番茄红素抗突变作用的实验研究

1、7890-=番茄红素抗突变作用的实验研究李欣,张静,杨颖,黄俊明熊习昆(广东省疾病预防控制中心毒理所，广东广州 510300)Study on the Role of Lycopene Anti-mutationLI Xin, ZHANG Jing, YANG Ying,HUANG Jun-ming, XIONG Xi-kun(Lab of Genetic Toxicology, Center of Disease Control and Prevention of Guangdong Province, Guangzhou 510300, Guangdong, China)【摘要】 背景与目

2、的： 研究番茄红素对突变剂诱导的遗传损伤的抑制作用。 材料与方法： 采用修改的小鼠骨髓细胞微核试验和Ames试验：按食品安全性毒理学评价程序和方法试验，计数微核数、回复突变菌落数，计算微核率，相对菌落数和抑制率。 结果：小鼠骨髓细胞微核试验中预先给予番茄红素的试验组与环磷酰胺阳性组比较微核率明显降低，差异有统计学意义（P0.01），番茄红素对环磷酰胺诱发小鼠胸骨骨髓微核的抑制率达到59以上。番茄红素预处理突变剂的Ames试验中TA98、TA100均有相对回变菌落数的减少，与致突变物对照组比较差异有统计学意义（P0.01），且呈明显的剂量-反应关系；番茄红素与突变剂同时加入的Ames试验中只有T

3、A98在140 g/皿剂量组有抑制作用。 结论： 番茄红素能有效抑制突变剂诱导的遗传损伤，具有一定的拮抗突变的作用。【关键词】 番茄红素； 微核； Ames试验中图分类号： Q343文献标识码： A文章编号： 1004616X(2006)04032704【ABSTRACT】 BACKGROUND AIM: To study the inhibition of lycopene on the genetic damage induced by mutagens MATERIAL AND METHODS： In accordance with the “Procedures and Methods

4、 for Toxicological Assessment on Food Safety”, and the modified micronucleus test and Ames test were used. The numbers of micronuclei and bacteria colonies were scored, then the micronucleus frequencies in polychromatic erythrocytes(fMPCE), relative bacteria colonies and the rates of inhibition were

5、 calculated. RESULTS: To compare with the positive control group treated with CP(Cyclophosphamide), the fMPCE in test groups pretreated with lycopene was significantly decreased(P0.01). The rate of inhibition of lycopene on fMPCE induced by CP was over 59. Compared with the positive group, the relat

6、ive bacteria colonies of TA98、TA100 were reduced in Ames test in which the mutagens were pretreated by lycopene, and there was adose-related were responses. But only the relative bacteria colonies of TA98 showed significant rise at 140 g/dish in Ames test in where the mutagens and lycopene were adde

7、d at the same time. CONCLUSION: Lycopene could effectively inhibit the genetic damage induced by mutagens, and to some degree it could play an anti-mutation role. 【KEY WORDS】 lycopene; micronucleus; Ames test流行病学研究已经证实大量摄食水果蔬菜可有效降低人类肿瘤的发病风险。对膳食中能够预防遗传损伤和抑制肿瘤毒性物质的成分的研究也成为近年的热点，番茄红素(Lycopene,LP)就是其中之一

8、，它是广泛存在于番茄及番茄制品、西瓜、胡萝卜、草莓等果实蔬菜中的天然色素，是一种重要的类胡萝卜素。研究发现人类前列腺癌发病率与血浆中番茄红素水平呈负相关1。通过饮食摄入番茄红素还对肺癌和胃癌具有明显的预防作用,宫颈癌、直肠癌、食管癌、口腔癌的发病率与番茄红素的摄入成反比2。而肿瘤形成的内在机制多为遗传物质的改变，我们就番茄红素在消除或预防外来化学物引起的遗传损伤方面的初步研究报告如下。1材料与方法1.1材料1.1.1样品来源及制备受试物系由广东某有限公司提供的番茄红素软胶囊，批号20020610，纯度为每100 g产品中含番茄红素2.8 g，其它成分主要为精制大豆油和防止番茄红素氧化的天然抗氧

9、化剂。小鼠骨髓细胞微核试验中以粟米油配制样品，Ames试验中以二甲基亚砜溶解样品。1.1.2实验动物选用广东省医学实验动物中心的普通级动物，合格证号00A025，NIH(National institutes of Health)种小鼠50只，体重1822 g，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。室温22 24 ；湿度5075。1.1.3菌株及S9的制备经组氨酸缺陷、脂多糖屏障缺陷、R因子、四环素抗性、uvrB修复缺陷及自发回变率鉴定合格的鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA98、TA100，于37 振荡培养10 h后，待用。用经多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆微粒体酶系(Co-factor suppleme

10、nted post-mitochondrial fraction, S9)并加相应的辅助因子(6磷酸葡萄糖、辅酶II)配制成体外代谢活化系统。1.2方法1.2.1小鼠骨髓细胞微核试验1.2.1.1剂量分组设阴性对照组、致突变物对照组和根据厂家提供的产品每日推荐量13.833 mg/kg得番茄红素日推荐量0.387 mg/kg，据此设低、中、高浓度番茄红素剂量组,阴性对照组采用粟米油；致突变物对照组采用50 mg/kg环磷酰胺(Cyclophosphamide,CP)；番茄红素低剂量组为1.16 mg/kg,相当于推荐日服量的3倍；中剂量组为3.87 mg/kg,相当于推荐日服量的10倍；高剂量

11、组为11.6 mg/kg,相当于推荐日服量的30倍。1.2.1.2实验方法采用修改的小鼠骨髓细胞微核试验：按食品安全性毒理学评价程序和方法试验3，实验组预先经口给予番茄红素连续30 d，每天一次，试验末期(最后两天)，实验组及致突变物对照组经口给予CP(50 mg/kg)两次(间隔24 h)，实验组给予CP 1 h后再给予番茄红素，第二次给予CP 6 h后，处死小鼠取胸骨骨髓材料制片、染色、镜检，每只动物观察1 000个嗜多染红细胞(Polychromatic erythrocytes, PCE)，记录含微核(Micronucleus, MN)的PCE数，计算微核率(Micronucleus

12、frequencies, MNF)。计算抑制率，抑制率计算方法如下：A()=100式中 A: 抑制率;C: 致突变物对照组微核率;D: 受试样品组微核率; E: 空白对照组微核率1.2.2鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)1.2.2.1剂量分组设联合染毒组即致突变物和不同剂量的番茄红素联合染毒、致突变物对照组、溶剂对照组。番茄红素的最高剂量为140 g，以下设4个剂量，每个剂量设3个平皿，均包括加S9和不加S9两种情况。致突变物的选择：TA98、TA100加S9选用2-氨基芴(2-Aminofluorene, 2-AF)，不加S9 TA98选用敌克松，TA100选用叠氮钠。1.2.2.

13、2改良的Ames试验方法(平板渗入法)受试样品预处理致突变物后的Ames试验：0.1 ml致突变物及0.1 ml番茄红素同时加入0.5 ml磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH 7.4)中，加或不加S9，于37 水浴，预培养20 min，再加入0.1 ml菌液，取少量该悬液做细菌存活试验，其余一同加入2 ml(45 水浴)顶层培养基，迅速倾入底层培养基，平放固化，37 培养48 h，计数菌落数。受试样品与致突变物同时作用的Ames试验：将0.1 ml同样体积的番茄红素、致突变物与菌液共同加入0.5 ml磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH 7.4)中，加或不加S9，于37 水浴，预培养20

14、 min，余步骤同上。1.2.2.3存活试验(即细菌活力鉴定)将细菌悬液用磷酸盐缓冲液稀释106倍，取0.1 ml稀释液加入2 ml(45 水浴)顶层培养基，倾入营养肉汤琼脂平板，平放固化，37 培养24 h，计数菌落数。计算相对菌落形成率A()、相对菌落数D及抑制率F()。A()=B/C，式中B为受试样品组菌落数(存活试验)，C溶剂对照组菌落数(存活试验)。D=E/A，式中E为各组实际菌落数(抗突变试验)。F()=(GH)/(GI)，G 致突变物对照组相对菌落数，H为受试样品组相对菌落数，I 为溶剂对照组实际菌落数。1.3统计学方法微核采用RC列联表的卡方检验后再进行卡方分割分析，按性别分别

15、进行；相对菌落数采用单因素方差分析，在SPSS 10.0统计软件包上进行分析。2结果2.1蕃茄红素对环磷酰胺诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成的影响致突变物对照组(CP)的微核率高于阴性对照组，差异有统计学意义(P0.01)，表明致突变物对照组成立。番茄红素各剂量组与致突变物对照(CP)组比较，无论雄鼠还是雌鼠微核率均降低，差异有统计学意义(P0.01)。结果见表1。2.2蕃茄红素对突变剂诱发鼠伤寒沙门氏菌回复突变菌落数的影响2.2.1受试样品预处理突变剂后的Ames试验番茄红素与致突变物(加或不加S9)作用20 min后再加菌株共同培养，对TA98、TA100均有相对回变菌落数的减少，与致突变

16、物对照组比较差异有统计学意义(P0.01)，且呈现随番茄红素剂量增加相对菌落数减少、抑制率增加的趋势。结果提示番茄红素可直接灭活致突变物，且对这3种致突变物，番茄红素均有灭活作用(表2)。2.2.2番茄红素与突变剂同时加入的Ames试验不同浓度的番茄红素与致突变物(加或不加S9)及菌株共同作用20 min后，仅在140 g/皿剂量组有抑制作用，且对叠氮钠而言无抑制作用。这说明在高浓度条件下，较高浓度番茄红素可以抑制致突变物对菌株的诱变作用(表3)。3讨论研究报道番茄红素具有抗氧化、抑制突变、降低核酸损伤、预防和抑制肿瘤等多种功能。由于番茄红素是饮食中的天然成分，安全可靠，目前已成为保健食品研究

17、的重点。研究中发现番茄红素在较低浓度(1.16 mg/kg)即可对环磷酰胺诱发的遗传损伤具有保护作用，预先给予番茄红素后环磷酰胺诱导的胸骨骨髓微核率显著降低(P0.01)，抑制率雌、雄两性分别达到59.92、73.91。Velmurugan等4在研究番茄红素对N甲基N硝基N亚硝基胍(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)诱导大鼠股骨微核试验中，虽然番茄红素在给予MNNG前5 d才开始给予番茄红素1.25 mg/kg，同样能观察到番茄红素使MNNG诱导微核率下降而且差异有统计学意义。Rauscher等5应用大剂量(180 mg/kg)一次给予番茄红素

18、和环磷酰胺(200 mg/kg)，同样发现番茄红素对环磷酰胺诱导的大鼠股骨微核有降低作用，即使一次给药抑制率都可达29.6。我们连续30 d给予番茄红素后，可使环磷酰胺诱导的小鼠微核率下降达60.3173.91，明显起到对遗传损伤的保护作用。Ames实验是常用的检测外源性化合物致突变作用的试验之一，它可以有效地从基因水平检测各种诱变效应。TA98可检测各种移码型诱变，而TA100可检测引起碱基置换的诱变。本试验采用敌克松、2-氨基芴(2-AF)、叠氮钠这三种已知的强诱变剂分别对TA98、TA100进行处理，并从两个方面探讨了番茄红素的抗诱变作用及其可能的抗诱变机制。结果显示，番茄红素直接灭活致

19、突变物的作用较强，有明显的剂量-反应关系，且在较低浓度时仍表现有抑制效应。当番茄红素与致突变物及菌株同时作用时，只有在高剂量才表现出对基因突变的抑制作用，且对叠氮钠诱导的突变无拮抗作用，提示番茄红素的抗突变能力与致突变物的种类或强度有关。本研究结果表明番茄红素对外来化学物造成的遗传损伤有保护预防作用，是一种十分有发展前途的保健食品成分。参考文献:1 Gann PH, Ma J, Giovannucci E, et al. Lower prostate cancer risk in men with elevated plasma lycopene levels: results of a prospective analysisJ.Cancer Res,1999,59():1 2251