应用生物反应器培养Vero细胞制备EV71病毒初探.docx

1、论著.应用生物反应器培养Vero细胞制备EV71病毒初探范秀娟，孙振鹏，孙燕，李建强，李薇(兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心，兰州730046)摘要：目的应用生物反应器培养Vero细胞制备EV71病毒。方法以3L生物反应器采用4g/L.8g/LCytodex-1微载体培养比较Vero细胞比生长率，并以4g/L微载体培养EV71病毒。结果4"L微载体培养Vero细胞34d微载体细胞密度达2.3xl06/mL,按0.001的感染复数(M0I)接种EV71病毒，病毒收获液的滴度最高达7.90IgPFU/mL,较静置培养平均高出0.92IgPFU/mL。结论初步建立了

2、3L生物反应器微载体培养Vero细胞制备EV71病毒的工艺，为进一步放大生产规模奠定了基础。关键词:生物反应器;EV71；Vero细胞;微载体中图分类号：R512.5文献标志码：A文章编号：10055673(2012)06000103AmicrocarriercellcultureprocessforEV71virusinVerocellsFANXiu-juanfSUNZHen-peng,SUNYan,LIJian-qiangfLIWei(LanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Lui9Centerfor9GansuProvincialVaccineEn

3、gineeringResearch9Lanzhou730046,China)Abstract:ObjectiveToprepareenterovirus71(EV71)inVerocellbyusingabioreactor.MethodsItisbyusingconcentrationsofmicrocarriercytodex-1for4g/L,8g/LtocultivateVerocelllinerespectively,soastocompareofgrowthrate,andproducctionofEV71withamicrocarrierconcentrationof4g/L.R

4、esultsTheEV71infectedataMOIof0.001whencelldensityreachedto2.3xJ06/mLaftervirusgrowingon4g/Lmicrocairiersfor3to4days,andobtainedahigh-titerof7.90IgPFU/mLforEV71production,whichisabout0.92IgPFU/mLinaveragehigherthanthatofstaticculture.ConclusionItwasinitiallyestablishedamicrocarriercellcultureprocessf

5、orproducingEV71in3LbioreactorfwhichprovidesabasisforascaleupproductionofEV71.Keywords：Bioreactor;Enterovirus71；Verocell;Microcarrier人肠道病毒71型是引起5岁以下婴幼儿手足口病(Hand,foot,mouthdisease,HFMD)的主要病原体,少数患儿可并发严重中枢神经系统疾病。近年来,HFMD在中国已多次爆发流行，研制安全有效的EV71疫苗是控制HFMD流行的最主要手段。EV71疫苗的研究主要集中在全病毒灭活疫苗上，而生物反应器大规模细胞培养技术为EV71病

6、毒的大量制备提供了条件。目前，运用该技术培养高密度Vero细胞,为多种病毒性疫苗的生产奠定基础，如狂犬病毒疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗和流行性乙型收稿日期：2012-08-23;修回日期：2012-10-18基金项目：甘肃省科技重大专项计划课题(092GKDA010)作者简介:范秀娟(1966-),女，医学生物学工程师，主要从事生物反应器细胞及病毒的培养。通信作者：李薇,E-mail:421885206脑炎病毒疫苗等七句。研究将此技术应用于EV71灭活疫苗的研制中，初步建立生物反应器微载体培养Vero细胞生产EV71病毒的工艺，为进一步扩大生产规模奠定基础。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞及病

7、毒Vero细胞购自美国ATCC;EV71病毒Vero细胞适应株EV71-853由兰州生物制品研究所有限责任公司第六研究室分离、保存。1.1.2 试剂及仪器3L生物反应器购自荷兰APPUK0N公司;微载体Cytodexhl购自GE公司;DMEM购自GIBCO公司;细胞计数仪购自RCHE公司。1.2方法1.2.1种子细胞的制备将Vero细胞种子在T.flask、转瓶上扩增至致密单层后，使用0.25%胰酶消化，并对细胞悬液进行计数。1.2.2生物反应器及微载体的准备称取Cytodex-1微载体4g/L于3L生物反应器,工作体积2L,用无Ca2Mg2+的PBS浸泡过夜,121乞高压灭菌1h,排空PBS

8、缓冲液，用DMEM培养液浸泡过夜，校准pH、溶氧（DO）电极。1.2.3 Ven>细胞的培养从反应器的进液口加入已消化好的Vero细胞工作种子悬液,边加边搅拌,使细胞均匀分布于微载体上。培养模式为批式培养，细胞生长液为含5%牛血清的DMEM培养液，根据pH和DO值自动调整NaHCO3的加量及空气、氧气的分配比例。于37Y培养34d,待细胞生长进入平台期，将反应器内培养液置换为不含牛血清的DMEM维持液。按下列公式计算不同微载体浓度细胞密度达到平台期时的比生长速率小式中:X代表活细胞的密度（个/mL）代表取样的时间点（h）和妃为两个取样点。1.2.4 EV71病毒的培养待微载体上细胞长满单

9、层密度达2.3xlO6/mL,以0.001MOT接种EV71病毒工作种子批MS20110321,维持培养温度（35.5±0.5）Y,pH7.47.6,D040%。显微镜下观察细胞病变，每隔24h取样，检测病毒滴度。1.2.5 EV71病毒滴度的测定将Vero细胞按（1.52.0）x"/mL加入24孔细胞培养板,37T培养48h用含1%牛血清的DMEM培养液将待测样品1。倍系列稀释，取IO-、1。一6、10刁三个稀释度加入24孔板,100fxL/孔，每个稀释度重复2孔，同时设置细胞对照和内控品对照，覆盖1%甲基纤维素营养液,（35.5±0.5）Y培养5d后使用结晶紫

10、溶液染色，并计算病毒滴度。2结果2.1不同微载体密度时Vero细胞生长情况的比较分别采用4g/L.8g/L两种不同的微载体密度进行批式培养，每24h取样测定细胞密度,计算不同微载体密度各批次到达平台期细胞的比生长速率从,4g/L微载体密度共培养7批次,34d达平台期，细胞的平均比生长速率为（0.0218±0.0029）h-1。8g/L微载体密度共培养3批次,67d达平台期,细胞的比生长速率为（0.0119±0.0005）h。细胞的比生长速率差异显著（P<0.005）,见表1。表1不同微载体密度培养Vero细胞Tab.1Theresultofcelldensityfor

11、differentconcentrator)ofmicrocarrierusedongrowthofVerocell*:Itl=8.560>t0005/2(5)=4.604批次载体密度（g/L）细胞接种密度（X105个/mL）平台期细胞密度（X105个/mL）达到平台期所用时间/h比生长速率/h'1平均比生长速率/h-P0014.03.221.0960.01950024.03.516.1720.02130034.03.623.1720.02590044.03.723.1720.02560.0218±0.00290054.03.516.6720.02170064.03.2

12、18.9960.01850074.03.322.1960.01980088.05.939.91680.01140098.06.035.81440.01240.0119±0.0005<0.005*0108.05.932.81440.01192.2EV71病毒的培养以3L生物反应器采用4g/LCytodex-1微载体培养Vero细胞，培养34d细胞密度达2.3x106/mL,按0.001MOI接种EV71病毒，病毒增殖高峰在病毒接种后34d,最高滴度达7.90IgPFU/mL（见图1）,11批病毒收获液的几何平均滴度为7.52lgPFU/mLo2.3生物反应器微载体培养EV71病毒

13、与细胞瓶培养的比较在相同条件下，EV71病毒工作种子批以相同的M0I(0.001)分别接种细胞培养瓶T-flask(175cm2)以及3L生物反应器，每24h取样检测病毒滴度，绘制上述两种培养方式的病毒滴度动态曲线(见图2)。使用T-Flask静止培养时，病毒滴度增长速度较缓慢，达到最高滴度时间较长;而以生物反应器微载体培养时，病毒滴度在24-72h增长较快，之后随着细胞大量脱落，病毒滴度达到平台期，最高滴度比静止培养W0.92IgPFU/mL以上。图1生物反应器培养EV71病毒滴度1SummaryoftitersforEV71virusculturedbybioreactor图1生物反应器培

14、养EV71病毒滴度1SummaryoftitersforEV71virusculturedbybioreactorTwnHd8-«®»嗥图2生物反应器与细胞瓶培养EV71病毒滴度的动态曲线Fig.2DynamicscurvefortiterofEV71culturedinbioreactorandT-flakquvfwdx-«厦赣联3讨论目前，国内Vero细胞制备病毒性疫苗大多采用转瓶生产工艺，由于受到转瓶表面积和培养条件的局限性影响，生产规模受到限制，而利用生物反应器生产具有表面积大、各种参数条件易于控制、适合大规模批量生产等优点。使用生物反应器进行V

15、eo细胞培养，微载体浓度为4g/L时，34d达平台期,细胞密度可达2.3xlO6/mL左右,细胞的倍增倍数约7倍，平均比生长速率为0.0218FT)说明细胞生长快，产量高,批间差异小。当反应器内微载体浓度提高至8g/L时,采用批式培养Vero细胞能获得更高的细胞密度，达3.04.0xl06/mL,但其细胞平均比生长速率仅为0.0119hi,为4g/L微载体浓度的55%,说明细胞活力状态较差，不利于病毒的生长复制，提示在生物反应器内进行高浓度微载体培养时，采用批式培养的方式不足以满足细胞快速生长的需要,应采用灌流培养或其他培养方式。EV71近年来在我国多次暴发流行，规模大，范围广,对其疫苗的研制

16、迫在眉睫。使用生物反应器微载体培养Vero细胞大量制备EV71病毒为灭活疫苗的研制提供了条件。研究以分离得到的疫苗候选株853为毒株种子，以4g/L微载体培养EV71病毒11批，几何平均滴度为7.52lgPFU/mLo而使用T-Flask培养瓶静置培养所能达到的病毒滴度仅为6.60IgPFU/mL,与生物反应器培养滴度平均相差0.92IgPFU/mL,即一个3L的生物反应器培养的EV71病毒量相当于330个150mL的T-Flask在生物反应器培养EV71病毒既提高了细胞密度和产毒量，又减少了大量的人力物力的投入，其原因可能在于生物反应器能够较好的控制温度、pH、DO等影响病毒复制的关键参数，

17、使得培养环境大大改善,从而细胞密度和病毒的产量都得到提高。研究所用的EV71病毒株能够适应在Vero细胞上培养，因此在生物反应器中培养EV71病毒是可行的，且效果明显优于静置培养，但要放大到更大规模生产还需进一步优化培养条件。参考文献1LiJ,LiW,GaoJ,etal.GeneticanalysisofthePlregionofhumanenterovirus71strainsandexpressionofthe55FstrainVPlProteinJ.Virologicalsinica,2012,27(1)：10-18.2 RourouS,vanderArkA,vanderVeldenT,etal.Amicrocarriercellcultureprocessfor