副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验研究.docx

1、第21卷第4期天津农学院学报VbL21,No.42014年12月JournalofTianjinAgriculturalUniversityDecember.2014文章编号：1008-5394（2014）04-0009-04副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验研究谷禹巳张东超：弓建芳徐继鹏'，金天明李留安二高丰（1.吉林大学畜牧兽医学院，长春130062；2.北辰区养殖业发展服务中心，天津300400；3.天津农学院动物科学与医学学院，天津300384：4.武清区养殖业发展服务中心，天津301800）摘要：副猪嗜血杆菌病是一种猪的传染病，主要引起断奶仔猪和保育猪发病。试验对天津某规模化猪

2、场疑似副猪嗜血杆菌病猪采集病变明显的组织进行细菌分离培养、显微镜镜检、生化试验等实验室诊断，结合病猪的临床症状和病理变化特点，判定该细菌分离株为副猪嗜血杆菌。药敏试验结果显示，该株副猪嗜血杆菌对头抱嗓映、阿米卡星等药物高度敏感，关键词：副猪嗜血杆菌；分离鉴定；药敏试验中图分类号：S852.613文献标识码：AStudyonIsolationandIdentificationofHaemophilusparasuisStrainandItsSensitivityTeststoDrugGUYu”,ZHANGDong-chao3,GONGJian-fang3,XUJi-peng4,JINTian-m

3、ing3,LILiu-an3,GAOFeng'(1.CollegeofAnimalHusbandryandVeterinaryScience,JilinUniversity,Changchun130062,China;2.BreedingIndustryDevelopmentServiceCenterofBeichenDistrict,Tianjin300400,China;3.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin300384,China;4.BreedingI

4、ndustryDevelopmentServiceCenterofWuqingDistrict,Tianjin301800,China)Abstract:Haemophilusparasuisdiseaseisakindofporcineinfectiousdiseasewhichmainlyinfectsweanedpigletsandnursingpigs.Inthispaper,theobviouslesionsampleswerecollectedfrompigswithsuspecteddiseaseofHaemophilusparasuis,whichcamefromalarge-

5、scalepigfarminTianjin.Thenaseriesoflaboratorydiagnoseswerecarriedout,suchasbacterialisolationandcultxire,microscopicexaminationandbiochemicaltests.Combinedwiththeclinicalsymptomsandpathologicalchangescharacteristicsofswine,itisdeterminedtheisolatedbacteriaisHaemophilusparasuis.Drugsensitivetestresul

6、tsshowthattheisolatedHaemophilusparasuisstrainishighlysensitivetoceftiofurandamikacin.Keywords:Haemophilusparasuis;isolationandidentification;drugsensitivetest副猪嗜血杆菌病（Haemophilusparasuisdisease,Hps）是由副猪嗜血杆菌引起的猪的一种传染病，该病主要发生在断奶仔猪和保育猪，发病率为10%15%,严重时死亡率高达50%气临床上，该病以咳嗽、发热、呼吸困难、颈部皮肤发紫、被毛粗糙、食欲不振、跛行等为主要症状，

7、病理变化特征为多发性纤维素性浆膜炎、关节炎，有时伴发脑膜炎。2013年10月，天津某规模猪场出现2馀头40日龄左右的病猪，根据患病猪流行病学调查结果、临床症状和病理变化，初步怀疑为副猪嗜血杆菌病。通过采集病猪典型病变组织病料进行细菌分离培养、显微镜镜检、“卫星现象”及生化鉴定等实验室诊断，最终判定分离到的细菌为副猪嗜血杆菌，即确诊该猪病为副猪嗜血杆菌病。对细菌分离株进行药敏试验的结果显示，该副猪嗜血杆菌对头抱嚏味、阿米卡星等药物高度敏感。本研究对猪场控制该病的进一步发展和治疗具有一定的指导意义。1临床症状和剖检变化1.1临床症状发病猪只最初体温升高、精神沉郁、反应迟钝、行动迟缓、食欲下降、机体

8、消瘦；随后，病收稿日期：2014-09-28基金项目：天津市高校“学科领军人才培养计划”资助项目“天津市兽医学贡点学科建设”（无编号）：天津市高等学校科技发展基金项目“APP菌影裁体猪巴氏杆菌基因疫苗的研究”（20060720）；天津市农业科技示范推广项目“养猪业细凿性传染病的监测及防控技术推广"（201202110）：天津市高校创新团队建设项目“兽医生物技术团队建设”（TD12-5019）作者简介：谷禹（1983-），男，天津市人，助理兽医那，学士，主要从事临床兽医诊断工作.E-mail：gu83yu83。通信作者：高丰（1961-）,男，吉林大安人，教授，博上，主要从事兽医病理学

9、的教学和科研工作.E-mail：gf86661.情加而，表现为呼吸困难、皮肤发紫、被毛粗糙混乱、关节肿胀、疼痛、跛行、共济失调，严重者难以站立（图1）;濒死时侧卧.四肢做划水样（图2）,最终死亡。图I病猪关节肿胀、跋行、共济失调，不能站立图2濒死时侧卧.四肢做划水样1.2剖检变化剖检可见胸膜炎、关节炎、心包炎、腹膜炎,有些可见脑膜炎、心包积液、心外膜表面有纤维素性渗出物附着、心包膜增厚（图3）;肺脏表面有纤维素性渗出物附着，有些病猪肺脏病变，支气管内有脓性泡沫样黏液；关节囊内有黄色积液;颌下淋巴结、肠系膜淋巴结及腹股沟淋巴结肿大、出血呈暗红色（图4）;腹腔有干酪样渗出物等。图3心包积液、心外膜

10、有纤维素性渗出物附着、心包膜增厚图4肠系膜淋巴结肿大、出血呈暗红色2实验室诊断2.1材料2.1.1病料来源2013年10月，根据临床症状和病理剖检变化,对天津某规模猪场40日龄左右的疑似患副猪嗜血杆菌病的病猪无菌采集病变严亟的肺脏、心脏、肝脏、脾脏、淋巴结、心包积液、胸腔积液、腹腔积液及关节积液等，采集后6h内分离细菌。2.1.2标准萌株金黄色前葡球菌由天津农学院动物科学与医学学院预防兽医学实验室保存。2.1.3主要试剂与培养基微ht生化管购自杭州天和微生物试剂有限公词；革:兰氏染液购自南京建成科技有限公司；NAD（烟酰胺腺瞟吟二核脊酸，辅滴I）购自上海前尘生物有限公司。改Q的TSA固体培养基

11、（添加NAD和血清）、TSB液体培养基（添加NAD和血清）、鲜血琼脂培养基、LB培养基为本实验室自配。2.2方法2.2.1细菌的分离纯化无菌采取病变明显的病料或积液接种于改良的TSA培养基上，在5%的CQ2培芥箱中于37丁下培养24h,观察并记录细菌菌落的形态特征，然后挑选单个菌落分别划线接种于改良的LB固体培养基和TSA培养基上。同样，在5%的CG培养箱中于37T培养24h,观察并记录培养基上细菌菌落的生长情况。2.2.2细菌的扩大培养挑取改良TSA上的单个幽落，接种于改良TSB液体培养基中，放在37勾摇床上培养24h,观察菌液的混浊度，然后4T保存，备用。2.2.3曲体的显微镜观察用移液枪

12、无留操作移取20pL摇匀的菌液于干净的载玻片上，摊匀，自然晾干后.进行革兰氏染色，在油镜下观察并记录细萌的偏体形态特征。2.2.4“卫星现象”取液体培养基中的液体划线接种到鲜血培养基E（取菌液前先将菌液摇匀），在培养基上垂直于接种细倒水平划线接种金黄色葡荷球留，在1824h,观察是否有“卫星现象”，是否溶血。2.2.5生化试验选取葡匐糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖酸盐、脉酶、氧化酶、接触酶等生化管。打开生化管后，用微址进样器每管分别无菌加入1jiL胎牛血清和1pLNAD,并温和吹打混匀（混匀过程中不要产生气泡）o倒置生化管放置于C（）2培养箱中于37T恒温培养36h,观察并记录

13、每个生化管中的现象。2.2.6药敏试验用生理盐水将液体培养的菌液浓度调至0.5麦氏单位,含菌量在1x10“2x10”CFU/Lo取灭菌的棉签拭子浸入纯化好的萌悬液中，在管壁上将多余的茜液挤出，然后涂布在90mm的改良TSA固体培养基上，旋转平皿60。，重复涂3次。室温静置35min后，再将药敏片放在固体培养基上，每个培养基上均匀地放6个药敏片。之后，放在5%的CO?恒温培养箱中于37弋培芥48h,然后测址抑菌圈的直径，并根据判断标准5判定该细菌对各种抗生素的敏感性。2.3结果与分析2.3.1HPs菌落特征和细菌的形态LB培养基上未发现有菌落生长。而在改良TSA平板上生长良好，可看到湿润、隆起，

14、呈灰白色、半透明、边缘整齐、大小不一的菌落（图5）。油镜下，细菌呈球杆状或短杆状，也有细长杆状,单个或短链排列，无芽抱，为革兰氏阴性菌（图6）。图5在TSA培养基上的菌落形态图6油镜下HPs的革兰氏染色形态2.3.2“卫星现象”和生化试验结果在37Y培芥基上培养24h后，可见在副猪嗜血杆前和金黄色前匐球菌划线交又处细菌菌落生长较好，离葡萄球南.划线越远，副猪嗜血杆菌的生长越差，旦无溶血现象，符合副猪嗜血杆菌的培养特性气将分离的细菌接种到生化管，37T培养36h,发现氧化前、脉酶、接触解试验为阳性，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖均可发酵.不发酵乳糖、山梨醇、菊萄糖酸盐、甘露醇（表1）,符合副猪嗜血杆菌的生

15、化鉴定特点。表1HPs的生化试验结果注：为阳性.为阴性生化鉴定项目结果生化鉴定项目结果氧化酶匍御糖酸盐一接触酶+乳糖什露醇山梨铮麦芽糖2.3.3约敏试验结果药敏试验结果显示，头抱嚏映、阿米卡星、氨苯西林、头抱曲松为高度敏感药物；庆大霉素、磺胺嗟嚏、四环素、环丙沙星为中度敏感药物；阿莫西林、新霉素为不敏感药物；而对卡那霉素、青霉素已产生耐药性（表2）。表2副猪唯血杆菌的药敏试验结果注：抑菌圈直径dvl5mm为不敏感；15mmWdW药敏片抑菌圈直径d/mm药敏片抑菌圈直径d/mm头抱哩吠28四环素16阿米卡星26环丙沙星16氨苇西林24阿莫西林13头弛曲松23新密素11庆大霉素19卡那霉素0磺胺嗜

16、嚏17青很素020mm为中度敏感；20mm为高度敏感3结论与讨论根据发病猪只的流行病学、临床症状和剖检变化，初步怀疑该病是由副猪嗜血杆菌引起的。通过对采集病料进行细菌分离培养、显微镜镜检、生化试验、“卫星现象”等检测，结果和副猪嗜血杆菌的生理生化特性相符，最终判定分离到的细菌为副猪嗜血杆菌，即确诊该病为副猪嗜血杆菌病。副猪嗜血杆菌是条件致病菌，在外界环境骤变、长途运输、断奶等应激条件下，猪机体抵抗力下降，副猪嗜血杆菌趁虚而入，侵染猪只并发病向。一般在春秋季节该病发病率较高，发病猪群主要集中在58周龄气随着猪场的集约化和规模化，副猪嗜血杆菌病逐渐成为猪场的主要细菌性疾病之一，对猪的健康生长和生产

17、造成了严重危害，给养殖业带来了极大的经济损失'T。鉴于副猪嗜血杆菌病常伴发其他疾病，且副猪嗜血杆菌对营养条件要求极高因此，对于细菌的分离与培养条件的要求也相当高，这给疾病的确诊带来了很大困难。猪场可用疫苗预防该病的发生，一旦发生该病，不要盲目用药，先进行药敏试验，根据药敏试验结果进行用药，以免产生耐药性菌株。本试验药敏试验结果显示，该分离株副猪嗜血杆菌对头弛嚏吠和阿米卡星等药物高度敏感，可根据药敏试验结果对猪场发病猪进行用药治疗。参考文献：1 薛国聪，任涛.副猪嗜血杆菌病流行病学及致病因子的研究J.中国畜牧兽医，2009,36(5)：168-171.2 中华人民共和国国家质量检验检疫总

18、局，中国国家标准化管理委员会.W&T125-1999纸片发抗菌药物敏感试验标准S.北京：中国标准出版社，1999.3 蔡宝祥.家畜传染病学M.4版.北京：中国农业出版社，2001：264-265.4 粟硕，付新亮，张桂红.副猪嗜血杆菌的诊断与防治策略J.疾病防控,2014,23(2)：46-48.5 OlveraA,SegalsJ,AragnV.UpdateonthediagnosisofHaemophilusparasuisinfectioninpigsandnovelgenotypingmethodsJ.VetJ,2007,174(3)：522-529.6 叶飞，何云霞，徐慧，等.副猪嗜血杆菌病的研究进展J.动物医