反向遗传学技术在疫苗研究的进展.docx

1、技术进展反向遗传学技术在疫苗研究的进展薄洪舒跃龙(中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心.北京.100052)do«10.3969/jssn.1674-03192010.02.005反向遗传学技术在本文通过反向遗传学技术的基木原理，发展历史和反向遗传学技术在疫苗研究方面的进展与应用，示:点介绍门文向遗传学技术在流感病毒疫苗方由i的应用。反向遗传学是指按照生物体DNA或蛋白质序列信息.通过对目的基因进行定点突变.基因的插入或缺失等必要的加工修饰.按照组成顺序构建含有生物体必需原件的修饰基因组.装配出具有生命活性的个体.研究基因组的结构和功能以及针对目的基因的修饰对生物体表型、

2、性状产生的影响.与之相关的技术称为反向遗传学技术。反向遗传学的基本技术特点是通过体外反转录、化学合成、质粒扩增等方法得到生物体的基因组DNA,在体外操作获得具有生物学活性的生物体。反向遗传学在分子病毒学领域主要是指将野生病毒的cDNA通过"拯救"的方法产生重配病毒，通过此项技术能够实现病毒基因的重配及毒株的减毒。由于正链RNA病毒和负链RNA病毒遗传特点的不同.正链RNA病毒的mRNA能够直接启动病毒合成过程。而员链RNA病毒的mRNA不具有感染性,负链RNA病毒的cDNA需要病毒全部蛋白质的参与下才能完成病毒的复制和转录。反向遗传学系统于1978年首次建立并用于正链RNA

3、病毒，通过将正链RNA病毒的全长DNA转染进入真核细胞.RNA编码的蛋白质进行相应的表达，起始病毒的复制气为了研究反向遗传学系统能否操纵负链RNA病毒的复制，1980年将反向遗传学技术首次用于负链分节段和不分节段RNA病毒的包装研究气早期研究通过采用不同方法分离病毒的核糖体结合蛋白进而发现病毒的RNA必须与核糖体共同作用才能进行病毒的包装，1989年.Palese等首先进行了针对流感病毒反向遗传学技术的改进，经体外转录产生类病毒RNA,与纯化的多聚酶和核糖体蛋白组成核糖体蛋白复合物，在辅助病毒的帮助下.同时将核糖体复合物转染入真核细胞.得到重配病毒。采用辅助病毒包装流感病毒会为重配病毒的筛选带

4、来很多不便。Hobom等利用RNA聚合酶】系统体内合成流感病毒的RNA，Neumann和Pleschka应用RNA聚合酶I的系统进行了病毒的包装.但是重配病毒的包装效率限制了此方法的应用，1999年首次采用质粒系统克隆cDNA完成了流感病毒的包装，随着反向遗传学技术的不断发展与完善，在研究DNA和RNA病毒疫苗方作者简介湾洪.助理研确员,主要研究方向孟欧筋疫苗、新型疫as及佐斤jestH死Tel-mail：bohong20CX)2001mxn通讯作者舒跃龙.教殷.研究员E-mailiyshu$)关键词反向遗梅学疫术，疫Si,流感掩IB史参考虫献JuanC,delaT

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14、，使腺病毒成为了新型疫苗载体。腺病毒载体不仅具有安全、稳定、便于操作以及有效性特点,而且能够诱导系统性的免疫应答和针对呼吸道消化的黏膜免疫应答。以腺病毒为载体的疫苗对不同免疫途径均能产生强的免疫反应。腺病毒载体包括人用腺病毒载体和非人用腺病毒载体。目前采用腺病毒为载体的疫苗主要包括埃博拉病毒、人类免疫缺陷病毒、冠状病毒.人乳头痛病毒、麻疹病毒重组疫苗.这些重组疫苗在灵长类动物体内均能产生有效的免疫应答和免疫保护，12以作感染性痘苗羯毒作为裁体的疫苗痘苗病毒的基因蛆结构具有3个特点： 适合于cDNA很大的基因组的操作.其容纳外源基因的能力至少26kb«携带外源基因的重配病毒与没有携带外

15、源基因的野生病毒对比基因组的稳定性，感染性和病毒在组织上的复制性是一致的；痘苗病毒载体能够将外源基因通过体外连接的方法插入,而无需借助质粒携带外源cDNA作为中间裁体完成cDNA的转移伫；插入痘苗病毒载体的外源基因借助痘苗病毒的同源重组能够进行突变。20世纪80年代中期利用痘苗病毒表达狂犬病病毒糖蛋白就已经获得专利。这一重组痘苗病毒不仅能在动物体内诱导产生高滴度的狂犬病病毒中和抗体和使鼠抵抗狂犬病病毒的攻击吃并且制成的口服疫苗用于动物的免疫已得到较为广泛地应用。在艾滋病疫苗研究方面，用人工致弱毒株MVA(modifiedvacciniavirusAnkara)表达艾滋病病毒抗原基因用作重组疫苗

16、，将HIV-1A型病毒gagp24/17与CD8，T细胞的抗原决定簇融合表达的MVA作为疫苗已经在非洲进行了临床试验。以痘苗病毒为载体进行冠状病毒的基因蛆操作，包装重配病毒进行疫苗和致病性的研究气传统的以原核克隆载体系统的策略对229E冠状病毒的稳定扩增不具有适用性,而痘苗病毒载体更适合冠状病毒的基因操僭气通过反向遗传学技术对以痘苗病毒为载体的冠状病毒能够进行多个基因的表达操作和类病毒颗粒的包装.这种类病毒颗粒能够转导成熟和未成熟的人树突状细胞进行载体介导的异源基因的表达，用于疫苗的研究吃2反向遗传学技术在RNA病毒疫苗的应用2.1将甑灰质炎曲毒重配疫苗脊髓灰质炎病毒是正链RNA病毒，以其作为

17、载体的疫苗能够在人体内诱导较强持久的免疫应答.便于口服，适合黏膜免疫。基于眷髓灰质炎病毒为载体的疫苗通过复制型和复制缺陷型两种方法完成。采用反向遗传学.1986年Kaplan等首次体外包装出脊髓灰质炎重配病毒而后采用脊髓灰质炎病毒为载体进行艾滋病毒、乙肝等重组疫苗的包装，在小鼠和猴子体内诱导特异性免疫应答的产生同时在黏膜免疫途径具有很好的免疫效果。2.2狂犬病毒重:配疫苗狂犬病病毒是第一个通过反向遗传技术进展技术进展学技术成功拯救出的有感染性的单股不分节段负链RNA病毒.利用反向遗传技术改造狂犬病病毒.得到的重组病毒高度减毒。利用反向遗传技术构建重组狂犬病病毒减毒活疫苗并取得成功的例子不胜枚举

18、。2001年，Morimoto等利用基因修饰和反向遗传技术.通过333位Arg/Glu替换和胞浆结构域的修饰等对致病性毒株来源的GP进一步减毒以到达降低其致病性的目的。2005年.Ito等利用反向遗传技术构建了一株缺失M基因的RC-HL病毒(RC-HLDeltaM),这种缺陷病毒只能局限感染鼠神经瘤细胞.并且不能产生子代病毒。用RC-HLDeltaM鼻内吸入免疫可以获得和野生RC-HL免疫后相同的抗体滴度。Rupprecht等利用反向遗传技术构建了一株重组狂犬病病毒用作动物新型口服狂犬病疫苗.并检测该疫苗通过口服途径对狗进行免疫后的安全性、免疫原性和有效性.并和商品化的狂犬病病毒GP重组疫苗相

19、比.发现该重组狂犬病病毒疫苗在开发动物用疫苗的研究中作为口服免疫原具有良好的发展前景”气，2.3以麻疹曲毒为栽体的取配嘛毒的包装通过反向遗传学的手段，改造麻疹病毒作为载体.进行多种病毒的体外包装.作为新型疫苗的成分气以麻疹病毒的基因组为骨架.插入乙肝病毒的表面抗原基因.通过反向遗传的方法,包装HBV疫苗株.能够在小鼠体内诱导较强的免疫应答*2001年.Wang等首次将猴子体内的艾滋病毒抗原插入麻疹病毒载体中.而后分别用来自于猴子和人艾滋病毒的Gag,Pol,Env和Ncf蛋白的编码基因插入到麻疹病毒的载体中.此种疫苗抗艾滋病毒的作用在进一步的讨论中Despres等将Westnile病毒的糖蛋白

20、E插入麻疹病毒Schwarz株,将糖蛋白E以可溶性蛋白的形式进行表达.能够保护小鼠抗致死量病毒的攻击.维持小鼠存活8天至6个月气SARS冠状病毒的核衣壳蛋白和刺突S糖蛋白插入麻疹病毒载体.在小鼠体内诱导高水平抗NP和S蛋白抗体，能够中和冠状病毒和麻疹病毒，以麻疹病毒为载体表达的NP蛋白引起细胞免疫应答气2.4通过基因改造包装RNA病毒的减毒活疫苗反向遗传学通过减毒突变和基因重配的方法，推动了许多针对呼吸道病毒的减毒活疫苗的发展，此种减毒活疫苗较传统方法制备的减毒活疫苗，稳定性和安全性更好.能在体内产生保护性免疫应答反应。2.4.1呼吸道合胞病毒(RSV)减每活疫苗费考文献RupprechtCE

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26、降低的条件下产生cpRSV病毒，此种病毒既不是冷适应株也不是温度敏感株.其在儿童的上呼吸道仍然具有致病性。为了解决上述问题,采用反向遗传技术方法进行温度敏感株.冷适应株和减毒株的包装，同时进行来自不同谱系毒株进行突变组合后的重配病毒”.经突变后减毒的病毒对温度的改变敏感性升高.其在猿类上呼吸道的病毒复制较未减毒株降低10倍气RSV病毒根据抗原性的不同分为A和B亚组，Whitehead等将B1亚组的。和尸基因插入到A亚组的骨架上面.包装出的重配病毒在猿体内具有极高免疫原性和高度减毒的特点，能够对RSV的攻击产生保护也B亚组的糖蛋白插入RSV的。参考文献LinigerM.ZunigaA.Tamin

27、A.ctal.InductionofneutralizingantibodiesandcellularimmuneresponsesagainxtSARScoronavimsbyrecombinantmeaslesvirusesVicccincOOSd2164-2174.考文献WhiteheadSS.JuhaszK,FirestoneCY.eca!.Recombinantrespiratorysyncytialvirus(RSV)bearingasetofmuutionfromcold-passagedRSVisattenuatedinchimpanzees.JournalofVirology

28、.1998.72:4467-4471.。参考文献WhiteheadSS.BukreyevA,TengMN,etal.RecombinantrespiratorysyncytialvirusbearingadeletionofeithertheNS2orSHgeneisattenuatedinchimpanzees.JournalofVirology.!999.73:3438-3442.参考文献BuchholzUJ.GranzowH.SchuldtK.etai.Chimericbovinerespiratorysyncytialviruswithglycoproteingenesubstitut

29、ionsfromhumanrcspinorysyncytialvmis(HRSV):eflcctonhostrangeandevaluationasative-anenuatedHRSVvaccine.JournalofVirology.2000.74:1187.1199.9，专文献ChengX.ZhouH.TangRS.ctal.ChimericsubgroupArespiratovysyncytialviruswiththeglycoproteinssubstitutedbythoseofsubgroupBandRSVwithouttheM2-2gcnearcattenuatedinAfr

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31、candidatecontributetoitstemperaturesensitiveandattenuationphenotypes.JournalsofVirology.!998.72:1762-i768©参考文献dopoulosMH»SurmanS,TatemJM.ctal.Identificationofmutationscontributingtothetempcraturc-scnsitive.cold-adapted.andattenuationphenotypesofthelive-attenuatedcoldpassage45(cp45)humanpar

32、ainfluenzavirus3candidatevaccine.JournalofVirology.l999,73:1374-1381.实考文TaoT.SkiadopoulosMH.DurbinAP.etal.Aliveattenuatedchimericrecombinantparainfluenzavirus(PIV)encodingtheinternalproteinsofPIVtype3andthesurfaceglycoproteinsofPIVtypeIinducescompleteresi&uncctoPIVchallengeandpartialresisuncctoP

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35、imericbovinerespiratorysyncytialviruswithglycoproteingenesubstitutionsfromhumanrcspinorysyncytialvmis(HRSV):eflcctonhostrangeandevaluationasative-anenuatedHRSVvaccine.JournalofVirology.2000.74:1187.1199.9，专文献ChengX.ZhouH.TangRS.ctal.ChimericsubgroupArespiratovysyncytialviruswiththeglycoproteinssubst

36、itutedbythoseofsubgroupBandRSVwithouttheM2-2gcnearcattenuatedinAfricangreenmonkeys.Virology.2001.283:59-68.®。考文献DurbinAP.Hal)SL,SicwJW.ctal.Recoveryofinfectioushumanparainriuenzavirustype3fromeDNA.Virology,1997.235:323-332.。参考文献SkidopoulosMH.DurbinAP,TatemJM,ctal.Threeaminoacidsubstitutioninthe

37、Lproteinofthehumanparainfluenzavirustype3cp45liveattenuatedvaccinecandidatecontributetoitstemperaturesensitiveandattenuationphenotypes.JournalsofVirology.!998.72:1762-i768©参考文献dopoulosMH»SurmanS,TatemJM.ctal.Identificationofmutationscontributingtothetempcraturc-scnsitive.cold-adapted.andat

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39、eIinducescompleteresi&uncctoPIVchallengeandpartialresisuncctoPIV3challenge.Vaccine.1999,17:1100.1108.A亚型基因组中同时为了更进一步地减毒，M2-2基因被敲除.此种重配病毒能够对非洲绿猴产生对RSVB亚型的保护及高度减毒七2.4.2人副流感病毒（hPIV）减市活疫苗hPIV-1,2.3型病毒是引起婴幼儿病毒性呼吸系统疾病的病原之一.hPIV-3野生病毒通过逐渐降低温度获得减毒的hPIV-3候选疫苗hPIVcp45,和野生病毒对比有20个氨基酸的不同-吼通过反向遗传学方法证实疫苗具有的冷适

40、应.温度敏感性和减毒的特点是与多个突变有关。为了进一步将hPIVcp45减毒.skiadopoulos等利用反向遗传学技术将RSV病毒的心基因突变后插入hP!Vcp45骨架上，产生出对温度更加敏感和进一步减毒的疫苗Durbin等将MV的H基因与野生或减毒的hPIV-3连接.得到减毒hPIV-3同时表达MV的H蛋白的双价疫苗，既能够保护仓鼠对hPIV-3病毒的攻击也能产生高水平MV中和抗体气利用反向遗传学技术包装hPIV-3/hPIV-2,hPIV-3/hPIV-1嵌合病毒在仓氤体内具有减毒对抗同型野生病毒的攻击而匕2.4.3牛瘟病毒（RPV）减毒活疫苗通过反向遗传学技术,将绿色荧光蛋白或流感病

41、毒的HA基因作为分子标记包装出具有标记的RPV病毒，采用这种标记后的减毒病毒能够区分牛群体内的抗体来自于自然感染还是被动免疫气2.4.4新城疫病毒（NDV）减特活疫苗2005年，Chen等应用新城疫病毒为骨架的反向遗传学平台.得到表达H5N1HA蛋白的重组病毒.鸡的动物实验表明.减毒重组病毒在鸡体内产生很强的抗新城疫和H5的HI抗体水平.能够对同型别和不同型别的H5N1病毒攻击产生保护力吐2.5反向遗传学在流感疫苗中的应用2.5.1流感大流行前疫苗1997年香港地区H5N1禽流感病毒感染人的出现及其引起流感大流行的潜在风险.大流行前疫苗的研究和储备显得尤为重要。最初与对人具有致病H5N1病毒对

42、鸡胚具有致死性，不能在鸡胚上有效的繁殖，因此不能作为生产用的疫苗株。为了获得安全的疫苗株.基于质粒系统的反向遗传学方法得到了应用。反向遗传学包装的重配毒株能够排除从原始标本分离的野生毒株存在的潜在病毒污染的优点，能够去除禽流感病毒HA基因裂解位点的多个碱性氨基酸位点达到减毒的目的也通过与在鸡胚高产PR8毒株的内部基因节段进行6+2重配，得到减毒同时又适应鸡胚生长的高产疫苗株（示意图见下页）。现有季节性流感疫苗株的推荐时间需要三个月的时间.而反向遗传学技术能够在9天左右根据毒株的序列，体外拯救得到适宜的疫苗株。反向遗传学技术获得的疫苗候选株保持了与野生病毒一致的抗原性气为了保证反向遗传学技术得到

43、疫苗株用于人的安全性的保障.WHO制定了疫苗株安全性检测的方法确保重配疫苗株减毒。2.5.2流感病毒戚毒活疫苗A型和B型流感病毒减毒活疫苗通过逐步降低温度得到冷适应、温度敏感减毒的毒株.将减毒后的毒株与未减毒的野生毒株共同感染细胞得到内部基因来源于I技术进展I技术进展减毒株而表面蛋白来源于野生毒株的重配病毒c这种重配病毒发生突变的氨基酸数目是有限的,因此具有回复突变的风险。而反向遗传学技术能够将病毒蛋白中与减毒有关的氨基酸例如PB2或缺失NS1全部进行突变包装减毒株。流感病毒的NS1蛋白的功能能够抑制宿主I型干扰素介导的抗病毒反应.当病毒感染时，改造的NS1基因能够诱导感染部位I型干扰素免疫应

44、答.通过反向遗传利用改造后的NS基因制备减毒活疫苗.此种减毒活疫苗的安全性和疫苗的有效性已在多种动物模型上得到了证实.同时回复突变的可能性很小,但是其在人体的安全性和有效性需要进一步确定。Brownlee等将流感病毒RNA启动子区进行碱基的替换.通过12质粒系统包装出减毒株。此种方法通过在PA,NA和NS基因进行操作得到了证明。2.5.3藏流感标记疫黄标记疫苗是指能够用于区别自然感染和疫苗免疫的疫苗,疫苗本身携带用于诊断检测的标记物。Li等将GS/GD/1/96病毒的N4基因与鼠的乙肝病毒S2糖蛋白的5BI9表位相连，通过反向遗传技术包装H5N1/PR8-5B19重配病毒.接种两次H5N1/PR8-5B19的鸡群100%产生抗5B19多肽抗体和抗HA抗体，而接种或自然感染H5N1/PR8的鸡群血清对5B19多肽无反应。病毒攻击实验结果表明接种H5N1/P