选用柯达原装的生物实验专用

19、柯达X-OMATBT胶片。显影液和定影液最好每周配置一次，避光室温保存，显影和定影液是最便宜的试剂了，千万不要因为它而影响了整个结果。七、凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值，比如bio-rad的QuantityOne。如何使用请看这里主要参考资料WB实战指南+正确使用QuantityOne定量byjacqueslm2001附：WesternBlotQuickGuide（以及Western的时间规戈U）前期准备：蛋白已经定量，各样本已经稀释到某固定浓度，已经和SDSloadingbuffer混合，已经分装好，保存与-20o头天下午或晚上配胶，分离胶

20、和浓缩胶一起配好，带上梳子，放入潮湿的自封袋内放入4°冰箱备用。8:00从冰箱里取出蛋白样品，用PCR仪95度加热5min。混合均匀并离心。8:30取出昨晚配好的胶，组合，加电泳液。在电泳液里拔梳子能稍微容易一些。用10ul的枪加样。9:00开始电泳。恒流30mA一般1个小时足够了。9:30开始准备转膜用的滤纸和PVDF膜，PVDF膜泡甲醇。一般8cm的宽是固定的，所以如果要裁胶的话可以先大概估计一下。10:10电泳结束（假设电泳用了70分钟），起开玻璃板，裁出胶上所要的条带，如果整块胶转就更方便了。把胶放在盛有转膜缓冲液的培养皿里。11:00转膜开始（这里裁纸和铺三明治还是比较费时

21、间的，我一般要用30分钟到50min,所以这里要抓紧时间）。12:00转膜结束（这里按60min的半干转的时间来计算）。开始封闭1h。13:00封闭结束，开始孵育一抗（在这里你可以选择一抗孵育过夜，如果不过夜的那一天就能结束），如果不过夜的话我一般选择37°1h然后在室温（23°左右）再1h。15:00一抗孵育结束。TBST洗涤3*10min或者5*6min。15:30开始孵育二抗。室温1h足够了。16:30二抗孵育结束。TBST洗涤3*10min或者5*6min,这里推荐采用5*6min。17:00ECL发光，压片10min,显影1min,定影10min,那么在18:00

22、之前你就能看到结果了，呵呵，如果结果不好还有后招，用stripping（一抗二抗洗脱液）洗涤，我用的是碧云天的碱性一抗二抗洗脱液，按照说明书来一般20min就行，然后洗涤几次，重新封闭1h,然后一抗过夜，明日在继续战斗。这样的话18:30之前也能结束战斗了。附：我的五年westernblot体会.抗体的选择对于国内的大多数实验室来讲，做westernblot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区的实验者而言，感触尤深。在这五年的westernblot实验历程里，我先后用过进口抗体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不

23、齐。进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的价最贵；比较有性价比的是CST的抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种，1:1000的稀释比下，还没有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和westernblot实验，还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗体质量可以，但是选用Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好抗

24、体的比例约为50%,如果能做出来，也存在一个问题，就是抗体大多只能用一次。我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对（抗体品种，货号等完全一致），在都能做出来的前提下，原装抗体能重复使用的次数要多出许多。具体原因我已经揣测了好几年，不敢说出来，我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖，也会有所不同。揣测归揣测，假如只为了发论文毕业走人，可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。国产抗体比较知名的就几家，但质量确实不敢恭维。westernblot能做出来的确实不多，而且杂带多，背景不干净。我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化，怎么说呢，应付硕士论文够了。我也帮别人自制过抗体，再用抗原亲和纯化。效价

25、非常不错，夸张的时候1：10000都能做出条带，唯一的麻烦是兔子太骚（骚臭），不知道这是不是“兔女郎”名号的来由。如果读书非常悠闲，老板又特别想拥有手工作坊的情况下，可以自己伺候折腾兔子来玩玩，刚开始的时候还是蛮有成就感的。只是单凭抗原表达和制备多抗，是不是可以写成论文毕业，估计因校而异了。.WesternBlot设备目前最好的垂直槽和转移槽还是Biorad（伯乐），尤其是MINI3好用，MINI4可以一次跑四块胶，但通常用不上，由此造成垂直缓冲液的浪费，而且MINI4用绿色塑料夹住玻璃板来组成内槽，容易漏液，塑料夹应该是有疲劳寿命的，估计日子一长，弹性就会改变，所以如果你们实验室刚买了MIN

26、I4,赶紧用，遭殃的肯定是某一级的师弟师妹们。Biorad的一套系统得两万多，西部能玩得起伯乐的还真不多。好在咱中国人聪明，上海天能的外观和构造和伯乐的MINI3几乎一模一样，而且可以通用，不带电泳仪是5千多一套，挺好用的。唯一的不足是塑料寿命不如伯乐，胶架容易断裂。不过仔细算算，三套天能也就是一套伯乐的价格，值了。北京六一的垂直槽很转移槽很好用，但垂直槽配胶不方便，玻板太厚，散热不好，但能用，六一的电泳仪（电源）还是很好用的。.WesternBlot实验条件WesternBlot实验条件我基本是按ABCAM公司经典教材做的，按以下的网址下载下来就可以了（要强调的是垂直电泳缓冲液千万不能回收用

27、，具体愿因你只需上网查查SDS-PAGE的原理就知道了。转移电泳缓冲液可以回收再用两次。转膜我通常是快转两百200毫安/2小时，慢转80毫安/12小时。快转是一定得做冰水浴，就是把槽子泡在冰水混合液里。封闭我通常用BD的脱脂奶粉，不归，260元500克，也是从北京华美买的。ECL我用pierce的，500毫升1650元，比国产的还便宜好用。胶片是柯达的，以前用过乐凯的，不如柯达。我很少用丽春红或考马斯染膜或染胶，总觉得是脱裤子*的事。.WesternBlot实验关键WesternBlot操作步骤多，每一步的失误都会造成全盘失败，综合而言，抗体仍然是决定成败的关键，如果抗体很滥，就是神仙也没招。

28、其中内参抗体很重要，因为内参抗体的选择关系到全盘实验的考评。Actin,Tubulin,GAPDH我都用过，Actin,Tubulin的缺点是有时候会出现复带，比较稳定的还是GAPDH。如果用心看看cell,nature,science上的文章，大多用GAPDH做内参。进口的，国内分装的，国产的，我都用过。进口的最强的1:10000者B能做出条带（Upstate,现在被Minipore招安了），国内分装的也好用，但就是不好回收重复使用，国产的一般只能用一次。我要特别强调的是，实验室里最贵的抗体实际上是内参抗体，因为只要WesternBlot开工，每次都得用内参抗体，而一般目的蛋白的抗体也就用几

29、次，重复三次就了事。但内参抗体是不折不扣的耗材，严格意义上将，每跑一次胶，就得杂一次内参，使用频率最tWj决定了内参是最花钱的抗体。我也自己制备过内参抗体，但好像因为种属同源性太高，背景总是不干净。进口的好，太贵；国产的只能使用一次，年终算账，不比进口的便宜。我自己的体会是多抗制备并不是技术含量极高的事，为什么国内企业高的早不了，低的造不好呢？现在我用的是杭州贤至的GAPDH兔多抗，200微升420元钱，我在蛋白上样量12微升/孔的情况下，按1:2000稀释比，条带非常清晰，没有杂带，是我目前用过的最好的国产抗体，我估计按1:4000照样能做出来，因为按按1:2000稀释做，在暗室里点上ECL

30、后肉眼清楚地看到荧光条带。抗体我在不加叠氮化钠的情况下4度过夜杂交，可回收重复使用5到6次。最早我是2008年在丁香通上看到了杭州贤至（当时名叫杭州松华）发布的广告，我就怂恿实验室主管买了2支，很好用，现在实验室都没有用完；2009年我的一个朋友做western,我推荐他又买了1支，做出来的效果确实好，2009年底我到了新的实验室，western的全套我在新实验室重新建立，啥都采购齐了，可就是买不到杭州松华的内参抗体，我上网再也找不到这个公司的网页了，没办法，只好一直噌朋友的内参抗体用。我有个陋习，就是实验中用顺了用稳定了试剂轻易不愿意更换品牌。还好，今年7月份我终于找到了当年的通讯记录，一联

31、系才知道他们改名叫杭州贤至生物科技有限公司了，呵呵，改了个名，害我找了大半年。第三次买到的GAPDH内参抗体，还是好用，1:2000,条带清晰，回收重复用，照样work,截止目前，我的新导师对我采购的一堆试剂还没有不满意的，嘿嘿！草根出生，我也照样有我穷人的劳斯莱斯。.关于奶粉，膜的选择和显影定影奶粉看似简单，其实很重要，如果要凑合，可以到超市买光明的脱脂奶粉。奶粉质量不好，会最终导致显影要么漆黑一片，要么啥都没。fluka的很好，可惜因为疯牛病的原因，现在海关禁止进口美国牛制品。我现在用的bd的，很好很稳定，如果回收使用，500可以用很长时间。细菌达到一定极限后，会导致tbst里的奶粉*变质

32、，表现为发绿发臭，一种肉眼可察觉的淡淡的绿，一种鼻子凑过去能嗅出的臭，这时候就得扔了。nc膜，pvdf膜我都用过，现在我已经固定下来用密理博的0.45微米的pvdf膜。pvdf膜的好处是蛋白载量大，韧性好。唯一的麻烦是事先得用甲醇泡几分钟，目的好像是为了增强膜的正电荷。甲醇泡完后，得在转移缓冲液里泡一两分钟。国内用nc膜的人多一些，主要是因为nc膜有分装的小片，忽悠老板买一张膜就100元钱，老板肯定乐意，若是说膜得花上千元，老板就有可能长时间的*思考，然后过些日子再答复你。所以大多数人会采取前一种方式，当然得告诉老板好几次，膜就100元钱。我第一次用到pvdf膜是和好几个实验室合资买了一卷，我

33、出了475元，类似于打的拼车的方式。现在pvdf膜国内大概是1600元到1700元一卷，33厘米*375厘米，够好几个人用好长时间了，膜假货不多，至少我没有见过。我们几个拼车的穷弟兄拿着尺子分赃的时候才发现本地供货商给我们送的货少了80厘米，嘿嘿，穷鬼撵着杀叫鬼，我们花钱容易吗！所以交涉，再交涉，直到他把我们的血汗膜返还才罢休。现在我基本是从北京的欣津科和华美买，大概1700元一卷，完完整整。0.45微米的pvdf膜我用5%的脱脂奶粉（溶于tbst中）室温封闭1小时，0.22微米的用8%的脱脂奶粉。bsa我很少用，主要是bsa会出现封闭不均匀的情况。我也很少用0.22微米的膜，原因是背景不干净

34、，再者无论是封闭时间还是洗膜时间都得延长。标准教程上推荐20kd以下的分子用0.22微米的膜，我杂过最小的分子是cleaved-caspase3,12ka,按我在一楼的转膜条件，在0.45微米的膜上清清楚楚。我在上海的师弟他们转7ka的分子也用0.45微米的，没出过事。废话一句，我师弟的实验室可是国家重点，那个富呀，让我闭上眼想想吧，那可是屎壳郎掉到了化粪池的感觉。一抗我一般4度摇床过夜，洗膜3此，每次5分钟。要注意的是，如果一抗里添加了叠氮化钠，务必洗膜5次，每次10分钟，因为叠氮化钠会灭活二抗偶联的辣根过氧化物酶（hrp）活性。二抗我用的是中杉金桥分装的，120元一支，通常1:5000,室

35、温1小时，然后洗膜三次，每次5分钟。奶粉，一抗，二抗，我都回收，从开始到现在，一直如此。因为我不敢忘记自己贼的出身。我的一抗是国外的一位老师送给实验室的，刚开始的半年我啥都做不出来，以至于导师在平安夜领我到教堂祈祷。上海的师弟知道后，每次裁膜的时候给我一小片一小片日积月累了一些，二抗只拿到了10微升，我怕实验室的人发现，一直是熬夜做westerno可最终还是因为我自己嘴不牢靠，导致东窗事发，师弟险些被开除，事情败露的那天，师弟在长途电话的那边哭，我在这边哭，写着写着，我的眼泪又一次的盈眶而出，说不出的辛酸与悲凉，师弟说他承担一切责任，让我装作不知道，那天晚上，我给他的导师写了一封长信，只求能保

36、住师弟。老天保佑，他导师让师弟写检查认错。那以后，我再也没有让师弟为我偷过东西，我不能再为自己的理想让朋友付出代价。虽然现在实验室的老板比较大方，我依然坚持着回收试剂的习惯，我始终不能忘记自己westernblot的开始。一般8.3*4.3厘米的膜，大概要400微升的ecl混合液。加ecl我一般就在灯光下，或者白天把窗帘拉上。加好ecl,覆上保鲜膜后，我才端着暗盒进暗室，暗室里我的暗室红灯始终开着，没有那么可怕。在暗室里，我一般是剪4张同样尺寸的胶片，叠在一起，压在膜上方，暗盒一扣，就干别的事情去了。5个小时或过夜，我再把胶片显影，显影我起初很注意技巧，但现在基本上是在显影液里放10分钟，捞出

37、来放到水盘里涮一涮，然后在定影液里放十分钟。我一般总能找到一张理想的胶片，因为胶片叠加到一起后，层层屏蔽，从而逐渐递减荧光强度，我试过多次，即便是荧光强度最强的内参，也至多能达到最上面的第四层胶片。所以显定影后，肯定有曝光过度的胶片，但也肯定有趋势，背景，强度恰到好处的一张，嘿嘿，傻瓜做法。傻瓜做法看似呆笨，实则不然。我在很长的一段时间里，都是读秒，或三分钟，或15分钟，或半小时，或1小时取出胶片显影，眼睛紧紧盯着，一看到条带就捞出来定影。如果不理想，再压胶片，再等，再取再投再捞，活脱脱是个“猴埋儿”。西北人传说小猴夭折了，母猴把小猴埋到土里面，一会又挖出来，再埋进去，又挖出来.反复无止。显定

38、影时如果采取猴埋儿式的技巧，是最费胶片，最费时间，最费心力的做法。所以我是傻瓜就用傻瓜的办法。我用过好几个品牌的国产ecl,和进口的ecl也做过对照。国产的一半是a液b液总共50毫升180元钱，单价3.6元/毫升，一般肉眼可见的荧光强度可持续1个小时，pierce和milipore的可以持续3小时。milipore的麻烦之处在于由a液b液c液三组成分组成，费枪头，费脑子。现在我固定使用pierce的superecl,1650元500毫升，折算下来是3.3元/毫升。上海吉泰是代理。好像分子克隆上写出了ecl的配方，技术含量并不高，胶片我用过医院放射科的，乐凯的，柯达的，柯达现在小胶片（小暗盒尺寸

39、）好像是130元/50张，乐凯的是其价格的一半。乐凯的缺点在于胶片容易出现划痕，有莫名奇妙的背景，虽然瑕不掩瑜，但还是让人不爽，再就是感光不如柯达的灵敏。这些我都比对过。如果细心地把二者胶片厚度比比，也可看出差距。我就此请教过甘肃的乐凯总代理，他说根源出在牛身上。显影液定影液我一直用乐凯的，便宜，量又足，谁用谁说好。进口的从未染指，连想都没想过，呵呵，我内心里还是极其渴望支持国货的，爱之深，恨之切啊！6后记从2005年第一次见到抗体到现在，我已经做westernblot实验整整五年了。五年里，太多的磨难，太多的惊喜，太多的感触，太多的代价。现在我做博士后，我指导的学生也能一次就上手，虽然他们也会出错，但我很少责备他们，因为我知道自己的路途也并不顺利，如果过度的责难他们，会让他们失去信心，而且更严重的是会导致他们遮遮掩掩，我从来不怕实验做不出来结果，就怕查不出失败的原因。我喜欢western