变性高效液相色谱技术及其在植物检疫工作中的应用前景

1、变性高效液相色谱技术及其在植物检疫工作中的应用前景2011-2012学年第一学期课程名称：仪器分析变性高效液相色谱技术及其在植物检疫工作中的应用前景摘要：本文介绍了变性高效液相色谱(DHPLC)技术的基本原理及影响因素，并结合植物病原鉴定技术的特点，分析了DHPLC技术在植物检疫工作中的应用前景，证明了DHPLC技术将成为一种快速、准确、高效的新型植物病原检测技术。关键词： DHPLC 植物检疫 核酸分析技术DHPLC是变性高效液相色谱(denaturing higperformance liquid chromatography)的英文缩写，是近几年才逐渐发展成熟的核酸分析技术，目前在生命科

2、学领域中已得到广泛的应用。是一种基于异源双链分析(heteroduplex analysis)的基因突变、单核苷酸多态性(SNP)、DNA片段长度多态性的高精度、高通量的新型检测技术。植物检疫工作中，由于植物病原特殊的生物学特点，而具有原理、步骤程序各不相同、种类繁多的鉴定技术。大多数病原如病原细菌、病毒、类病毒在传统的目测法、培养基筛选、免疫电镜、血清学鉴定等步骤后，还需进行指示植物鉴别及致病力检测。其步骤繁杂，时间冗长甚至超出苗木存活容许的时间范畴等缺陷给检验检疫工作的顺利实施造成了一定的困难。变性高效液相色谱技术(DHPLC)的出现为解决以上问题提供了极大的可能，这种技术利用基因的物理化

3、学性质，将先进的高精度大型仪器分析技术与核酸提取、体外扩增等经典分子生物学技术相结合，实现了生物学、物理学、分析化学等多学科交汇互融，既发挥了化学仪器的高精密度的优势，又体现了物理学和生物技术的成果，是当今学科交叉领域又一杰出科研硕果，可为未来植物检疫技术发展提供了新的前进方向。一、 DHPLC的基本原理及影响因素1 长度多态性分析原理DNA分子带负电荷，通过一种充当桥梁作用的分子一使TEAA(三乙钱醋酸盐)的阳性按离子与DNA相互作用，与柱子固相填料表面分子结合，DNA分子本身得以吸附到柱子上。这样DNA分子结合的TEAA越多，与固相结合得越牢固。经基链与固相结合的强度会随着流动相中乙睛浓度

4、的增加而减，DNA片段越长，结合的TEAA越多，越不易被洗脱。因此DNA片段大小分析是长度依赖性分离，而非序列依赖性分离。变性温度是影响DNA片段分析的一个重要因素。而在不变性温度条件下，可分离长度不同的双链DNA分子。2 基因型多态性分析原理DHPLC的基本原理是异源双链分析(heteroduplex analysis)。异源双链(heteroduplex)指由不完全互补的两条DNA单链形成的双链DNA，同源双链(homoduplex)指由完全互补的两条DNA单链形成的双链DNA简略来说，异源双链和同源双链对介质有不同的亲和力，因此，它们从介质中被洗脱下来的条件有差别。如果PCR产物源自纯合

5、子或者发生了纯合突变的个体，那么只有在与另外一种纯合野生型序列的PCR产物混合，再变性复性，才能够形成上述杂合和纯合双链。杂合双链存在错配碱基，其变性温度低于纯合双链，当温度升高到一定程度，先于纯合双链在错配碱基周围解链变性，导致双链减少和单链增多。由于单链比双链所带的负电荷少，杂合双链比纯合双链更容易形成单链，其保留时间短于纯合双链，在图谱上先于未解链的纯合双链出现。随着变性温度升高，纯合双链也会部分变性，A=T含有2个氢键，C=G含有3个氢键，前者变性程度比后者低，因此先出现的峰为含有AT的双链，后出现的为含CG的双链。利用这种杂合和纯合双链在保留时间上的差异，可以快速分析单个核苷酸的突变

6、，从而进行基因型的判定。3 DHPLC的影响因素 （1）PCR产物的影响 PCR扩增为高通量基因型检测提供了标本源。DHPLC对PCR中的引物、试剂虽无特殊要求，而且也不必对PCR产物进行预处理，但是要尽量保证PCR扩增产物的忠实性，避免人为引入错配碱基。 （2） 洗脱温度 温度是影响DHPLC检测基因型成功与否的至关重要因素。如将检测温度提高2后，就可在RET基因中发现两个漏检的突变基因型。有些基因突变对温度不敏感，在较宽的温度范围内(悬殊8左右)都可对其进行有效筛检；但有的突变对温度要求严格一些，如BRCA1基因的56134C/T与 2640C/T，只有分别在59与57下，才能被检测到。

7、（3）固定相 目前，有几种不同的分离介质被用于突变分析中。如美国Transgenomic公司应用大小为2 m的无孔聚苯乙烯颗粒作为分离柱的材料，惠普公司则使用孔径为3.5 m的硅胶作为分离柱介质。这两种柱的分辨率似乎相似，但寿命却大不相同，前者通常可分析6000个左右的样品，而后者仅可分析10002000个样品。最近，瓦里安公司(WalnutCreek,CA)开发出多聚物包被的碱性化硅胶柱。也有尝试将无孔聚苯乙烯与有孔硅胶结合，制成单片集成毛细管柱，可使柱效提高40%。 （4） 流动相流动相中离子配对剂的TEAA浓度对DHPLC分析的温度有显著影响。如果TEAA的浓度从lommol/L升高至2

8、00mmol/L，那么对应的最佳检测温度就要提高4-4.5。流动相的pH值(6-9)对检测效果几乎没有任何影响，但pH值太高，将会使双链DNA完全变性，达不到检测目的；pH值太低，又会干扰DNA与TEAA的相互作用，影响检测 效果。 二、DHPLC在植物检疫工作中的应用前景 1 DHPLC在有害生物鉴定中的应用 （1） DHPLC在原核有害生物鉴定中的应用 植物检疫工作中，检疫性原核有害生物主要包括细菌、植原体、病毒、类病毒等。关于原核有害生物相关的DHPLC检测技术报道主要集中在医学领域。2004年Bode E等以保守基因ITS(16S23Sintergenic spacer region)

9、和功能基因gyrA为鉴定依据，在42种待测细菌中准确地检测出Bacillus cereus菌和Bacillus thuringiensis菌。Hurtle W等利用DHPLC对较广范围的细菌种类进行基因鉴定，几个属的39种细菌用来检验DHPLC的准确性和可靠性。大多数(36/39)种的细菌拥有可作为分子指纹图谱的特异表达曲线图，而且在70余种细菌样品中，Yersinia pestis(10/70)和Bacillus anthracis(12/74)样品都被准确地鉴定出来。实验结果表明，DHPLC的检测特异性为100 ，敏感度为97.7 ，predictive值为96.9，这些数据证明DHPLC

10、可以用于细菌鉴定。Domann E等进行了以16S rRNA基因的V6至V8区序列为靶序列，通过DHPLC区分致病菌多样性的研究。罗阳等对用变性高效液相色谱(DHPLC)技术筛查了SARS冠状病毒(SARS.CoV)S蛋白的受体的正常无关个体中氨基肽酶N编码基因ANPEP的全部外显子及其两侧部分内含子序列，发现SARS-CoV感染和SARS发病的易感基因或抗病基因 。 (2) DHPLC在真核有害生物鉴定中的应用 真核有害生物结构较原核生物更为复杂，基因组构成和基因功能分化更为精细，更多的致病基因和保守基因可作为生物基因型鉴定的依据，这些特点促成了DHPLC在真核生物的研究领域拥有更加宽广的用

11、武之地，并发挥了更为强大的功能。Kota等通过DHPLC进行了大麦(Hordeum vulgare L.)的基因结构及基因分型的研究工作。陈瑶生等用DHPLC对猪肌肉组织差异表达EST的进行鉴定。Wulfert M、蒋琼橙等认为人类线粒体DNA(mtDNA)的1602416365nt，73-340nt及438574nt 3个区域为多态性高发区，这3个区域的高度多态性使得个体间具有高度的差异性，因而可以用来作个人识别。他们通过DHPLC和PCR对人类线粒体的异质性进行技术检测。沈靖等采用DHPLC直接测序和PCRRFLP方法发现与初步证实了中国人的iNOs基因TsP多态性。以上例子有力地证明了D

12、HPLC在真核生物生命科学领域的实用性和通用性，昭示了这种检测技术在真核有害生物鉴定工作中的广泛应用前景。 检疫性植物病原以其危害性大、破坏力强、症状复杂多变而成为一类重要的检疫对象。植物病原生物在分类学中跨度很大，现发现有真菌、细菌、植原体、病毒、类病毒和线虫等。这些病原生物从致病性这一点讲是相同的，但致病机理及基因结构、调节、控制等特点却大相径庭。总体来说，植物病原不仅种类多，而且近似种多，表现为检疫性病原之间易混淆、检疫性与非检疫性病原之间难区分、同种病原在不同寄主上表现的症状不同、不同种病原在相同寄主上却可能表现相似的症状等具体形式。目前，DHPLC技术在医学、保健学、环保、生态学领域

13、已得到广泛的应用，检测范围几乎涵盖从原核生物到真核生物、从微生物到植物、动物、从低等生物到高等生物的各种生命形式。DHPLC是一套经过反复摸索、改进、总结所得到的较为成熟稳定、准确快速的基因型检测分类鉴定技术，是一种能够满足植物检疫-工作需要、解决上述难题的行之有效的新型检测方法。 2 DHPLC在杂交作物品系鉴定方面的应用 从标准的角度而言，我国现行的GB/T3543.3-1995农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定及其实施指南中列入的对杂交水稻品种的鉴定方法，应是当前世界上较全面的方法，而且也完全与国际接轨。同时，世界上近20多年来，对杂交水稻品种鉴定技术的研究，在理论方面、技术方面都取

14、得了很大的成就，特别是近年将DNA分子检测技术用于品种鉴定的研究取得了可喜的进展。DNA指纹图谱技术主要包括限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性(RAPD)、扩增酶切片段长度多态性(AFLP)、简单重复序列或微卫星重复序列(SSR)DNA指纹技术具有多态性丰富、灵敏度高、区分鉴别效果好等优点，但是，主要存在重演性差、技术难度大、成本高、费时等缺陷，目前用于品种真实性和纯度鉴定的方法还很不成熟。DHPLC的基本原理是异源双链分析，其技术特点正适用于杂交水稻的鉴定，纯和体基因组可作为(野生型)同源双链模板，而杂交体则视为突变型(异源双链)。利用异源双链和同源双链洗脱顺序、时间上的差异，

15、可准确地进行杂交水稻的鉴定。Kota等通过DHPLC成功地绘制了大麦(Hordettm vulgare L.)的SNP图谱，Rupe MA等利用nrp基因通过DHPLC对杂交玉米品系及基因表达等进行了研究。 3 DHPLC在转基因植物鉴定方面的应用 转基因技术是将外源基因转入生物体或细胞内使之表达的技术。在人们构建的外源转基因载体中，人们设计裟入了基因表达所需的启动子、终止子序列。为了方便转基因植物的筛选，人们还整合了报告基因和抗性基因。因此针对这个特点，当我们对转入的目的基因并不了解的情况下，通过检测这些基因序列就可对转基因作物进行鉴定。转基因作物DHPLC检测方法可以以目前通用的报告基因(

16、Gus和Gfp基因)、抗性基因(Kan和Lif抗性基因)、启动子(CaMV35S)和终止子(CaMV35S和Nos等)等具有代表性的特异片段为扩增靶序列(或杂交探针)，将从待检样品中提取的DNA，利用特异性引物扩增，与以上基因的标准品混合，利用变性高效液相色谱仪进行温度变性，复性形成异源双链或同源双链，并先后从色谱柱洗脱，收集信号形成不同吸收峰后再经计算机软件进行分析判断。目前利用常规PCR、核酸杂交、荧光PCR、基因芯片检测转基因生物的技术日臻成熟，但关于DHPLC检测转基凶成分国内外都尚无相关文献报道，可作为一个全新的研究方向去探索。 4 DHPLC与传统分子生物学方法 经典分子生物学方法

17、的引人，在缩短植物检疫鉴定工作的检测周期、提高检测灵敏度、提升检测效率的同时，极大地丰富了植物病原检测鉴定的技术手段，为实验室具体的检测T作提供了更为广阔的选择。但其自身的缺陷也逐渐暴露出来，常规PCR检测步骤简单，操作方便，假阳性结果m现频率过高的问题却无法避免。荧光PCR及基因芯片技术灵敏度高、结果可靠，但荧光定量PCR仪及基因芯片装置价值昂贵，大多数部门无力购置。Southern、Northern等由于杂交技术耗时长、步骤多，对于检测人员技术能力要求较高等缺点不适合在检验检疫部门推广应用。许多研究表明与传统分子生物学方法相比，DHPLC作为植物病原的新型检测鉴定技术在准确度和节约成本、高

18、通量、简捷快速等各个方面都具有天然的优势。施锦绣等比较DHPLC与直接测序法在单核苷酸多态性检测中的应用，发现在41个样本的SERT-E9A/G基因检测中，DHPLC的检出率达到了100。在大规模样本的杂合子筛检中，检测的错误率几乎为0。结论是DHPLC技术是一项可用于未知序列的检测、尤其是在人群中大规模筛查已知序列的有效手段。Arnold等在BRCA1基因中，DHPLC检出了所有直接测序找到的变异体，但DHPLC比直接测序的成本至少降低了10倍左右。与基于荧光PCR、DNA芯片的再测序相比，DHPLC不仅成本低，而且灵敏度与特异性也比较高。Kwok等认为，对于频率高于20 的变异，DHPLC

19、的检出率为100 ，而直接测序的检出率为80。Choy等通过比较构象敏感凝胶电泳(PCRCSGE)、PCRSSCA和DHPLC检测结节性硬化症基因 C2突变的能力，发现对于TSC2单核苷酸变异的检出率PCRCSGE和PCR-SSCA分别为69和54 ，而DHPLC为100，提示DHPLC优于CSGE和SSCA，特别是在检出单核苷酸变异方面。这些研究表明，DHPLC是检测基因组DNA更为敏感而且准确的手段。 DHPLC技术操作步骤简单，具有自动化程度高、检测快速、灵敏度高的特点，并可以对样品进行自动化回收。该技术允许在完全变性、部分变性或非变性条件下分析核苷酸片段，已被广泛用于核酸片段分离、突变

20、检测、基因型分析、PCR引物纯度分析和纯化、SNP分析等方法，单核苷酸突变检测准确率稳定在96以上。在最佳条件下，该技术甚至可以对有些杂和体的两个等位基因进行分离。又由于整个过程无需对DNA产物进行后期无害化处理，可以有效地解决溴化乙锭的环境污染问题。 由于工作和职责的特殊性质，检验检疫的工作对象包含了各类产品，涉及到农业工业等方方面面，实验仪器的配置、资料种类有较高较宽的要求。高效液相色谱仪作为分析化学常规仪器，被广泛使用于各地方局的常规检验工作中，具有良好的普及率。DHPLC利用交叉科学的优势，跨领域的发挥高精度化学分析仪器的潜能，挖掘高效液相色谱仪潜在价值，不仪节省了二次购买仪器的昂贵费

21、用，也无形提高了其自身价值。同时，植物病原新型尖端高效液相色谱检测技术(DHPLC)的研制与检验检疫系统一贯实施科技创新、保持与国际接轨战略相符，将有助于加速植物病原检疫技术的革新，确立我国在国际相关研究领域的领先和权威地位。 参考文献 ：1 白桦,邓大君,潘凯枫.变性高效液相色谱在分子生物学中的应用国外医学分子生物学分册2003，25(4)：303305 2 戈峰，现代生态学.北京：科学出版社2005，2127 3 苏智广，张思仲.变性高效液相色谱技术在单核苷酸多态性研究中的应用生命的化学2003，23(2)：155157 4 Hurtle W,Bode E.Kaplan R S.Use o

22、f Denaturing High-Performance Liquid Chromatography To Identify Bacillus anthracis by Analysis of the 16S一235 rRNA Interspacer Region and gyrA GeneJournal of CHnic Microbiology，2003，41(10):475-4766 5 Domann E，Hong G，Imimlioglu CCulture-independent identification of pathogenic bacteria and polymicrobial infections in the genitourinary tract of renal transplant recipientsJournal of Clinical Microbiology，2003，41(12)：3273-3283 6 罗阳，姜莉，敖雪SARS冠状病毒s蛋白候选细胞受体氨基肽酶N的基因变异研究遗传学报，2003，30(7) 7 Kota R，Wolf M，Michalek WAp