动物疱疹病毒基因工程疫苗的研究进展.docx

1、动物疱疹病毒基因工程疫苗的研究进展蔡铭升程安春微，汪铭书*（1.四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心，四川雅安625014；2.动物疾病与人类健康四川省重点实验室，四川雅安625014）中图分类号:S852.5文献标识码:A文章编号：1004-7034（2009）01-0017-03关键词：动物疱疥病毒；基因工程疫苗；基因缺失疫苗；基因重组活截体疫苗摘要:疱疥病毒是一类具有相同形态和较大囊膜的双链DNA病毒，它不仅能引起原发，性感染，还能引起潜伏性感染和复发性感染。此外，某些疱疹病毒是哺乳动物和禽类等动物肿瘤的病原因子，因此防制此病毒病不容忽视。疫苗的免疫接种是预防、控制该病毒病的主要手段&

2、#176;文章在简单介绍动物疱疥病毒常规疫苗的基础上对动物疤疹病毒基因工程疫苗进行了综述，并对动物疱疹病毒基因工程疫苗今后的发展方向进行了总结，以期为动物疱疹病毒基因工程疫苗的深入研究提供借鉴。目前,主要采用疫苗免疫接种并配合其他综合性防制措施对动物疱疹病毒的感染进行预防和控制，故许多国家在发展和改进现有常规疫苗的同时,纷纷利用生物技术研制和开发安全有效的新型基因工程疫苗。文章在简单介绍动物疱疹病毒常规疫苗的基础上对动物疱疹病毒基因工程疫苗，包括重组亚单位疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗和基因重组活载体疫苗等进行了综述，以期为今后深入开展动物疱疹病毒基因工程疫苗的研究打下良好基础。1动物疱疹病毒的

3、常规疫苗早期的动物疱疹病毒疫苗大多为弱毒苗和灭活苗。弱毒苗和灭活苗在预防和控制动物疱疹病毒病方面虽然能起一定作用,但接种弱毒苗后可在体内保持一种持续感染状态，并且被感染动物不能阻止强毒攻击时病毒在体内的复制；另外，给自然带毒动物进行疫苗接种也不能阻止其排毒,其潜伏性感染可能引起接种动物的免疫抑制进而导致对其他感染的易感性增强或对其他疫苗的反应性降低。而灭活苗虽然安全性较好,但其免疫效率却较低，免疫时用量较大，有时还可能导致注射部位肿胀，出现过敏反应，也不能阻止强毒的攻击,同弱毒苗一样其最大缺点是疫苗株和野毒株之间的交叉反应性,接种后无法鉴别免疫接种动物和野毒感染动物C收稿日期：2008-06-

4、12基金项目：国家自然科学基金项目（30471297）；教育部新世纪优秀人才支持计划项目（NCET-04-0906）；教育部高等学校科技创新工程重大项目培育资金项目（706050）；四川省重点建设学科项目（SZDO418）作者简介:蔡铭升（1983-）,男，硕士研究生.通讯作者:程安春（1965-），男，教授，博士，博士生导师.2动物疱疹病毒的基因工程疫苗2.1重组亚单位疫苗重组亚单位疫苗是利用动物疱疹病毒保护性抗原基因在原核或真核系统中表达所获得的产物制成的疫苗。1987年,Marchioli等利用CHOdhfr细胞表达产物（表达gD）免疫猪，结果能诱导抗体的产生并保护猪抵抗强毒的攻击。但由

5、于这种重组亚单位疫苗生产成本高，价格昂贵,免疫原性较弱，不能在体内复制，故研究者将保护性抗原以多体形式组装到一种用佐剂构建的基质上，并研制出免疫刺激复合物（ISCOM）。与仅能活化B细胞和辅助性T细胞（CD+T细胞）的传统灭活疫苗相比,ISCOM还能活化细胞毒性T细胞（CD3*T细胞）。因此，具有很强的免疫原性，可刺激机体产生强烈而持久的免疫应答。2-2核酸疫苗核酸疫苗的概念是1990年由Woif等提出来的。核酸可利用动物疱疹病毒的裸DNA进行免疫接种，能刺激机体产生细胞免疫和体液免疫,在哺乳动物的疾病模型中研究得较多。到目前为止，已发现接种ONA疫苗对许多病毒、细菌、寄生虫感染及肿瘤预防均有

6、一定效果。Tiseher等将血清I型马立克病病毒（MDV）克隆到细菌人工染色体（BAC20）上免疫鸡，发现DNA疫苗可对鸡产生保护作用,但其免疫保护力不如传统疫苗商。2.3基因缺失疫苗动物疱疹病毒基因缺失疫苗是利用基因工程技术在动物疱疹病毒基因组中插入或缺失一段基因序列致使某些基因不能表达，从而使动物疱疹病毒致弱，同时又保持了较强的免疫原性，其中缺失基因序列的主要是毒力基因胸苜激酶（TK）、蛋白激酶（PK）、核昔酸还原酶（RR）和脱氧尿甘焦磷酸激酶（dUTPase）及一些具有免疫原性的糖蛋白（gG、gE、gC、gD等）。目前,已构建出多种单基因、双基因及多基因缺失疫苗。动物疱疹病毒的TK基因是

7、主要的毒力基因，对其进行缺失即可制成第1代基因缺失疫苗。Kit等通过缺失伪狂犬病毒（PRV）BUK株TK基因序列中的148bp片段构建出PRV的TK基因缺失株PRVBUKdl3株。该TK基因缺失毒株对温度的适应性强，并且对小鼠的总毒力与BUK株相比大大降低。试验结果证实它对猪是安全的,56周龄猪免疫接种后能产生中和抗体，在攻毒后可表现出再次免疫应答。但仅缺失TK基因的弱毒株对犊牛还有较低的毒力，对狗、猫的毒力较强。MillerJM等学者对牛1型疱疹病毒（BHV-DTK基因缺失疫苗进行研究时发现,此疫苗可引发怀孕母牛流产。第2代基因缺失疫苗是在TK基因缺失疫苗的基础上发展起来的，比仅缺失TK基因

8、的疫苗更加优越。它除了在TK基因内缺失一段基因序列外，还在非编码必需糖蛋白的基因内缺失一段新的基因序列或插入一个报告基因,这样得到的突变株就不能产生被缺失的糖蛋卜1,因而免疫动物就不能产生相应的抗体。因此，可以通过血清学方法鉴别免疫接种动物与自然感染野毒动物，这也是第2代基因缺失疫苗最显著的特点。Jons等学者在PRVBUKdl3株的基础上缺失了gC基因序列，构建了PRVTK/C-双基因缺失疫苗株。刘正飞等将LacZ基因表达试剂盒插到PRVEa株基因组的gE区,构建了PRVTK/gEVLacZ*o这些双基因缺失疫苗株经临床验证都能很大程度地降低PRV毒力，而旦由于免疫动物不能产生所缺失基因相应

9、的抗体，因而可用血清学方法鉴别免疫接种动物与野毒感染动物。除以上以TK基因缺失为主的疫苗外,还有以RR、PK、dUTPase等基因缺失为主的疫苗。RR、PK、dUTPase与TK一样，都是疱疹病毒毒力的决定因素，对这些基因进行失活都可降低疱疹病毒的毒力。基因缺失疫苗虽然具有安全性高、效力高、免疫原性好等优点，但该疫苗在引起潜伏性感染或激活为感染性病毒及排毒等方面同样存在着极大的危险性。研究表明,基因缺失疫苗株在三叉神经节町建立潜伏性感染，并且还存在着可与不同基因缺失疫苗或野毒发生基因互补而重组产生强毒株的危险性。虽然基因缺失疫苗株之间可能发生重组，但其重组发生率并不会很高，只要正确使用疫苗，尽

10、量避免同时接种大剂量能互补的病毒等就可降低重组的发生。2.4基因画组活载体疫苗在基因缺失疫苗基础上发展起来的基因重组活载体疫苗是目前国际上新型疫苗研制的另一大趋势，主要包括以痘病毒（FPV）和疱疹病毒为载体的基因重组活载体疫苗。它可以同时启动机体细胞免疫和体液免疫,避免灭活疫苗的缺陷，又无常规疫苗的毒力返祖现象，尤为重要的是可以同时构成多价乃至多联疫苗。2.4.1以FPV为载体的基因重组活载体疫苗FPV是目前分子质量最大的动物病毒,全长约300kb,对外源基因的容纳量很大,并且能够为外源基因的表达提供大量的非必需区，是极具有开发前景的载体系统。1989年,Van等学者对FPV表达的BHV-1g

11、I、glD糖蛋白的合成、细胞定位和免疫原性进行了研究。而陈志琳等学者首次以FPV中国株为载体构建表达MDVgI基因的重组病毒，为研制gl-FPV疫苗奠定了基础，也为进一步研制抗MDV多价组合基因工程疫苗提供了有效组分。2.4.2以疱疹病毒为载体的基因重组活载体疫苗自Shin和Roime分别报道可以将I型单体疱疹病毒（HSV-1）作为表达外源基因的载体后，疱疹病毒作为基因工程载体得到了深入研究和广泛应用。目前,研究得较多的疫苗是以火鸡疱疹病毒（HVT）、PRV和BHV-1为载体的基因重组活载体疫苗。HVT基因组较大，可容纳25kb的外源基因，用其重组病毒表达抗原的优点是二者有交叉抗原反应，从而可

12、以用大房的HVT蛋白来诱导免疫反应。MorganRW等学者将鸡新城疫病毒（NDV）F基因和HN基因分别插到HVT非必需基因US10上，构建了NDVF-HVT和NDVHN-HVT两种重组体。结果发现，用NDVF-HVT取组体接种鸡可同时抵抗NDV和HVT的双重攻击。由此可见，以HVT为载体构建多联苗是可行的，这关键在于鉴定出HVT基因的适宜位点，而后插入不削弱鸡体中病毒复制的外源基因,从而产生理想的表达。自1987年以来，国外某些实验室先后利用PRV基因缺失株作为载体成功构建了多种重组疫苗，迄今为止以PRV为载体的重组PRV疫苗已经得到了广泛应用。XuGY等对表达乙型脑炎病毒NS1基因的重组PR

13、V株TK7gG7NSl进行研究。研究发现：该重组病毒能表达具有生物活性的NS1蛋白，它可作为猪乙型脑炎和伪狂犬病双价基因工程疫苗用毒株,为我国控制和消灭严重危害养猪业的伪狂犬病和人畜共患传染病乙型脑炎奠定了基础。尽管重组BHV-1的研究只是近些年的事，但也取得了可喜的进展。KitM等分别用TK基因和gC基因缺失的BHV-1减毒株作为载体，成功地表达了门蹄疫病毒（FMDV）的衣壳蛋白VP1基因。Kuhnle等学者也获得了表达牛呼吸道综合征病毒（BRSV）G蛋白的BHV-1重组病毒,该病毒能够诱发呼吸道分泌液中BRSV特异性抗体的产生，由此极大地促进了BHV-1活病毒和灭活病毒载体疫苗的研制与开发

14、。3小结新城疫病毒反向遗传载体的构建及其外源基表达的研究进展曹军平，胡顺林(扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室，江苏扬州225009)中图分类号：S852.659.5.文献标识码:A文章编号：1004-7034(2009)01-0019-02关键词：新城疫病毒;反向遗传；载体；外源基因；表达摘要：新城疫(newcastledisease,ND)是由NDV引起的多种禽类发生高度死亡的一种重要传染病。文章对NDV反向遗传载体的构建及其表达外源基因的研究进展进行了综述，并展示了其广阔的应用前景。反向遗传操作技术(reversegeneticsmanipulationtechnique)是指在体

15、外通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，将病毒基因组RNA逆转录成cDNA,在DNA分子水平上对其进行各种体外人工操作，由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白来组装新的RNA病毒的一项研究技术，也叫全长感染性cDNA克隆技术，又常被称为“病毒拯救”。新城疫(newcastledisease,ND)是由NDV引起的多种禽类发生高度死亡的一种重要传染病。NDV的反向遗传学研究开展得比较迟，它是在参照其他单股不分节段的负链RNA病毒(NNSV)的反向遗传学操作技术的基础上建立起来的，前已有LaSota、Clone30、BeaudetteC、HitchnerBl、Herts33、鹅源NDV强毒ZJI株6个病

16、毒被成功拯救。文章对NDV反向遗传载体的构建及其表达外源基因的研究进展进行了综述。1新城疫病毒反向遗传载体的构建1999年，Peetere和Romer0等学者几乎同时首次报道了NDV的成功拯救。总的来说，建立NDV反收稿日期:2008-04-09；修回日期：2008-06-03基金项目：国家自然科学基金项目(30630048)作者简介:曹军平(1970-),男，副教授,博士研究生.基因工程疫苗的研制是建立在对病毒基因组结构和功能详细了解之上的。在对家畜和陆禽疱疹病毒的研究当中，由于对其基因组结构和功能了解得比较深入，因此比较成功地构建出多种基因工程疫苗,并对家畜和陆禽疱疹病毒性疾病进行预防与控

17、制。在对水禽疱疹病毒的研究当中，由于目前还处于起步阶段，对病毒基因组的结构和功能知之甚少,但从其向遗传操作技术体系主要包括基因组全长片段cDNA的克隆,NP、P和L3个表达质粒的构建及共转染拯救病毒粒子和新生病毒有关特性的鉴定等内容。2以新城疫病毒为载体表达外源基因负链RNA病毒与其同源的RNA病毒不发生重组现象，使这些载体更稳定和安全；同时在大多数情况下，这些病毒不会因大量表达外源基因而引起自身复制的严重减弱;另外，许多负链RNA病毒的致弱疫苗对人和动物无致病性,可作为一种安全载体C2001年,NakayaT等报道了将流感病毒的HA基因插到NDVHitchnerBl株基因组的P基因和M基因之间,获得了含有流感病毒HA基因的重组新城疫病毒rNDV/Bl-HAO2004年,HuangZH等报道了把鸡传染性法氏囊病毒的VP2基因插到NDV基因组的3'端,获得了rLaSota/VP2,用其免疫SPF鸡可以对NDV和IBDV产生90%的保护，加强免疫则可产生完全保护。2005年,BukreyevA等将人D1型副流感病毒HN基因插到NDV基因组的P基因与M基因之间，用该重组病毒免疫试验动物可产生针对副流感病毒HN蛋白的较高抗体水平，取得了较为理想的免疫效果。2006年，ManSP等以NDVB1株为载体插到H7亚型禽流感病毒的HA