基因定点突变全攻略

1、基因定点突变全攻略一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。二、定点突变的原理定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能快速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因争辩工作中一种格外有用的手段。 体外定点突变技术是争辩蛋白质结构和功能之间的简单关系的有力工具，也是试验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构打算其功能，二者之间的关系是蛋白质组争辩的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点转变、缺失或者插入，可以转变对应的氨基

2、酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行争辩有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸取区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还消灭了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如争辩蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、争辩蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。

3、 通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为2545 bp，我们建议引物长度为3035 bp。一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。若两边引物太短了，很可能会造成突变试验失败，由于引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。 （2）假如设定的

4、引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78（GC含量应大于40%）。 （3）假如Tm值低于78，则适当转变引物的长度以使其Tm值达到78（GC含量应大于40%）。 （4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中心位置。 （5）最好使用经过纯化的引物。       Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)675/L+81.5 注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。四、引物设计实例以GCGACG为例：5-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3（1）首先设

5、计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中心位置。Primer #1: 5-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3 Primer #2: 5-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通过计算可以看出其Tm低于78，这样的引物是不合适的，所以必需调整引物长度。（3）重新调整引物长度。Primer #1: 5-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3 P

6、rimer #2: 5-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3在引物两端加5mer（斜体下划线处），这样引物的GC含量为45.7%，L值为35，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm为80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），这样的引物就可以用于突变试验了。五、突变所用聚合酶及Buffer引物和质粒都预备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平常的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延长长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增

7、，防止引进新的突变。除了使用基因定点突变试剂盒，如Stratagene和塞百盛的试剂盒，但价格昂贵。可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTM HS DNA polymerase。六、如何去掉PCR产物最简洁的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化爱护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株肯定不能是甲基化缺陷株

8、。DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，由于假如模板处理得不洁净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致试验失败。七、如何拿到质粒直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序，验证突变结果。八、图示九、定点突变操作步骤A 诱导突变基因（PCR反应）以待突变的质粒为模板，用设计的引物及Muta-direct酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变。1. 设计点突变引物。  注参考引物设计指导2. 预备模板质粒DN A注用dam+型菌株（例如DH5菌株）作为宿主菌。在end+型菌株中常有克隆数低的现

9、象，但是对突变效率没有影响。提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。3. 选项对比反应体系（50l反应体系）10×Reaction Buffer5lpUC18 control plasmid（10ng/l，total 20ng）2lControl primer mix（20pmol/l）2ldNTP mixture（each 2.5mM）2ldH2O 38lMuta-direct Enzyme1l4. 样品反应体系（50l反应体系）10×Reaction Buffer5lSample plasmid（10ng/l，total 20ng） 2lSamp

10、le primer (F)（10pmol/l）1lSample primer (R)（10pmol/l）1ldNTP mixture（each 2.5mM）2ldH2O38lMuta-direct Enzyme1l5. PCR反应条件注按如下参数设置PCR扩增条件。CyclesTemperature Reaction Time1cycle95 30sec15cycle9530sec551min721min per plasmid Kb6. PCR扩增反应完成后冰育5分钟，然后置于室温（避开反复冻融）。注 按下列供应的PCR条件进行扩增，把握PCR循环数。留意当突变点位点超过4个时会发生突变率降

11、低的现象。MutationCycles 12Nucleotide15cycles3Nucleotides18cyclesB 突变质粒选择PCR反应结束后使用Mutazyme酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。1. 预备PCR反应产物2. 加入1l（10U/l）Mutazyme酶37温育1小时。注当质粒DNA用量过多时Mutazyme酶可能发生与样品反应不完全的现象。因此我们建议为了保证突变率请严格遵照试验步骤进行操作。假如突变率低，可以适当延长反应时间或增加Mutazyme酶用量。C转化反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口，当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌株，例如DH

12、5。1. 将10l样品加到50l感受态细胞里，然后放置在冰上30分钟。 2. 接下来可以参照一般的转化步骤进行。序列分析通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变。 为了证明这一结果，我们建议对白色单菌落进行测序分析。先讲最简洁的一个点的定点突变技术，其它较长片段的突变，删除，插入技术以后会渐渐奉上：在做试验之前，我们首先要搞清楚试验的目的和试验的原理。 试验的目的应当比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般状况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：第一：我们吊出来的基因有点突变，信任这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不简洁吊出来，并装进了自己的载体，却发觉有一两个

13、碱基跟自己的预期序列或全部的公共数据库不匹配，然后暴昏。 大家试验室里面还是用Taq酶为主吧，Pfu这样的高保真酶大家应当用得不多吧，Taq酶的优点和缺点都很明显：优点就是扩增效能强，缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉假如是2000bp的基因，假如扩四五十个循环的话，很大机率会消灭点突变，当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系，具体状况这里就不争辩了。其次：要争辩基因的功能，在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的试验需要，信任这也是那些争辩基因的人经常的一种思路吧。 对

14、于第一种状况：我们首先要分析消灭碱基不匹配的位置是不是重要的位置，假如不是很重要，大可不必管它，比如说是三联密码子的最终一位，碱基的转变并没有引起相应氨基酸的转变，那么一般状况下也可以不去理它。另外，在NCBI上人类的基因的版本始终在变化，也就是说同一个基因有不同的版本，或者称不同的亚型，其碱基序列有些许的差异，只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。假如有时间没钱，那干脆重新PCR然后再克隆进自己的载体了，不过最好换个保真性好一点的酶如PFU，或者PCR循环数低一点，不过这些东西有时候也得靠运气啦。实在不行的话再来做定点突变。对于其次种状况：这种状况下一般也就

15、只能做定点突变了。 接下来开头聊一聊定点突变的原理吧，那个Stratagene试剂盒！上面有一个说明书，说得好像很正规，不过上面好多都是什么专利啊什么留意之类的话，看都不看，我们简明扼要地只讲试验方面，通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。大家马上就会想到几个问题了：第一：引物怎么设计呢？其次：模板怎么去掉呢？第三：怎么拿到质粒呢？对于第一个问题：怎么设计引物？我只能讲一些原则，并举一些例子。引物设计的原则其它贴子上都有讲，这里就不重复了：不过这种突变引物要加上一个

16、原则： 一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12base pair。 若两边引物太短了，很可能会造成突变试验失败，大家应当都知道，引物至少要11-12个base pair才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个base pair，并且合成多一条反向互补的引物。这么说大家可能不是很清楚，那我就举个例子吧：X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960现有序列 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGA

17、ATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924* *|-deletion X71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020现有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984（上面为目的序列，下面为现有序列：我们发觉有一个A碱基的缺失，其直接结果是在表达蛋白时后面的氨基酸全部错配） 我们以它为中心设计引物：两边各至少12个碱基，左边由于含有较多的A造成引物GC%含量过低，故拉长引物使GC%含量

18、不至过低，也使引物退火温度上升。故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG并合成反向互补引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG 其实也不肯定要反向互补序列，只要反向引物也是两边都有大于12个碱基，同时符合引物设计的原则就行了。 引物合成公司有很多家，大家可以去查找，不同厂家的引物在价钱质量上有一些差别，不过价钱一般都是一块多一个碱基，合成时间约为一周。 这样的结果是PCR时把整个质粒都给扩出来了，得到的PCR产物是一条链完整，另一链有缺刻的PCR产物对于其次个问题： 怎么去掉模板呢？再简洁的方法就是用Dp

19、nI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化爱护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株肯定不能是甲基化缺陷株，不会那么凑巧吧，哈哈。关于第三个问题： 直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，呵呵，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序（这个就不用我多说了吧），验证突变结果，一般都没问题的啦，我做了几十个突变了，到目前为止还没有做不出来的，呵呵，不要砸我啊。下面讲

20、一下具体的试验步骤以及一些试验中要留意的事情：1、 依据现有基因设计引物；2、 合成引物并预备好模板；3、 PCR，4、 DpnI处理酶切产物；5、 转化酶切产物；6、 筛选 阳性克隆；7、 送测序并测全长。最终就是庆祝啦，呵呵，没什么简单的。 引物和质粒都预备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平常的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延长长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。那种Quick change试剂盒分为几种不同的类型 什么QuikChange® Sit

21、e-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒 、QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（>8kb）从原理上是一样的，只是PCR的酶和BUFFER不一样，后面用了比较适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了，没什么特殊的东西。另外，DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，由于假如模板处理得不洁净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致试验失败。试验板长出来的菌有两种可能 一种是质粒DPNI没处理洁净长出来的（模板），一种是PCR产物转化出来的 （突变体

22、）不过这两种菌长得一模一样_，即使提出质粒来也是一样（酶切和PCR都无法区分），除了测序，是分不出来的， 做PCR时也最好做一个负对比（不加引物），试验管由于PCR时有引物，所以在DNPI处理前里面既含有模板又含有PCR产物，而对比管由于PCR时没放引物，所以在DPNI处理前里面只有模板。 假如两者都拿去DNPI处理 就能够证明模板已经被去除洁净。若试验顺当的话应当是：正对比长菌负对比不长菌。假如消灭正负对比都长菌，那么就是DpnI没处理好，假如正负对比都不长菌，那么有两种可能，一种是PCR阴性，也就是说PCR出问题了，另外一个可能就是转化出问题了。要搞清楚是哪个问题，跑胶说明不了问题，那就做

23、个转化的对比，拿试剂盒的对比试验去试感受态，马上就能知道转化有没问题。假如正对比很多菌，负对比有几个菌，那么就是DPNI处理得不洁净，这个时候就得靠运气了_大家有什么问题我们可以连续争辩。另外，假如大家既没有DpnI酶也没有好的PCR酶和BUFFER的话，那也有其它方法进行定点突变，只是麻烦一点，假如大家有需要的话，我会把方法贴上来。对于多点突变技术及较长片段的缺失插入技术，同样的，假如大家有需要的话，我会把方法贴上来。 不过，假如你有钱的话，那就去买那个试剂盒吧，其中QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒 、QuikCha

24、nge® XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（>8kb）的原理我上面已经说了，只是补充了一些我认为的留意事项。假如你更有钱的话，那么你可以叫其它公司帮你做定点突变服务，大约是改一个点1000元左右。假如有需要我可以供应公司的联系方式。 下面我以一个例子为例来讲100个bp以下的碱基插入缺失或者转变试验方案。其实这种方案并不是那么好的，只不过考虑到大家一般都没有TYPEII限制性内切酶或者UDG and NTHIII（另外两种方法），所以才打算先介绍这种方法。 首先先说明一点，这种 方法在原理上存在肯定成功机率，也就是说有运气成分

25、。而定点突变则一般都是百分之百成功的，而这种100bp以下的插入缺失或者碱基转变可能要测几个克隆才能挑到一个好的克隆，大家假如要用请慎重考虑。 同样的，我只变那几十个碱基，并没有转变载体及其它地方，所以我还是依靠于DPNI酶。举例：Homo sapiens FzE3 是一个人类基因，其含有32个氨基酸的信号肽MRDPGAAAPLSSLGLCALVLALLGALSAGAGA，后面是成熟肽QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKF

26、GFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGPGGGPTAYPTAPYLPDLPFTALPPGASDGRGRPAFPFSCPRQLKVPPYLGYRFLGERDCGAPCEPGRANGLMYFKEEERRFARLWVGVWSVLCCASTLFTVLTYLVDMRRFSYPERPIIFLSGCYFMVAVAHVAGFLLEDRAVCVERFSDDGYRTVAQGTKKEGCTILFMVLYFFGMASSIWWVILSLTWFLAAGMKWGHEAIEANSQYFHLAAWAVPAVKTITILAMGQVDGDLLSGVCYVGLSSVDALRGFVLAPLFVYLFIGTS

27、FLLAGFVSLFRIRTIMKHDGTKTEKLEKLMVRIGVFSVLYTVPATIVLACYFYEQAFREHWERTWLLQTCKSYAVPCPPGHFPPMSPDFTVFMIKYLMTMIVGITTGFWIWSGKTLQSWRRFYHRLSHSSKGETAV，想在信号肽和成熟肽之间插入一个FLAG标签并在标签前面加上一个Leucine。即在信号肽和成熟肽之间插入一段序列：TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG（一共三十个bp）、试验设计：信号肽：ATGCGGGACCCCGGCGCGGCCGTTCCGCTTTCGTCCCTGGGCTTCTGTGCCCTGGTG

28、CTGGCGCTGCTGGGCGCACTGTCCGCGGGCGCCGGGGCG成熟肽：CAGCCGTACCACGGAGAGAAGGGCATCTCCGTGCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGTTCTCCCGAACTCCGCTTTTTCTTATGCTCCATGTATGCGCCCGTGTGCACCGTGCTCGATCAGGCCATCCC

29、GCCGTGTCGTTCTCTGTGCGAGCGCGCCCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGAACTTCCCGGTGCACGGTGCGGGCGAGATCTGCGTGGGCCAGAACACGTCGGACGGCTCCGGGGGCCCAGGCGGCGGGCCCACTGCCTACCCTACCGCGCCCTACCTGCCGGACCTGCCCTTCACCGCGCTGCCCCCGGGGGCCTCAGATGGCAAGGGGCGTCCCGCCTTCCCCTTCTCATGCCCCCGTCAGCTCAAGGTGCCCCC

30、GTACCTGGGCTACCGCTTCCTGGGTGAGCGCGATTGTGGCGCCCCGTGCGAACCGGGCCGTGCCAACGGCCTGATGTACTTTAAGGAGGAGGAGAGGCGCTTCGCCCGCCTCTGGGTGGGCGTGTGGTCCGTGCTGTGCTGCGCCTCGACGCTCTTTACCGTTCTCACGTACCTGGTGGACATGCGGCGCTTCAGCTACCCAGAGCGGCCCATCATCTTCCTGTCGGGCTGCTACTTCATGGTGGCCGTGGCGCACGTGGCCGGCTTCTTTCTAGAGGACCGCGCCGTGTGCGTGGAGCG

31、CTTCTCGGACGATGGCTACCGCACGGTGGCGCAGGGCACCAAGAAAGAGGGCTGCACCATCCTCTTCATGGTGCTCTACTTCTTCGGCATGGCCAGCTCCATCTGGTGGGTCATTCTGTCTCTCACTTGGTTCCTGGCGGCCGGCATGAAATGGGGCCACGAAGCCATCGAGGCCAACTCGCAGTACTTCCACCTGGCCGCGTGGGCCGTGCCCGCCGTCAAGACCATCACTATCCTGGCCATGGGCCAGGTAGACGGGGACCTGCTGAACGGGGTGTGCTACGTTGGCTTCTCCAGTGT

32、GGACGCGCTGCGGGGCTTCGTGCTGGCGCCTCTGTTCGTCTACTTCTTCATAGGCACGTCCTTCTTGCTGGCCGGCTTCGTGTCCTTCTTCCGTATCCGCACCATCATGAAACACGACGGCACCAAGACCGAGAAGCTGGAGAAGCTCATGGTGCGCATCGGCGTCTTCAGCGTGCTCTACACAGTGCCCGCCACCATCGTCCTGGCCTGCTACTTCTACGAGCAGGCCTTCCGCGAGCACTGGGAGCGCACCTGGCTCCTGCAGACGTGCAAGAGCTATGCCGTGCCCTGCCCGCCCGG

33、CCACTTCCCGCCCATGAGCCCCGACTTCACCGTCTTCATGATCAAGTGCCTGATGACCATGATCGTCGGCATCACCACTGGCTTCTGGATCTGGTCGGGCAAGACCCTGCAGTCGTGGCGCCGCTTCTACCACAGACTTAGCCACAGCAGCAAGGGAGAGACCGCGGTATGA插入序列TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG 通过引物3端大于或等于18个碱基的匹配使引物与模板质粒搭配，再通过引物5端的序列来补上那三十个碱基，先用PNK酶把引物磷酸化，再用下面这两条引物把整个质粒给扩增出来，上游和下游引物就刚好

34、把那三十个碱基给补上了，再参照引物的设计原则做一些润色，细心的伴侣可以具体分析一下这两条引物。扩出来后再用DPNI酶把模板质粒去掉，再用连接酶把PCR产物的两端连接起来（虽然是平端连接 ，可是由于是同一条PCR产物的两端连接，效率会很高），转化后，测序验证，OK。设计引物forward primer:GGACTACAAAGACGATGACGACAAGCAGCCGTACCACGGAGAGAAG88.5reserve primer: ATTAACGCCCCGGCGCCCGCGGACAGT86.9 但是由于引物的合成是由3端向5端合成，而且每合成多一个碱基的效率最多也是百分之九十九点几而不是百分之一

35、百，所以我们拿到手的引物其实是一个混合物，比如说我们合成一条长二十个碱基的引物，实际上拿到手的是一个混合物，里面即含有二十个碱基的引物，也含 有肯定比率的十九个、十八个、十七个碱基的引物。所以我们用这种方法做PCR时，假如连上的是足额长度的引物，那么试验也就成功了，假如连上的是少一两个碱基的引物，那么试验就失败了，不过引物当中主要的仍是足额长度的引物，所以成功机率还是蛮高的。不过送测序时就要做好预备，可能要测三五个才能拿到一个好的。 假如觉得这样不好的话，我稍后会附上用TYPEII酶或者UDG，NTHIII做的方法，它们是通过互补粘端来连接，就不存在这个问题。下面附上具体试验过程：第一步：设计

36、引物；其实只要符合一般引物设计原理就行了，顺便说一下，引物一般的话，越长其质量就其次步：引物PNK处理，一般合成的引物其三端是没有磷酸化的，所以我们要自己进行磷酸化，一般可以让其磷酸化过夜，不磷酸化的话最终一步连接就连不上哦。第三步：PCR，跟基因定点突变一样，要用好的扩增酶和BUFFER，由于要把整个环高保真的圹增出来嘛；第四步：DPNI处理，跟基因定点突变一样，要把模板去除洁净。第五步：连接，加上连接BUFFER和连接酶连接，第六步：转化。定点诱变(DpnI法)1、引物设计：每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长2545bp,设计的突变位点需位于引物中部。2、反应：使用高保真的pyr

37、obest DNA聚合酶 ;循环次数少，一般为12个循环。反应体系：10x pyrobest Buffer                         5 uldNTP Mixture(10mM)             &#

38、160;         1ul                   模板DNA(550ng)                    

39、60;    1ulprimer 1 (125ng)                            1ulprimer 2 (125ng)                            1ulpyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5U/ul)    0.25ul加无菌蒸馏水至