多杀性巴氏杆菌的分型及其灭活疫苗研究进展.docx

1、第39卷第7期2017年7月中国预防兽医学报ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicineVol.39,No.7Jul,2017doi:10.3969/j.issn.l008-0425.2017.07.19多杀性巴氏杆菌的分型及其灭活疫苗研究进展赵战勤'，乔鹏芸I,刘倩玉I,薛云2.，丁轲I（I.河南科技大学动物科技学院/河南省高等学校环境与畜产品安全败点学科开放实验室.河南洛阳471（X）3;2.河南科技大学医学技术与I：程学院医学检巍实脸室，河南洛阳471003）中图分类号：S852.61文献标识玛：B文章编号：1008-0589(2017

2、)07-0600-05Correspondingauthor收收日期:2016-04-21基金项目：国家自然科学基金项目（31302106,31672530）;国家重点研发计划项H（2016YFD0500700）作者简介：赵战勤（1980），男，河南兰考人，副教授.博士，主要从事家畜传染病及其疫苗研究.*通信作者：E-mail:xueyun6688巴氏杆萌病（Pasteurellosis'）是由多杀性巴氏杆菌（Pas-teurellamultocida.Pm）引起的多种畜禽、野生动物及人类的一类传染病的总称。动物急性病例以败血症和炎性出血为主要特征。Pm由路易斯巴斯德于】880年首次从

3、禽霍乱病例中分离获得并以其名宇命名。该菌广泛分布于世界各地。在同种或不同种动物间可以相互传染，也可以感染人，大多因动物咬伤所致°蝉和蚤被认为是自然传递的媒介昆虫。过去曾按感染动物的名称，将该菌分别称为牛、羊、猪、禽、马、兔巴氏杆菌，后统称为Pm。抗生素和抗菌坊物的广泛应用.曾使细菌性传染病得到了有效的控制，但近年来，从此界各国控制该类疫病的技术进展看.抗生素疗效下降或无效、药物残留及食品安全问题日益凸现，细菌性传染病的危害日益严重。因此.免疫接种仍然是控制和消灭细的性传染病的主要手段本文通过回顾Pm的分型及其灭活疫苗的研究进展.以期为巴氏杆菌病高效疫苗的研究与开发奠定基础和提供新思路

4、，1Pm的分型根据萌株间抗原成分的差异.Pm分为多个血清型。1955年，Carter等用被动血凝试验对该菌荚膜抗原（K抗原）分类，可分为A（透明质酸）、B（阿拉伯糖、甘露饿和半乳糖）、D（肝素）、E（未鉴定）和F（软骨素）5种血清型（Carter分型）叫1961年，Namioka等根据菌体（O抗原）抗原将Pm分为12个型，并将菌体型与英膜型结合起来，形成】:A、l:D、2:D、3:A、3:D、4:A、5:A、6:B、6:E、7:A、8:A、9:A、IO:D、ll:B和12:D等15个血清型回。1972年，Heddleston等通过琼脂扩散试脸对Pm热浸出萌体抗原分类，可分为I16个不同的血清型

5、。1984年，Carter等又提出本菌血清型的标准定名，以阿拉伯数字表示热浸出菌体抗原，大写英文字母表示K抗原，因此菌株的血清型可表示为A:l、B:2、D:2等（K抗原:热浸出菌体抗原）.或5:A、6:B、2:D等（O抗原:K抗原）叫这是目前该萌血清型定名的标准方法。该病的羯型、宿主特异性、致病性、免疫原性等与血清型有一定的关联性"同。如A型可引起禽霍乱、猪肺疫；B型可引起牛和猪等动物的败血症；D型和E型可引起猪、牛、兔、羊等动物的肺炎和败血症；F型主要发生于火鸡，其致病作用目前不清楚。另外.也可从发病动物体内分离到无荚膜的Pm菌株，这些分离株不属于任何荚膜血清型。1985年，Mut

6、ters等对Pm鉴别系统进行了生物学分类.将其进一步分为3个亚种，即多杀亚种.败血亚种和杀禽亚种问。1997年，Blackall等对从澳洲猪群中分高的150株Pm进行鉴定，结果表明，这些萌株可分为7种不同的生化表型，其中91%的分离株属于多杀亚种；9%的分离株属于杀禽亚种。我国对Pm的血清学鉴定表明，有A、B、D、F4个血清群，没有E血清群。如与。抗原鉴定结果相互配合，牛羊以6:B最多；家兔以7:A为主,其次是5:A;家禽以5:A最多，其次是8:A。在猪群中，各血清型的流行性存在较大差异.具有明显的地方特征同C90年代以前，在我国猪群中A和B型IW株曾一度占据主导地位。近年来，A和D型菌株为主

7、要流行血清型，偶见B和F型15）。上述分型的抗原成分荚膜（capsule）和脂多格(lipopolysaccharide,LPS)与Pm的抗原性和致病性有关。Pm荚膜的主要成分为多糖，具有抗原性.并具有种和型特异性，是Carter等对Pm进行荚膜分型的抗原基础叫LPS由类脂A、核心多糠和侧链多慵三部分构成，其中侧链多糖具有抗原性，并具有种和型特异性.称为0抗原或菌体抗原，是Namioka等(O抗原)和Heddleston等(LPS抗原)对Pm进行分型的抗原基础。因此，两种抗原均是研发Pm菌体疫苗的重要免疫学基础。2009年2014年，Harper等在对PmLPS结构及其合成基因箱深入分析的基础

8、上，发现可将Pm分为L1-L8共8个基因型，并建立了对应的特异性PCR分型方法凹。2009年，StMichael等发现按照Heddleston方法归类的2型和5型Pm具有相同的LPS外核结构(Lipopolysaccharideoutercore),将其确定为L2基因型。2011年至今，Harper等按照相似方法又先后确定rHeddleston方法归类的1型和14型Pm为L1基因型，3型和4型为L3基因型，6和7型为L4基因型，9型为L5基因型，10、11、12和15型为L6基因型，8和13型为L7基因型，16型为L8基因型时。2014年，Harper等在对全部Heddleston1-16型P

9、m确定为L1-L8共8个基因型的基础上，建立了Pm的特异性PCR分型方法；对58个分离株鉴定的结果表明，该PCR方法能对其中的57株进行分型，而按照传统的Heddleston方法只能对其中的20株进行清晰定型时。PCR分型方法很好的解决了传统方法抗血清制备困难、很多菌株不能定型、以及不同菌株交叉反应的问题。2不同动物Pm灭活疫苗的研究1958年，Heddleston等证实福尔马林灭活的Pm能使免疫鸡产生较高的同源保护，后来也证实其细菌裂解物也具有相似的免疫效力向。1963年，Hamdy等的研究证明Pm菌苗在羔羊身上具有安全性和有效性"七1970年，Heddleston等使用3株Pm分

10、别制成油乳剂灭活疫苗，免疫火鸡后发现均能诱导产生较强的同源免疫保护效力，但互相之间不能产生交叉保护力四，表明至少存在3种不同的Pm免疫型。通过不同剂量的免疫实验发现，使用ImL疫苗免疫火鸡较0.5mL能产生更好的保护力.表明Pm灭活疫苗的保护力与接种剂量呈正相关。在比较攻毒途径时.发现鼻腔接种较与同居感染的方法更有效。当使用中等毒力的菌株进行攻毒时，肌肉注射途径优于上述2种方法叫1980年1987年，比利时兽医学院的学者对Pm的油佐剂灭活疫苗进行了一系列的免疫实验研究帅。最初获得了1株产生部分免疫保护的Pm株，进一步研究发现该菌株油佐剂灭活疫苗能够使免疫家兔产生免疫保护力，对Pm灭活菌液与油佐

11、剂疫苗进行小鼠免疫实轮比较.发现两者均能提供免疫小鼠针对同源强毒慵株的保护效力皿。其他研究也证明了油佐剂疫苗在鸭、小牛和小鼠的有效性明。1989年，Avakian等对1种弱毒疫苗(CU株)、2种商品油佐剂疫苗、2种实验室制备的多价油佐剂疫苗进行了鸡的免疫实验比较.在首免后30周使用强毒菌株X73进行致死性攻击，发现2次弱毒疫苗免疫、1次弱毒苗加1次灭活苗免疫、2次灭活苗免疫的鸡均得到了有效保护，但保护力有一定差别，分别为100%.100%和86%。在首免后60周，这3种免疫方式的保护率均有所下降，但是前2者高于后者，分别为88.5%、100%和42.9%四。2001年，Shah等的实验证实小牛

12、经过1次或2次肌肉注射接种B:2.5型Pm油佐剂疫苗后，分别能产生8个月和14个月的持久保护力；同时他们在小鼠免疫实验中还发现该疫苗能提供针对E:2.5型的交义保护力，但却不能提供针对B:3.4型的交叉保护力咧。2012年，张敬峰等使用鸡胚同时培养PmC-458株和H9亚型禽流感病毒NJ01株，经灭活后制备二联灭活疫苗并分别进行鸡和鸭的免疫保护实验，其对致死剂量同源菌株G458攻击的总保护率分别为100%(45/45)和95.6%(43/45);同时，其针对H9亚型禽流感病毒的HI抗体均达到61og2以上闻。2013年，汪漫等制备了4个牛源A型分离株Pm-HG、Pm-HH、Pm-ZX,Pm-Z

13、MD和1个B型标准株CVCC44701的单价灭活疫苗并进行了小散免疫保护实验，其对致死剂量同源菌株攻击的保护率分别为100%、50%、100%、100%和60%；对4个A型分离株的交叉保护率介于30%100%,其中Pm-HG的保护率最好，分别为100%、90%、90%和100%；但4个A型分离株对B型CVCC4470I株均不能提供任何交叉保护；进-步使用A型Pm-HG株和B型CVCC44701株制备二价灭活疫苗并进行小鼠免疫保护实验，其同源保护率分别为90%和20%,作者认为是两种抗原间的免疫竞争和拈抗导致其保护效果均下降刖。2014年，贺奇义等使用制备的牛源A型Pm灭活疫苗进行小鼠和家兔免疫

14、实验.其同源保护率均为100%(分别为5/5和3/3)。2015年，王晓丽等使用兔PmJN株和兔病毒性出血症病毒BZ株制备二联蜂胶灭活疫苗，其对同源、JN株和BZ株攻击的总保护率分别为84%(21/25)和100%(25/25)；该疫苗已于2016年获得国家新兽药注册证书(数据来源：国家兽药基础信息查询系统，:8081/cx/)o2016年，张永武等使用水貂源绿脓杆DL1007株、PmRC1108株和肺炎克雷伯杆菌ZCU08株制备3联灭活疫苗并进行了水貂免疫实验，其同源保护率均为100%。这些研究结果表明，Pm灭活疫苗具有较高的同源保护效力，但其不同血清型之间的交叉保护力较弱。提示提高巴氏杆菌

15、灭活疫苗效力的方法是多价疫苗策略。由于Pm血清型众多，且各血清型之间的交叉保护尚不明确，因此尚需对Pm的抗原类型、免疫机制等进行更深入的研究。目前，国内上市的动物巴氏杆菌病疫苗（数据来源：国家兽药基础信息查询系统，:8081/cx/）有牛Pm病灭活疫苗（包括B群C45-2株、C46-2株和C47-2株）、兔病毒性出血症-Pm病二联灭活疫苗（其中Pm为A群QLT-1株、C51-17株和JN株）、禽Pm灭活疫苗（A群C48-2株和1502株）、鸡Pm病-大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗（A群BZ株+078型YT株）、禽Pm病活疫苗（A群G190-E40株和B26-T1200株）、猪Pm病灭活疫苗（B群C

16、44-I株利C44-8株）、猪Pm病活疫苗（B群679-230株、EO630株、C20株和禽源A型CA株）。表明，牛、兔、禽的疫苗抗原与我国流行的Pm血清群一致但是，大部分猪的疫苗抗原与目前我国流行的血清群不一致mF,旦存在预防疾病单一的问题。因此，急需研发一种能同时覆盖PmA群和D群的二价疫苗。3灭活疫苗抗原组份对疫苗效力的影响Heddlcston和Robcrs等发现使用火鸡和火鸡胚活体培养的Pm制备的灭活苗能同时使免疫火鸡产生同源和异源保护力，但使用鸡、鸡胚或小鼠活体培养以及体外培养基培养该商制备的灭活苗仅能使免疫火鸡产生同源保护。而且还发现.使用鸡胚或火鸡胚培养制备的疫苗也能使免疫小鼠.

17、产生同源保护力，但不能提供交又保护力。表明，Pm在火鸡中产生的交叉免疫力是宿主特异性的，因为产生交又保护的某些抗原因子只有在火鸡胚中才能表达。同时，还发现使用热、干燥、甲醛、缶丙内酯、苯酚、叠氮化钠、硫柳汞和新霉素进行抗原灭活制备疫苗的保护力没有显著差别。但使用戊二醛灭活抗原却使疫苗的保护效力丧失时。1998年，Mosier等比较了一种含有荫体抗原和多种亚单位抗原成分，包括白细胞毒素（Lcukotoxoid,LKT）、荚膜多糠、分泌性抗原的灭活疫苗和一种商品化溶血性巴氏杆凿弱毒疫苗（PMH株，拜耳公司产品）对牛的免疫保护效果，结果表明，前者产生针对菌体抗原和各种亚单位抗原的抗体水平显著高于后者

18、，使用强毒菌株攻毒后前者所形成的病理变化明显较后者轻微回。1996年，Adler等通过单克隆抗体（MAb）扫描技术研究了PmLPS在其免疫保护中的作用，发现6种MAb能与B:2型和B:5型Pm的LPS发生反应，但却不能与其它血清型Pm的LPS发生反应。进一步研究表明，这6种MAb均能调理巨噬细胞的吞噬作用，但是在补体存在的情况F不具有直接杀死细萌的作用，在小鼠被动免疫保护实验中能对小鼠产生部分保护力，而使用只含有LPS成分的疫苗进行的小鼠主动免疫保护实验中也得到了相似的保护效果。这些实验结果表明，LPS在Pm的免疫机制中具有一定保护作用。2007年，Filia等在普通培养基、缺铁培养基、富铁培

19、养基中分别培养Pm,然后制备铝胶佐剂灭活疫苗并进行了家兔免疫实验，发现3者产生的EL1SA抗体和微量凝集试验抗体的水平没有显著差别；最后将普通培养基培养的Pm制备铝胶佐剂和油佐剂灭活疫苗，两者均能够提供免疫牛针对致死剂量亲本菌株攻击的完全保护。2008年，Garrido等证明使用高效表达外膜蛋白（Outer-mem-braneprotein,OMP）的重组菌株制备的油佐剂疫苗能提高其同源和异源保护效力。2016年，Harper等发现使用具有特定结构LPS的菌株制备的灭活苗只能产生针对具有相同或相似LPS菌株的保护效力,但弱毒疫苗对免疫动物提供的保护却基本不受其LPS类型和结构的影响.LPS缺失

20、型的弱毒巴氏杆菌疫苗仍能提供免疫鸡针对具有完整LPS的亲本菌株的攻击；使用具有L1型LPS的弱毒疫苗菌株均能够提供免疫鸡针对L3型强毒菌株的攻击；同样.使用具有L3型LPS的弱毒疫苗菌株均能够提供免疫鸡针对L1型强毒苗株的攻击3）。这些研究结果表明，Pm弱毒疫苗菌株能同时提供免疫动物同源和异源的保护效力。这些研究报道显示，LPS是Pm重要的保护性抗原，也是Heddleston等对该菌进行分型的抗原基础，由于其具有种和型的特异性，因此仅能够提供同源保护.不能提供异源保护。另外，该菌的亚单位抗原成分（包括OMP、LKT等）具有重要的免疫保护作用，同时也是该菌产生交叉保护的重要抗原因子。4佐剂对灭活

21、疫苗效力的影响不含佐剂的Pm灭活黄液与含油佐剂的灭活疫苗均能使免疫的SPF家兔产生一定的免疫保护力，但前者对家兔接种部位会产生组织损伤，而后者则没有。对Pm灭活菌液与油佐剂疫苗进行了小鼠免疫实验比较，发现两者对免疫小鼠提供的保护效力没有显著差别，且使用火活函液2次免疫小鼠后能使其产生针对同源强毒菌株攻击的完仝保护网。然而其他一些学者在证明油佐荆疫苗对鸭、小牛和小鼠有效性的同时，其对家禽局部组织的刺激并不明显的。1994年，Chandrasekaran等制备了种双重乳化的疫苗（Multipleemulsionvaccine,MEV）,即将制备好的油佐剂疫苗与等体积的吐温-80再次进行乳化而成“对

22、该疫苗与不含佐剂的萌体苗、铝胶疫苗进行/水牛的免疫实验比较，结果表明3种类型的疫苗分别能提供免疫水牛6周、6个月、12个月的免疫保护力，抗体测定结果表明其保护力与3种疫苗产生的抗体水平具有相关性叫。Borkows-ka-Opacka等分别制备了含有Pm血清3型和4型灭活抗原的油佐剂疫苗和铝胶佐剂疫苗并进行了家兔免疫保护实验，结果表明两种佐剂的二价疫苗经皮下途径免疫家兔后可提供有效保护啊。Verma等证实这种MEV在家兔和牛的免疫实验中也得到了相似的保护效果俶。2001年，Shah等比较了含有油佐剂(Mercol52)和氧氧化铝胶佐剂的Pm疫饬的免疫效力，结果表明，油佐剂疫苗能产生更高的抗体水平

23、且能提供针对B:2.5型Pm的更好保护，同时显示其保护率与IgG的抗体水平具有显著相关性，而与IgM的抗体水平并不具有相关性咧。2004年，Dowling等证明用不含佐剂的灭活Pm悬液不能诱导小牛产生保护性免疫反应回。2008年，Belloc等比较了油佐剂与儿种新型佐剂在Pm灭活疫苗的安全性和免疫效力。结果显示，两种油佐剂ISA70、ISA774和1种水包油(W/O)型佐剂均能产生一定的免疫效力，而其副反应的强度主要取决于油佐剂的浓度和表面活性剂的品质；另外，水溶性的纳米佐剂IMS1112不能产生任何抗体反应和保护力2011年，Nassar等发现埃及蜂胶也可以作为制备巴氏杆菌灭活疫苗的佐剂，并

24、能明显提高疫苗的免疫效力处】。2012年，Kumar等将皂昔添加到油佐剂疫苗中能够提高小鼠和牛的体液免疫和细胞免疫反应水平，并能抵抗致死性同源强毒盈株P52的攻击。2015年.Kumar等制备了一*种油-铝双佐剂疫苗(Alumprecipitatedoiladjuvantvaccine,A-OAV),即将制备好的铝胶(20%)佐剂疫苗与等体积的油佐剂再进行乳化而成。通过该A-OAV疫苗与传统OAV油佐剂疫苗进行了稳定性和小鼠保护效力的比较实验，结果表明A-OAV疫苗的稳定性更强，且能够产生更高的抗体水平(p<0.05);当使用100LDa和1000LDs强毒菌株P52攻击时，A-OAV疫

25、苗均能够提供接种小鼠的完全保护(100%),而OAV疫苗分别能够提供100%和60%的保护力质。这些研究报道显示，与其它疫苗类似，佐剂能够有效增强动物机体对Pm抗原的特异性免疫应答。但是，不同的佐剂或不同的乳化策略增强其免疫效力的程度具有明显差异。油佐剂等能够有效增强Pm菌体抗原的免疫效力，双重乳化疫苗(如：MEV和A-OAV)能进一步提高灭活疫苗的免疫保护作用，蜂胶和皂昔对提升疫苗效力也具有明显的促进作用。5小结Pm含有荚膜抗原、菌体抗原(O抗原)、热浸出菌体抗原以及白细胞毒素(Leukotoxoid,LKT)等多种亚单位抗原。根据菌株间抗原成分的差异，Pm分为多个血清型，其血清型与致病性存

26、在一定的相关性。通过回顾Pm的抗原分型及其灭活疫苗的研究历史，显示由于Pm血清型众多，且各血清型之间的交叉保护力低，各灭活疫苗免疫保护效力的研究结果也不尽相同。因此尚需对Pm的抗原类型、免疫机制等进行更深入的研究。现有Pm抗原类型及其灭活疫苗的研究进展，对Pm灭活疫苗的研究与开发具有重要指导意义。总结归纳如F:(l)Pm灭活疫苗具有较高的同源保护效力，但其不同血清型之间的交又保护力较弱；(2)双重乳化疫苗(如：MEV和A-OAV)能够明显提高灭活疫苗的免疫保护效力，蜂胶和皂昔对提升疫苗效力也具有促进作用；(3)多价疫苗策略是增加其保护覆盖面的有效途径。(4)Pm在体内和体外的抗原表达具有明显差

27、别，但在体外培养过程中，培养基和灭活剂的种类对疫苗效力无明显影响；(5)亚单位抗原成分(包括OMP、LKT等)具有重要的免疫保护作用，同时也是该菌产生交又保护的重要抗原因子。参考文献：(IWilsonBA,HoM.Pasteurellamultocida:fromzoonosistocellularmicrobiology(J.ClinMicrobiolRev,2013,26(3):631-655.|2赵战勤，刘倩玉，席晓剑，等.猪源A型和D型多杀性巴氏杆凿强毒菌株的生物学特性比较研究J.中国预防兽医学报，2016,38(5)：366-370.3MeeuscnENT,WalkerJ,Peter

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