口蹄疫基因工程疫苗研究进展.docx

1、口蹄疫基因工程疫苗研究进展杨生海殷宏张杰'*，刘永生I,陈豪泰I,马丽娜I,马艳平)丁耀忠'(1.中国农业科学院兰州停医研究所家布疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室，注席兰州730046；2.中农威特生物科技股份有限公司，甘肃兰州730046)摘要:介绍了口蹄疫在世界范困内暴发流行的现状及其疫苗的研究应用，重点综述了各种口蹄疫基因工程疫苗的研完0-0关键词：口降疫;晟因工程疫苗；分子生物学;进展中图分类号:S855.3文献标识码:A文章编号：1001-8581(2009)04-0104-05ResearchProgressinGeneticEnginee

2、ringVaccineofFoot-and一mouthDiseaseYANGSheng-hai",yiNHong*,ZHANGJie*,UUYong-sheng',CHENHao-tai*,MALi-na*,MAYan-ping1,DINGYao-zhong'(1.KeyLaboratoryofAnimalVirology,MinistryofAgriculture;StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAg

3、riculturalSciences,Lanzhou730046,China；2.ChinaAgriculturalVeterinarianBiologicalScienceandTechnologyCo.Ltd.,Lanzhou730046,China)Abstract：Thepaperintroducedthecurrentstatusofoutbreakoffoot-and-mouthdiseaseandtheresearchandapplicati(mofthevaccineofthisdiseaseintheworld,andemphaticallysummarizedtherese

4、archprogressesinvariousgeneticengineeringvaccinesoffoot-and-mouthdisease.Keywords:Foot-and-mouthdisease;Geneticengineeringvaccine;Molecularbiology；Progress收稿日期：2009-01-18基金项目：甘诺省科技重大专项计划项目(0801NKDA034)。作者简介:杨生海(1978-).男.甘甫庆阳人.助理研究员.硕土研究生.主要从裂病毒分子生物学研究。*通讯作者:张杰。1前言口稀疫(FootandMouthDisease,FMD)是由口蹄疫病毒引

5、起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，以传播迅速、感染率高而著称。FMD易感动物范围很广,包括牛、猪、羊等20科约70多种家养和野生动物。FMD一旦暴发将造成巨大的经济损失，因此世界各国对该病的研究极为重视，国际兽医局将其列为A类传染病之首。随着经济的发展,人们生活水平的提高，人们对食品安全的关注与日俱增，对畜牧产品的质械要求日益提高。各国对口蹄疫病均采取了积极措施以防止发生和防范由国外传入，而有口蹄疫疾病发生的国家则不得不进行集中扑杀来控制疫情,并投入了大量的人力、财力研究口蹄疫病的疫苗。由于口蹄疫具有暴发流行的特点，且造成的经济损失极大，因此口蹄疫疫苗的研制对畜牧业生产极为重要。预

6、防口蹄疫的传统疫苗主要为口蹄疫病毒灭活苗或弱毒苗，但存在以下诸多缺点:制剂中不能保证有足够量的抗原;存在灭活不完全的隐患;需要完善的生物防护设施,生产成本高;热稳定性差,需要低温保存,免疫持续期短,抗病毒谱有限;不能区分注射疫苗动物和自然感染动物。欧洲某些FMD的暴发就是由于病毒灭活不完全或疫苗生产实验室里活的病毒泄漏造成的。这就促使各国学者不断尝试研制更加安全、有效的FMD疫苗。随着生物技术的发展，分子免疫学、分子遗传学与基因工程技术的应用,促使对FMD疫苗的研究发生了革命性的变化o2口蹄疫基因工程疫苗研究进展FMD基因工程疫苗，如亚单位疫苗、可饲疫苗、合成肽疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫

7、苗、活载体疫苗、核酸疫苗等防治FMD的新型疫苗应运而生，并且在不断优化。从安全性、高效性、广谱性、经济性和可操作性上看，基因工程疫苗都有着常规疫苗不可比拟的优势，它的出现为最终控制并消灭FMD带来了新的希望。2.1基因工程亚单位疫苗基因工程亚单位疫苗是指采用基因工程手段制备病原体亚单位成份，由于亚单位*疫苗只含有病原体的一部分，不含有核酸，所以不会引起病原体所导致的疾病，其安全性大大提高。20世纪80年代以来,随着对FMDV抗原结构研究的逐渐深入，发现VP1片段是FMDV的主要抗原位点，能诱导机体产生保护性的中和抗体，并能产生部分保护作用。人们利用各种表达系统以表达FMDV的结构蛋白VP1J4

8、6S和12S蛋白亚单位等作为抗原制成疫苗，免疫动物均可产生沉淀抗体、补体结合抗体及中和抗体O1981年,Kupper等克隆了FMDV的VP基因，将其插入到原核表达载体PL启动子的下游，实现了VP1基因的原核表达，并通过间接ELISA和放射免疫试验证实了其表达产物具有抗原性,从而为FMDV基因工程亚单位疫苗的研制提供了理论依据。Vasantha等人用脂质体包裹。型和Asia1型FMDV的VP1制备亚单位疫苗，免疫豚鼠产生了高水平的中和抗体，小规模的田间实验也取得了比较好的效果。Kield等应用重组DNA技术首次在大肠杆菌中表达了A型FMDV主要保护性抗原VP1蛋白。以这种融合蛋白制备的实验疫苗在

9、牛和猪中均可诱导中和抗体产生。使用152昭的融合蛋白重复接种，牛可抗A型FMDV的攻击感染。Huang等则用含有0-半乳糖昔酶和一个完整的FMDVVP1蛋白主要抗原决定簇的重组融合蛋白接种豚鼠和猪，可以产生特异性的中和抗体，并起到有效的保护作用。在Morgan的实验中，用A12-32二聚体多次接种猪，猪也可产生高水平的中和抗体,可以保护猪免受强毒的攻击，但是该技术不适合0型FMDV。目前，已经发现FMDV结构基因和非结构基因24、3C串联起来表达，可以产生76S的类病毒粒子，提纯该类病毒粒子用来免疫动物，其免疫效果类似于全病毒，可产生高水平的中和抗体，能抵抗强毒的攻击,并彻底解决了FMDV常规

10、疫苗散毒的危险，显示出良好的应用前景。除此以外,酵母和杆状病毒系统也可用于表达FM-DV抗原蛋白，解决目的蛋白在原核表达系统中不被修饰加工等问题，以期提高其免疫原性。目前，已用大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、杆状病毒、植物生物反应器等表达系统表达了FMDV的部分结构蛋白或全部结构蛋白。从表达产物的免疫活性来看，真核表达产物要好于原核表达产物。2.2可饲疫苗近些年来,随着植物基因工程的快速发展，植物也被用作生产包括疫苗及药物等一系列蛋白的生物反应器，成为植物基因工程领域内的一个研究亮点。利用转基因植物技术生产疫苗，是将微生物或病毒的抗原基因导入植物，使其在植物中表达，当人或动物摄入这种植物或其抗原

11、蛋白后，即可产生对这种抗原的免疫应答。关于利用转基因植物作为生物反应器生产疫苗较早的报道出现在由Mason等在1992年的关于人类乙型肝炎表面抗原在转基因植物中的表达中,之后又有许多相关的报道。基因植物疫苗具有以下优点:（1）易于形成产业化规模,在筛选到高效表达植株后,只需增加耕种面积就能扩大其产量;（2）价格便宜,因为植物易于栽培和管理；（3）相对安全，植物病毒不会感染人类和家畜;（4）使用方便。目前，已经获得拟南芥、烟草、苜蓿等的转基因植株。Wigdororiz等（1999年）将FMDV-VP结构蛋白基因成功地插入到烟草花叶病毒（TMV）U基因组中,重组的TMV接种本塞姆氏烟草和苜蓿。We

12、stern印迹分析表明，每1g新鲜叶子中含有VP1结构蛋白50150期,利用叶子提取物对豚鼠进行免疫学试抢，结果显示其能诱导动物产生特异性免疫应答。但是，目前应用转基因植物生产疫苗也有不足之处。首先，外源基因在植物中的表达量问题，在现有的研究中,外源基因所表达的重组蛋白大约只占植物中可溶性蛋白的0.01%。.37%,即使以高表达髭者为标准，作为疫苗，这个表达量仍然较低。但这可以通过改进表达调控系统，如采用强启动子、增强子、先导序列及调控序列来促进表达;其次,关于转基因植物可食化疫苗的免疫原性问题，在人和小鼠的食用试验中，粘膜分泌性抗体的检出率分别为50%和10%，作为可食化疫苗显然是不理想的。

13、因此，有两个因素应该考虑和研究,一是植物本身可能含有一些因素会影响或干扰重组蛋白的免疫原性,这需要进一步研究，并找出解决途径;二是重组蛋白在经历胃肠消化酶的作用后，可能发生降解或被破坏,从而影响其免疫原性。可选择的解决途径是在抗原基因旁加上修饰基因或吸附基因序列（如菌毛蛋白基因），或将抗原组装成病毒颗粒样的有序结构,以增强抗消化作用。预计未来的转基因宿主将呈现多样化的局面，以满足不同动物的需求O2.3活载体疫苗利用基因操作技术将FMDV的主要抗原基因插入某种缺陷性病毒的基因组中构建成重组病毒，这种病毒可感染哺乳动物细胞并在细胞内表达FM-DV的抗原蛋白，刺激机体产生免疫反应。另外，针对FMDV

14、多血清型且各血清型之间无叉保护作用的特性，可以将不同型FMDV的VP1或P1基因插入到同一病毒活载体中，从而组成多价基因工程疫苗来预防、控制FMD及其他相关疾病。目前，用于表达FMDV抗原的病毒载体主要有痕苗病毒、腺病毒、疱疹病毒、核心多角体病毒、脊髓灰质炎病毒、牛鼻气管炎病毒、牛瘟病毒及烟草花叶病毒等"°）。2000年,Berinstein以痘苗病毒为载体构建重组FM-DV,表达FMDVC3Arg85株衣壳蛋白前体Pl基因，免疫后可检测到高水平的FMDV和痘苗病毒的中和抗体，类似于灭活疫苗免疫所产生的抗体水平。经小鼠免疫实验表明:重组痘苗病毒抗FMDV的有效免疫原可以作为

15、活载体疫苗川。Kit等利用牛传染性鼻气管炎病毒表达了FMDV结构蛋白的VP1多肽,用该重组病毒接种牛诱导产生了高水平的抗FMDV抗体。目前FMDV腺病毒活载体疫苗的研究已取得了较大的进展，有望在不久的将来应用于FMD防治。GregoryA等用表达FMDV结构蛋白腺病毒VI型免疫猪,4周后用相同剂量加强免疫1次，产生了高水平的FMDV中和抗体,5/6的免疫猪得到完全保护。Sanz等将编码衣壳蛋白前体P1的cDNA基因插入到复制型人5型腺病毒（Ad5wt）载体中。用重组的FM-DV而5-P1经皮下或鼻内接种到牛体内，在第2次免疫后，鼻内接种FMDV进行攻毒。虽然未检测出抗FMDV抗体，但经2次皮下

16、接种重组病毒的所有动物均得到有效的保护。另外,Mayr等也构建了2株表达FMDV衣壳蛋白P1-2A和3C蛋白酶基因的非复制型人5型腺病毒载体AH5-P12X3CWT和Ad5-P12X3CMUT。其中在Ad5-P12X3CMUT的3C蛋白酶编码区进行了点突变。结果只有在3CWT病毒感染的细胞中,FMDV的衣壳蛋白能被加工成成熟蛋白VPO.VP3和VP1。重组病毒经肌肉接种小鼠后，只有3CW病毒能诱导FMDV特异性中和抗体反应。接着，他们用1xIO。PFU的Ad5-P12X3CWT肌肉接种猪,1个月后用5x108PFU加强,然后进行强毒攻击。结果使5/6的攻毒猪得到保护，并使其余猪的症状表现较轻。

17、后来,他们又证明用1xlO9PFU的Ad5-P12X3CWT次免疫就能达到两次免疫的效果，这显示出了良好的应用前景仲O金宁一等将FMDV衣壳蛋白PI-2A和蛋白前3C基因单一或共同插入到鸡痘病毒载体pUTA-2和pUTA-16LacZ中,构建了重组鸡痘病毒转移载体质粒pU-TA2PI和PUTAL3CPIO应用2株重组鸡痘病毒株免疫小鼠，经对免疫小鼠脾细胞中T细胞亚类计数、脾细胞CTL杀伤活性以及FMDV抗体的检测，证明了这2株重组鸡痘病毒可以诱导小鼠产生明显的细胞免疫和体液免疫反应许多学者对活载体疫苗寄予了很大的希望，希望通过共表达一些T细胞位点和细胞因子而使活载体疫苗的免疫效力进一步提高。但

18、迄今为止，重组病毒疫苗仍然处于研究和探索阶段。与常规灭活疫苗相比较，在基因表达效率及表达产物的修饰与加工、与天然产物的生物学活性的一致性等方面值得进一步探讨。2.4基因缺失疫苗运用基因工程手段克隆口蹄疫病毒全长cDNA,构建感染性克隆，在DNA水平上来操作RNA,通过缺失与毒力相关的基因，减弱其毒力但不丧失其免疫原性。口蹄疫病毒表面高度保守的P环（G-H环）上的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（RGD）序列，构成病毒的细胞吸附位点。构建缺失或取代RGD序列的感染性的cDNA克隆，转染BHK细胞，产生缺失或突变的RGD序列的病毒粒子，这种缺失RGD序列的病毒粒子不吸附和感染细胞。以该缺失病毒进行小鼠和

19、猪的动物试验发现，野生型病毒对照组发现典型的口膝疫症状,缺失病毒试验组无任何症状。用海福特牛对这种缺失病毒所做的油佐剂苗进行免疫试验，并与常用的BEI（二乙烯胺）灭活苗作比较，证明了在产生血清中和抗体、刺激机体产生免疫应答、动物保护等方面与灭活疫苗一致。2.5合成肽疫苗合成肽疫苗即用根据免疫抗原表位的氨基酸序列合成的抗原决定基小肽制作的疫苗。一般是从蛋白质的-级结构并结合单克隆抗体的分析，推导出蛋白质免疫主要抗原表位的赛基酸顺序，然后合成或基因工程表达这一段肽作为抗原。它们具有纯度高、稳定性好、易保存、可大址生产、副作用小、使用安全等优点,近些年来得到了广泛的重视"句ODimarch

20、用合成O1K病毒VP1的141-158和200213片段氨基酸蛆成的40个氨基酸肽（半胱氨酸-半胱氨酸-200-213-脯氨酸-脯燹酸-丝氨酸-141-158-脯氨酸-半胱氨酸-昔氨酸），在其中间加上2个脯氨酸和1个丝氨酸,使多肽折成立体构型，大大提高了单段肽（141-158-脯氨酸-半胱氨酸-昔氨酸）在豚鼠中的应答水平，并提出了VP1段基端氨基酸（半胱氨酸-半胱氨酸）在提高保护应答中的重要性。Brown等用化学法合成了FMDVVP基因编码的140-160及200-213位肽段的基因片段,并在大肠杆菌体内得到了表达，用其免疫牛、猪等都获得了较好的免疫力。Doel分别用A、O、C血清型FMDVV

21、P1序列的141158和200-213肽段组成的40个氨基酸合成肽，用牛和豚鼠进行了试验,结果每个肽都产生了特异性高水平抗病毒中和抗体，在豚鼠中0、A型肽可抗各自病毒的攻击并获得完全保护，但C型的效果较差。KupriianovaMA等应用44-63个氨基酸，即FMDV-A22株VP基因第135159J70190和197-213位氨基酸所构建的合成肽疫苗,通过免疫豚鼠和小鼠,证明了相对于含有较少氨基酸的合成肽来说,其免疫效果有显著的提铲。合成肽疫苗的免疫原性基于它们能递呈VP1蛋白G-H环上关键的抗原表位。然而，这些抗原位点不仅不是病毒粒子上唯一的中和性位点，而且也不一定能被所有的宿主动物识别，

22、这导致了这些疫苗在大规模使用时候，效果并不理想。如Taboga等在138头牛进行4种合成肽疫苗的效果评价时,发现各免疫组虽可产生相应的免疫反应，甚至高水平的中和抗体，但它们对免疫动物的攻毒保护率均在40%以下。此外，由于FMDV的MHCII型的多态性、免疫系统对合成肽的提呈以及RNA病毒本身高度的变异性等多种因素，仅使用人工合成的结构简单的抗原分子很难与完整的病毒抗原分子相比较，往往不能获得理想的免疫效果。再加上合成肽的分子较小,空间构象简单，因而对免疫系统的剌激强度和识别信号不够，不仅难以产生针对高度变异的小RNA病毒的保护作用，相反还有利于抗原变异株的选择性适应。这不仅不能有效地诱导保护性

23、免疫，还会加速病毒的变异速度。如Taboga等就在未保护的牛中分离到突变逃逸株网。通过改进合成肽疫苗的B细胞表位，添加FMDV结构蛋白和非结构蛋白中的T细胞表位来合成多肽复合体，以模拟与FMDV中和抗体产生有关的形态表位,或者应用尽可能覆盖所有变异株的多肽复合物来免疫动物,尽可能减少变异株的产生。总之，如何增强FMD合成肽疫苗的免疫效果，体外合成的肽能否有效代替体内自身合成肽进行免疫等许多问题，需要进一步搞清FMD的分子免疫机制才能得以解决。2.6核酸疫苗（DNA疫苗）核酸疫苗也称基因疫苗、裸DNA疫苗，将编码基因的质粒DNA直接导入动物肌细胞内，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，能在体内表

24、达抗原并诱导机体产生免疫应答，最终达到免疫的目的。核酸疫苗有许多优点:基因疫苗的接种能全方位地调动机体的免疫系统，诱导出针对保护性抗原的特异性体液和细胞免疫应答，既具有弱毒疫苗的高效性又具有灭活苗的安全性，同时又能避免这两种疫苗的缺点，加之稳定性好、无感染因子、较易规模化生产。因此，成为该领域的研究热点。早在20世纪70年代末，人们就证实了动物体细胞具有摄取裸露DNA分子的能力。WanlG等渺）构建了在巨细胞病毒（CMV）早期启动子调控下,携带有412-FMDVVP1的DNA疫苗。HuangH等,利用猪IgG序列融合蛋白基因构建的DNA疫苗，在不同的早、晚期启动子控制下，接种豚鼠均可诱导中和抗

25、体的产生和脾细胞的增殖，但未见到保护作用。后来,Bean!等构建了两个不同的质粒。一个质粒pP12X3C携带有FMDV衣壳蛋白前体基因P1和蛋白酶3C,用基因枪将该质粒接种动物可检测到特异性的体液反应。第二个DNA质粒pWRMHX携带有编码完整个病毒基因组（但删除了细胞结合位点），用该质粒接种猪后可以产生病毒样粒子并诱导产生中和抗体。比较两种质粒PP12X3C和pWRMHX接种猪后，结果显示:携带有复制病毒基因组的质粒DNA可以产生较强的免疫力，应用pWRMHX经肌肉注射、鼻内接种和基因枪途径接种的猪均对强毒攻击产生部分保护力。Wong等细构建pCEIM和pCEIS两个质粒，它们分别串联有FM

26、DV的VP1基因的主要抗原位点基因（氨基酸残基的第141160和200213位氨基酸）和鼠及猪的免疫球蛋白基因。将它们分别接种于小鼠（腹部皮下）和猪（耳背部皮下），前者可刺激小鼠产生特异性的T淋巴细胞增殖和中和抗体,后者经2次免疫的猪也出现了T淋巴细胞增殖（SI可达8.1）,并产生高效价的中和抗体。在攻毒实验中，应用pCEIS进行免疫的猪可全部保护而不发病。2.7空衣壳疫苗研究发现，病毒的部分结构蛋白可在细胞内自行装配成为一种不含病毒核酸的空壳结构，这种空壳结构被称为病毒样颗粒（VLPs）。VLPs具有与真实的病毒粒子相似的结构,可以模仿病毒感染途径呈递给免疫细胞,从而有效地诱导机体的免疫系统

27、产生免疫保护反应。近年来利用VLPs表达技术研制安全、高效的空衣壳疫苗，已经成为疫苗研究中的一个热点。空衣壳疫苗主要有以下优点2,3:（1）它模拟了真实病毒粒子结构，拥有与灭活或者弱毒疫苗一样的衣壳蛋白,但不含有病毒的致病核酸成分。（2）缺乏病毒的DNA或RNA,不存在与野毒重组的问题。（3）空衣壳疫苗相对于普通亚单位疫苗而言需要更少的免疫原就可以刺激产生相似的保护性免疫反应。（4）除了可以刺激B细胞介导的体液免疫外，还可以刺激产生CD4和CTL,这一特点可能对其发挥高效率的免疫起重要作用。目前主要通过以下儿种表达系统表达目的基因以获得VLPs：各种哺乳动物表达系统，通过境时表达或者稳定表达的

28、方式;杆状病毒表达系统;各种类型的酵母，.如SaMtarwnycescerevis血、pichiapcuto屋;大肠杆菌等细菌;各种植物生物反应器等。不同的病毒需要根据病毒自身的特点选择合适的表达系统及策略以获得理想的结果。衣壳是由单一的结构蛋白聚合而形成的病毒，由单一的结构蛋白形成病毒衣壳的无囊膜病毒研制VLP疫苗相对简单,如乳头痛病毒、细小病毒、杯状病族、圆环病毒等。其中人乳头瘤病毒（HPV）VLP疫苗研究最为成功。通过将主要衣壳蛋白前导蛋白L1在哺乳动物细胞、昆虫、和酵母中表达,产生的VLPs被证明是安全和有效的。在临床实验前进行的动物实验中,给小鼠、兔及猴注射低剂量的111MJVLP后

29、，可产生较高滴度的中和抗体，这种中和抗体在体外可较好地中和HPV或假病毒。利用兔、狗、牛进行的实验表明，经肠道外免疫VLPs后，产生的抗体能较好的保护机体抵抗高剂量病毒的攻击O衣壳是由多个结构蛋白相互作用而形成的病毒，有些病毒的衣壳是由多个蛋白亚单位相互作用形成的，这类病毒的VLPs的获得比单一的只有主要衣壳蛋白构成的病毒的VLPs要复杂得多。一般采用通过与衣壳组装相关的多个蛋白在同一细胞中共表达或表达一个多聚前体蛋白，使其自裂解后组装VLPs的方式获得。VLP疫苗比单一的病毒蛋白更有利于诱导机体产生免疫反应。此外，利用杆状病毒、痘病毒、腺病毒等载体表达FMDV的PL2A与3C蛋白酶基因或者整

30、个病毒基因,表达产物可以组装成病毒空衣壳结构。用这种空衣壳制备成疫苗免疫动物取得了比较理想的保护效果。空衣壳疫苗是一种能够剌激机体产生体液和细胞免疫的新型基因工程疫苗。它比那些具有核酸物质的活病毒疫苗更安全，而且因为它的结构更接近于真实的病毒,所以比普通的亚单位疫苗更有效。3结语疫苗接种是控制FMD最重要的措施之一，评价一种疫苗优劣的指标主要包括安全性、效力、生产和使用方便程度及疫苗生产需要成本的高低等。传统疫苗在这些方面均存在一定的不足。随着分子生物学和基因工程技术的发展，新型疫苗的研究已经取得了较大的发展，特别是在生产的安全性方面,新型疫苗已经取得了超过传统疫苗的优势°)。

31、9;FMD基因工程疫苗的研究是综合性的工程,要想在FMD基因工程疫苗上取得实际的应用价值，这不仅需要对FMDV分子生物学相关方面的深入研究，而且还要对FMDV的免疫机理，尤其是对黏膜免疫的分子机制有全面的认识。可喜的是,许多国家已投入大量的人力、物力和财力用于该方面的研究，并且取得了一定的成果。参考文献：1 股震,刘景华.动物病毒学(第二版)M.北京:科学出版社，1997.479-499.2 RobertoMateo,EvaLuna,Ver6nicaRinc6n,etal.EngineeringViableFoot-and-MouthDiseaseViruseswithIncreasedThe

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