生物技术 实验指导

1、食品生物技术实验一：酸奶的酿制及感官分析实验酸奶是以牛乳为主要原料，接入一定量乳酸菌，经发酵后制成的一种具有较高营养价值和特殊风味的发酵乳制品饮料。通过乳酸菌发酵牛奶中的乳糖产生乳酸，当产酸到一定程度时，乳酸使牛奶中酪蛋白(约占全乳的29，占乳蛋白的85)变性凝固而使整个奶液呈凝乳状态。同时，通过发酵还可形成酸奶特有的香味和风味(与形成乙醛、丁二酮等有关)，并具有清新爽口的味觉。由于酸奶中含有乳酸菌的菌体及代谢产物，因而对肠道内的致病菌有一定的抑制作用；对人体的肠胃消化道疾病也有良好的治疗效果。酸奶不仅营养丰富、容易消化和吸收，适合于乳糖不耐症人群，是补钙的理想食品。一、实验目的1、了解酸奶的

2、制作原理和凝固型酸奶的制作工艺流程。2、掌握普通凝固型酸奶制作的操作要点。3、了解酸奶的感官指标二、材料及用具1、原料： 牛乳；白砂糖；发酵剂（市售直投式乳酸菌粉），2、主要仪器设备与用具酸奶瓶（每人1瓶），量筒，不锈钢勺，温度计，玻棒，灭菌锅，培养箱，冰箱，净化工作台，天平，pH试纸等。三、实验步骤1、工艺流程 鲜乳净化配料均质杀菌冷却（3745）接种发酵冷藏后熟成品 2、 操作要点（1）原料乳选择：选用鲜牛奶或者袋装纯牛奶。原料乳的质量要求： 生产酸乳的原料乳，要求酸度在18ºT以下，细菌总数不高于50万CFUmL-，总干物质含量不得低于11.5，其中非脂乳固体不低于 8.5%。

3、原料乳不得使用病畜乳和残留抗菌素、杀菌剂、防腐剂的牛乳。（2）配料：在消过毒的不锈钢锅中加入鲜牛乳，适量加入白砂糖4-8%，根据个人口感添加，不断搅拌。（3）均质：原料配合后进行均质处理。均质处理可使原料充分混匀，有利于提高酸乳的稳定性和稠度，并使酸乳质地细腻，口感良好。均质所采用的压力以20-25 MPa为好。（4）杀菌：采用9095，杀菌5分钟，对原料乳进行杀菌。或采用煮沸3分钟的方法杀菌。（5）冷却：将杀菌后的乳冷却至4648后，准备接种。（6）接种：接种量可根据菌种活力、发酵方法等的不同而定。每公斤牛奶加1袋1g的市售乳酸菌粉，然后搅拌均匀。迅速分装到酸奶瓶中，每瓶装满（95%），盖上

4、灭过菌的塑料盖。贴上标签。还可采用的接种方法：用洁净的灭菌勺，去掉市售原味酸乳表层的12cm后，按市售酸奶：原料乳为1：10的比例，接入已灭过菌且冷却至4648的热牛奶中，充分搅拌混匀。（7）发酵：将分装后的酸奶瓶，迅速置于4142恒温箱中培养，这是嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌最适生长温度的折中值。发酵时间一般在46h。达到凝固状态时，即可终止发酵。发酵终点一般可依据如下条件来判断：滴定酸度达到60-70ºT以上；pH值低于4.6;表面有少量水痕；倾斜酸奶瓶或杯，奶变粘稠。发酵过程中应注意：避免震动，否则会影响组织状态；发酵温度应恒定，避免忽高忽低；发酵室内温度上下均匀；掌握好发酵时间

5、，防止酸度不够或过度以及乳清析出。（8）冷藏后熟：发酵结束后，应立即移入05的冰箱中，终止发酵过程, 使酸乳的特征 ( 质地、口味、酸度等 ) 达到所设定的要求。另外，冷藏还具有促进香味物质产生 , 改善酸乳硬度的作用。一般将酸乳终止发酵后第12-24h小时称为后熟期，在此期间香味物质的产生会达到高峰期。05贮藏24h，即可得成品。（9）感官分析实验 品尝自己制作的酸奶，判断其感官品质是否达到要求，若达不到要求，分析其原因。酸奶质量的评定以品尝为标准，通常有色泽、凝块状态，表层光洁度、酸度及香味、无异味等各项指标。感官检验试验方法 色泽和组织状态：取适量试样于50mL烧杯中，在自然光下观察色泽

6、和组织状态。 滋味和气味：取适量试样于50mL烧杯中，先闻气味，然后用温开水漱口，再品尝样品的滋味。品尝时发现有异味则可判定污染了杂菌。3、酸奶的质量标准 （1）酸奶感官指标：色泽：色泽均匀一致，呈乳白色或稍带微黄色。滋味和气味：具有酸甜适中、可口的滋味和酸奶特有风味，无酒精发酵味、霉味和其它不良气味。组织状态：凝块均匀细腻，无气泡，允许有少量乳清析出。（2）酸奶理化指标：非脂乳固体含量8.5%脂肪含量3.2%蛋白质含量3.2%总糖（以蔗糖计）含量8.0%四、思考题1.酸奶制作原理？ 2.酸奶的营养与保健作用主要有哪些？食品生物技术实验二：江米甜酒的制作以糯米(或大米)经甜甜酒曲发酵制成的甜酒

7、酿，是我国的传统发酵食品。我国酿酒工业中的小曲酒和黄酒生产中的淋饭酒在某种程度上就是由甜酒酿发展而来的。一、实验目的 1、学习并掌握甜酒酿的酿制方法，了解酿酒的基本原理。2、进一步了解淀粉在糖化菌根霉、毛霉和酵母菌作用下制成甜酒酿的过程。二、 原理      甜酒酿是将糯米经过蒸煮糊化，接种后，在适宜的条件下（28-30），让种曲中的霉菌孢子萌发菌丝体，大量繁殖后通过甜酒曲（根霉、毛霉和酵母菌等微生物的混合糖化发酵剂）中的根霉和毛霉等微生物所产淀粉酶的作用将原料中糊化后的淀粉糖化，将蛋白质水解成氨基酸，然后甜酒曲中的酵母菌利用糖化产物生长繁殖，

8、并通过酵解途径将糖转化成酒精，从而赋予甜酒酿特有的香气、风味和丰富的营养。随着发酵时间延长，甜酒酿中的糖分逐渐转化成酒精，因而糖度下降酒度提高，故适时结束发酵是保持甜酒酿口味的关键。要初步学会和掌握酿制方法并不困难，从微生物学的观点来看，酿制的关键在于：要有优质的酒酿种曲，即种曲中应含有糖化率高的优质根霉、毛霉孢子或菌丝体；应选择优质的糯米作原料；严格无菌操作规程，尽量避免杂菌污染；合理控制酿制条件等。三、材料和器具 1.材料     糯米、甜酒曲 2.仪器和器具     恒温培养箱、电磁炉、不锈钢带篦蒸锅、装米酒

9、瓶子、不锈钢盆子、手提高压灭菌锅，烧杯。 四、 实验流程 洗米浸米蒸米摊凉淋水降温装瓶发酵甜酒酿品尝五、操作要点 1、浸米与洗米：选择优质新鲜糯米，淘洗干净后浸泡过夜，使米粒中的淀粉粒子吸水膨胀，便于蒸煮糊化，清水冲洗至水清亮，捞起沥干。 米粒能用手指碾碎为判断浸泡好的标准。2、蒸米：将糯米放在蒸锅内搁架的纱布上隔水蒸煮，时间20分钟左右，根据米量可适当延长时间，至米饭熟透为止。要求达到熟而不糊，外硬内软，内无夹心，疏松易散，透而不烂，均匀一致。3、淋水降温：用凉白开淋洗蒸熟的糯米饭，使其降温至35左右，同时使饭粒松散。4、接入种曲发酵：将冷却到35左右的米饭，按干糯米重量

10、换算接种量，每2.5kg的糯米加一袋8g的甜酒曲，将酒曲与米粒拌匀，迅速装入米酒瓶中，装入约3/5,在加入1/5的凉白开水，饭粒搭成中心下陷的喇叭形凹窝，以利于出汁，饭面均匀撒上少许曲粉，盖上灭过菌的瓶盖，然后置于30温箱保温培养30-48h即可食用。酿成的甜酒酿应是醪液清澈半透明而甜醇爽口。直观判断：当酒酿在瓶中浮起，可以转动，酒酿中心的洞内完全充满汁水即可。六 实验结果(1)发酵期间每天观察、记录发酵现象。(2)对产品进行感官评定，将各批发酵的甜酒酿品评结果记录于下表中。写出品尝体会。批 次品 评 项 目结论出汁（ml）口感酒度甜味异味pH1234七、注意事项1.米饭、不要太硬，利用中温发

11、酵，米饭太热或太凉，都会影响酒曲发酵的。2.凉至35度左右，加入少量凉开水搅拌，将饭粒松散开。特别注意，不能让饭粒沾油腻。否则米酒发酸，不能食用。 3、发酵时一定要密闭好。否则又酸又涩。发酵的温度不能过高也不能过低，三十摄氏度左右最好。八、思考题1、甜酒酿制作中有哪几类微生物参与发酵作用？各自起何种作用？2、成功制作甜酒酿的关键步骤是什么？发酵工程实验一：小型发酵罐的安装、拆卸和使用一实验目的认识和了解发酵系统基本组成，了解其结构与功能，进一步熟悉和掌握发酵发酵罐的基本结构和工作原理；掌握生物反应器安装和拆卸的操作规程。二、基本原理发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。生产上使用的发酵罐容积大，均用

12、钢板或不锈钢板制成；实验室使用的小型发酵罐，其容积可从约1L至数百升或稍大些。一般来说，10L以下是用耐压玻璃制作罐体，10L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需要的培养条件，是微生物学、发酵工程、医药工业等科学研究所必需的设备。各厂家生产的发酵罐有所差别，但基本原理是相同。现以镇江东方生物工程设备技术有限责任公司10L罐为例，说明发酵系统的基本组成和发酵罐的主要结构及工作原理。三、试验用小型发酵系统的基本组成发酵系统通常由罐体、搅拌系统、空气供给系统、温度控制系统、pH控制系统、过程变量的测量和灭菌系统组成。罐体为一不锈钢圆筒，底端用不锈钢板与圆

13、筒罐身焊接而成，顶端用不锈钢板及橡胶垫圈密封构成。容积为10 L，顶盖上有几个孔口(如下图)，分别是加料及接种口、补料口、放置DO(溶解氧)电极口、放置pH电极口、放置搅拌器口等。搅拌系统为平叶型涡轮式双搅拌，由位于灌顶的电机驱动，为增加溶氧传质效率，还增设有一定数目的挡板。空气供给系统由小型空压机提供高压空气，并由空气过滤系统进行过滤后，无菌空气管从罐顶延伸至罐底后经由空气分布器后进入培养基中。温度控制系统，由罐体夹套、加热器及温度测量系统组成。pH控制系统，由pH测量系统和酸碱流加系统组成。过程变量的测量，主要包括温度、溶解氧、pH等的跟踪测量。灭菌系统组成，由电蒸汽发生器产生蒸汽提供给整

14、个发酵系统进行灭菌。此外，通常还要设置报警灯系统 当发酵过程中，电路上发生故障，或超出测量系统测设定的参数值，甚至测定值范围时，则出现报警信号。另外，小型或大型自动发酵罐通常还应该是自动和手动可相互切换的系统。10L通用式发酵罐各部分管道示意图四实验步骤首先拧下螺栓，打开上盖，检查培养罐内部是否清洗干净。插入校正完毕的pH电极和氧电极于罐侧面相关位置，并与放大器连接。加入配置好的培养液，加盖（由于盖上的零件较多，必须对准位置后再盖上去），并对称地拧紧螺母，直至上盖被密封固定。将事先清洗干净并开启的尾气过滤器装于盖上，安装安全阀、泡沫传感器、观察灯、压力计、取样管，以及灭过菌的无菌空气过滤器进气

15、管等，剩余的孔洞须用硅胶塞和瞎塞拧紧备用。使用完毕后拆卸时与以上步骤相反，并彻底清洗罐体及零件。五思考题为什么要进行生物反应器安装和拆卸，这两个操作步骤是在生物反应的什么时间进行的？发酵工程实验二：发酵罐中培养基的灭菌及接种培养一实验目的学习和掌握发酵罐中培养基灭菌与接种培养的操作，认识和掌握运用现代化反应器的操作规程及方法。二基本原理不管在实验室中或生产实际过程中，发酵罐在使用后都必须进行全面清洗和灭菌，尤其是在前后两次培养不同的菌种时，为防止不同菌种之间交叉污染，清洗和灭菌工作就显得格外必要。发酵罐的清洗包括罐内任何可清洗的部分，如喷嘴角内部、取样管内以及罐顶等易忽视的部分，一旦清洗不干净

16、就会成为杂菌滋生地，引起污染。罐体清洗主要是除去附着在内壁和罐底的沉积物，一般是用清水浸泡、搅拌、冲刷，必要时还需人工铲除；其他管道清洗只需通水冲净即可，最好通沸水以提高洗涤效率。通常发酵罐在实验之前，必须先对发酵罐进行空消和实消。一般实验室用小型发酵罐分为在位灭菌和离位灭菌两种形式，离位灭菌是将发酵罐置于高压锅中灭菌，而在位灭菌是采用夹套层冷却蒸汽加热灭菌的方式进行的，可将反应器内培养液的温度升至121，以达到灭菌的效果，灭菌后的培养基冷却至培养温度后，即可接种培养。接种时，严格按照无菌操作进行，避免杂菌污染。三材料及仪器1材料菌种：黑曲霉培养基：5%葡萄糖，1%酵母汁，0.5%蛋白胨，pH

17、5.5。2仪器与设备镇江东方GBJL系列机械搅拌玻璃发酵罐、反应器控制台、三角瓶、胶管、接种针、火柴。四实验步骤(一)发酵罐的清洗打开罐底排污阀，用冷水冲洗罐壁，如罐内壁有难清除的沉积物，操作时还须人工铲除，否则易包藏杂菌成为污染源。同时与罐体相连的取样管道、进料管道、排污管道及有关阀门都要通水反复冲洗干净，洗完后盖上孔盖。(二)空气管路空消1关闭空气减压阀后的球阀，徐徐打开过滤器下方蒸汽阀。2调整蒸汽阀门和排气阀，压力控制在0.120.15MPa。3微微开启过滤器下排气阀和空气管路下阀门，排除冷凝水、冷空气。4保持蒸汽压012015MPa 30min。由远至近关闭排气阀、蒸汽阀，打开空气阀(

18、吹干管路，20min)，保证压力不能为0。(三)发酵罐空消操作1排除罐内水分。2适度打开罐顶各排气阀，如接种口、排气口、补料口阀门，以便排出空气。同时开三路进气(罐底、风管、取样管)。3开始时，蒸汽以下进上出为主，蒸汽由罐底和风管进入，由罐顶所有排气阀排出冷空气。4当罐压上升至01012MPa时，保持灭菌20min；5保压时间到，关闭蒸汽阀门，打开空气阀门，排气到罐压为0。空消允许蒸汽直接进入发酵罐内，但同时必须注意要将夹套接通大气，防止高温产生的高压将夹套压破。(四)发酵罐的实消操作1进料空消完毕后，开始进料，进料约23体积时开始搅拌。由于加热时物料糊化膨胀，所以先不定容，当温度达到70时，

19、定容。2液化从发酵罐底部直接进蒸汽加热至75左右，关蒸汽，从进风管通入少量空气翻腾1015min，关闭进气。3实消盖好盖子进行实消，先将蒸汽管道内的残存水放完，然后通三路蒸汽，一路罐底，一路进内管，一路取样管，同时打开罐顶所有排气阀门，让蒸汽排出，先大后小，待空气排出后关闭各排气阀，保持罐压为010.12MPa，灭菌20rnin。保压时间到，关蒸汽，开冷却水对发酵罐进行降温，待温度冷却至35左右接种。(五)培养条件的确定通入反应器的空气是从空压机经空气过滤器而成无菌空气，再由空气分布管送入灭过菌的培养罐内。在控制台上，设定所需的搅拌转速、发酵温度、pH值，并将空气流量计的流量调至确定值。（六）

20、接种与培养 将事先培养好的培养液（在三角瓶中进行摇床培养，处于对数生长期的细胞，以无菌操作方式倒入已灭过菌的带有插在保险管套筒内的注射针及软管的三角瓶内）由接种口接入罐内，接种时，要在接种口的隔膜周围放上浸有酒精的棉花或用13ml乙醇覆盖，点燃，以产生上升的气流来防止杂菌污染。接种塞从无菌筒内取出，然后将接种针穿过火焰和隔膜，慢慢插入中心部位，拧紧连接螺帽，直至插入部分固定。接种量大体上是培养液的百分之几。如调节pH值和泡沫时，可将酸液和碱液及消泡剂装入三角瓶，灭菌后，分别经蠕动泵与反应器连接，与罐体连接的方法与接种相同。这样，通过控制台的自动控制，就可以自动地连接流加，使罐内保持所需pH值和

21、泡层状态。（七）取样为了了解培养过程中反应物的变化情况，必须定时地进行取样，取样时，要关闭排气口，使罐内处于正压状态，打开取样口，培养液即可自动流出。但是，在第二次取样时，必须注意将残液放净后再取样。五思考题1. 本实验是采用何种方式灭菌的？你所了解的反应器灭菌方式有哪几种？2. 如何保证接种过程中不使反应器内部发生杂菌污染？附：发酵罐使用说明书中关于空罐灭菌、实罐灭菌、灭菌注意事项、发酵罐的清洗及保养方法的介绍。 5.1灭菌准备工作* 将排水硅胶管安装在排水口上。* 开启排水阀，放尽夹套内的冷凝水。* 断开尾气冷凝器进、出水管。* 安装好已经校正的pH、DO电极，并且用牛皮纸包好电极接口。*

22、 断开泡位、液位电极。* 拆卸搅拌电机，安装好轴承保护板。* 安装好灭菌罩，开启灭菌罩排气阀* 开启蒸汽发生器准备提供蒸汽。提示；蒸汽发生器所提供的蒸汽压力0.25Mpa。所有的电极的插头严禁与水或其它污染物接触，防止因此造成的电路故障。 5.2空罐灭菌按照5.1做好准备工作第一步安装好pH、DO电极、补液口硅胶堵头。第二步将轴承保护板安装好、将进气口、取样口、补液口各硅胶管并且用T型夹夹紧，断开尾气冷凝器进出水管。第三步安装好灭菌罩，拧紧固定螺母，开启夹套排水阀。第四步开启触摸屏，在灭菌界面设置灭菌温度105-130与灭菌时间，将搅拌转速设置为0rpm，将搅拌转速停转温度0。第五步提供蒸汽源

23、，开启夹套排水阀，开启夹套进蒸汽阀，让蒸汽不断进入夹套内，当夹套冷凝水排完之后，逐渐关小夹套排水阀，使温度继续上升，直到上升所需要的温度注意温度与压力的对应。当温度达到设置的灭菌温度时，灭菌计时开始这时应不断调整夹套排水阀与灭菌罩上的排汽阀，使的灭菌温度稳定在设置参数。操作时应密切注意灭菌罩上的压力表指示和界面上的温度指示。保证压力 0.2Mpa，温度 130。第六部当设置的灭菌时间到时，控制仪表会报警，此时关闭夹套进蒸汽阀，缓慢开启夹套排水阀与灭菌罩上的排汽阀，使罐内压力逐渐释放。第七步当罐内压力降至0Mpa时，将灭菌罩上开启排水阀，排放灭菌罩内的蒸汽冷凝水。第八步取下灭菌罩，空罐灭菌完毕。

24、小心蒸汽灼伤 5.3实罐灭菌空罐灭菌完毕之后，应尽快进行实罐灭菌。按5.1做好准备工作。第一步安装好pH、DO电极，并且安装电极保护套或用牛皮纸包扎以防止灭菌时电极接口被蒸汽潮湿而损害。第二步按工艺要求在罐内放入发酵培养基第三步将轴承保护板安装好、将进气口、取样口、补液口各硅胶管并且用T型夹夹紧，断开尾气冷凝器进出水管。第四步安装好灭菌罩，拧紧固定螺母，开启夹套排水阀。第五步开启触摸屏，在灭菌界面设置灭菌温度105-130与灭菌时间，将搅拌转速设置为0rpm，将搅拌转速停转温度0。第六步提供蒸汽源，开启夹套排水阀，开启夹套进蒸汽阀，让蒸汽不断进入夹套内，当夹套冷凝水排完之后，逐渐关小夹套排水阀

25、，使温度继续上升，直到上升所需要的温度注意温度与压力的对应。当温度达到设置的灭菌温度时，灭菌计时开始这时应不断调整夹套排水阀与灭菌罩上的排汽阀，使的灭菌温度稳定在设置参数。操作时应密切注意灭菌罩上的压力表指示和界面上的温度指示。保证压力 0.2Mpa，温度 130。第七步当设置的灭菌时间到时，控制仪表会报警，此时关闭夹套进蒸汽阀，缓慢开启夹套排水阀与灭菌罩上的排汽阀，使罐内压力逐渐释放。第八步当罐内压力降至0Mpa时，将灭菌罩上开启排水阀，排放灭菌罩内的蒸汽冷凝水。取下灭菌罩。第九步连接好进气管，开启空气流量计，罐内进空气。连接pH、DO电极线，安装好搅拌电机。准备进入发酵程序。5.4灭菌过程

26、注意事项 *发酵罐灭菌应在完成试车，保压密封试验后进行。保压密封试验；使罐内增压到0.08Mpa，闭罐后1小时内泄压0.01Mpa,12小时内0.02Mpa，24小时内泄压0.03Mpa。 *灭菌时注意各阀门的状态。 *灭菌过程中要时刻观察灭菌罩上的压力表，通过控制进蒸汽阀与排汽阀、排水阀的调整控制罐内压力，严禁超压。 *空罐与实罐灭菌要保证玻璃罐尾气过滤器及排气通道不能堵塞，否则罐内压力升高，易产生危险。 *在灭菌过程中，灭菌罩、夹套、管路、阀门等温度较高，要防止灼伤，应有安全措施，如：警示牌、防护手套等。 *灭菌之后要及时检查各接口，紧固螺母，对已经松动的部分重新紧固，以防止泄漏。6，发酵

27、与培养 6.1发酵运行准备工作第一步连接水源、空气源、蒸汽源。第二步调整水源压力0.3Mpa，空气压力0.2Mpa，蒸汽压力0.3Mpa.第三步准备好标准溶液pH值4.00、6.86、9.18，DO：无水亚硫酸钠第四步正确安装pH、DO电极线的连接。第五步各种补液瓶，插针、硅胶管应在高压灭菌锅灭菌第六步安装好搅拌电机、各种补液瓶、硅胶管等。第七步接通电源、空气压缩机、蒸汽发生器、控制电箱。 6.2控制参数设置与运行*按发酵工艺要求设置搅拌转速、温度、pH、DO 参数、泡位、液位、进气量以及相应的报警上下限参数方法见软件程序说明。灭菌完毕后，由于开始时搅拌轴、进行密封及顶盖的温度较高，水汽不易凝

28、聚到机械密封系统，高速搅拌会造成机械密封尖叫，导致降低机械密封的试验寿命，为此要求在一小时内先进行低速运行100rpm，等顶盖温度降至常温时再设置到发酵工艺要求的转速。*投入运行，观察各控制参数显示情况是否正常。*按照工艺要求调整罐压与进气流量。提示；在罐内温度、转速、进气流量等参数达到发酵工艺所需数值，在接种前，必须对pH电极进行在线修正零位，对DO电极修正斜率。6.3接种培养*测量参数显示正常稳定时，调整罐压与进气流量。*准备好合格的菌种*火焰接种环放入无水酒精，点燃后放于接种口。*打开接种盖，将菌种瓶口放在火焰上烧一下，并在火焰上拔下瓶塞将菌种滴入发酵罐中。*将接种盖放在火焰烧一下，拧紧

29、接种盖。*按照工艺要求恢复罐压、进气流量。提示：在进行接种时，请佩戴手套，防止灼伤。6.4取样与放料*取样方法；将尾气硅胶管用T型夹夹紧，火焰保护下，在取样口取样，利用罐内压力取样。*放料方法；停止发酵，开启放料阀即可。7，发酵罐的清洁与保养方法7.1清洗工作提示；培养结束和再次使用前都必须清洗罐体及相关部件，清洗时应注意电器元件、电极接口不能进水、受潮，清洗前取出pH、DO电极按其要求保养。见电极保养方法。 清洗罐内可配合进水、进气、搅拌、加热一起进行，如多次换水还不能清洗洁净，需要开启顶盖用软毛清洗罐内部件。*关闭控制开关与电源开关，取出电机、电极及连接线插头，断开各硅胶管、尾气冷凝器接头

30、。*拧开顶盖螺母，小心垂直向上取出顶盖与搅拌轴横置于平整桌面上，清洗罐内部件。*清洗后安装要注意罐内密封圈、硅胶垫就位情况。*拧紧顶盖四个螺母。提示；用力要平衡均匀并注意罐与罐座间隙均衡，螺母不要拧得过紧，以免损害玻璃罐体。发酵工程实验三：固定化酵母细胞发酵生产酒精一、实验目的要求1、掌握微生物细胞固定化的原理和基本技术2、学习酵母乙醇发酵过程二、实验原理（一）固定化细胞（immobilized cell ）固定化细胞技术是指用物理或化学的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，并使其保持催化活性、反复使用的方法。近十余年来生物工程研究的重点领域之一；固定化细胞与固定化酶技术一起组成了现代的固定化

31、生物催化剂技术。优 点：细胞密度高、反应速度快、耐毒害能力强、产物分离容易、可反复使用、能实现连续操作，可大大提高生产能力。应 用：已涉及到食品、化学、医药、化学分析、环境保护、能源开发等领域。用于生产各种胞外产物，包括酒精酒类、氨基酸、有机酸、酶、辅酶、抗生素、甾体转化、废水处理；用于制造微生物传感器（二）制备方法：吸附法； 包埋法；共价结合法；交联法 ；1、吸附法：又叫载体结合法，依据带电的微生物细胞和载体之间的静电、表面张力和黏附力的作用，使细胞固定在载体表面和内部；简便，活力损失小；但细胞与载体作用力小，易脱落2、包埋法：分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。凝胶包埋法是将细胞包埋在各种凝胶内

32、部的微孔中而使细胞固定；半透膜包埋法是将细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内。简单，条件温和，稳定性好，包埋细胞容量高。3、共价结合法： 细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而形成为固定化细胞。细胞与载体结合紧密，不易脱落；但制备较难，且活力损失较大。 4、交联法： 利用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团（如氨基酸、羟基、咪唑基等）发生反应，使其彼此交联形成网状结构的固定化细胞，其结合力是共价键。此法制备麻烦，活力损失较大；但细胞与载体结合较紧。（三）载 体多糖类：纤维素、琼脂、葡萄糖凝胶、藻酸钙、K-角叉胶、DEAE-纤维素等蛋白质： 骨胶原、明

33、胶等无机载体：氧化铝、活性炭、陶瓷、磁铁、二氧化硅、高岭土、磷酸钙凝胶等合成载体： 聚丙稀酰胺、聚苯乙烯、酚醛树脂等海藻酸盐是一种广泛应用的固定化介质，具有化学稳定性好、无毒、包埋效率高且价格低廉等优点。但是海藻酸钙包埋细胞时，凝胶颗粒易发生破损、软化等问题，凝胶颗粒的稳定性和机械强度较差，不利于固定化细胞的多次利用。 三、实 验 步 骤第一阶段 酵母菌培养1、培养基配制及分装 豆芽汁蔗糖培养基：黄豆芽 100g （煮开10min后过滤取汁），蔗糖（或葡萄糖）50g，水1000ml，pH自然； 或 YPD培养基：酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、H2O 1000ml；pH5.5分装：配

34、制500ml，分装4个500ml三角瓶，每瓶100ml；0.08Mpa, 灭菌20min 2、接种及培养 ：菌种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)； 接种量：5%摇瓶培养条件：200rpm, 28, 48h第二阶段：细胞固定化3、发酵液3000rpm离心10min；菌体沉淀用灭菌水洗一次。 4、将菌体沉淀悬于15ml无菌水制成浓悬液。 5、向菌悬液中加入5ml 6%海藻酸钠溶液，充分混匀。吸入灭菌针筒内，插上5#8#针头。 6、将针头通过棉塞插入装有50ml灭菌的0.05mol/L CaCl2溶液的小三角瓶内；一手均速摇动三角瓶，另一手轻推注射器，令液滴匀速滴入Ca

35、Cl2溶液中。（如图1） 7、滴完后将三角瓶移入22水浴，放置1h。8、倾去溶液，加入100ml无菌去离子水，洗一次。 图1 图29、重新加入50ml 0.05 mol/L CaCl2溶液，4平衡过夜。第三阶段：固定化酵母的乙醇发酵 10、发酵培养基配制及分装 配方：白糖（蔗糖）80g、(NH4)2SO4 2.0g、KH2PO4 1.0g、H2O 1000ml；pH自然分装：每组一瓶（250ml注射液用瓶），装200ml，棉塞或8层纱布；0.08Mpa，25min11、将4平衡过夜的固定化细胞悬液的CaCl2溶液倾去，倒入部分发酵培养基，摇起后再倒回发酵瓶；塞上灭菌的橡皮塞；将头皮针针头插入橡

36、皮塞，另端浸在装有灭菌水的三角瓶中（如上图2）。 12、28静止培养48h。 13、酒精生成的检验 1）打开发酵瓶塞子，嗅闻有无酒精味 2）取发酵液5ml加入试管，加10% H2SO4溶液2ml；向试管中滴入1% K2Cr2O7 溶液1020滴；如管内由橙黄色变为黄绿色，证明有酒精生成 。2K2Cr2O7 + 8H2SO4 + 3CH3CH2OH 3CH3COOH + 2K2SO4 + 2Cr2(SO4)3 (黄绿色) + 11H2O 四、实验结果酵母摇瓶培养生长情况；生长量固定化细胞制备过程中观察到的现象酒精发酵过程中观察到的现象发酵液酒精检测结果五、思考题：1、本实验的第一阶段和第三阶段都进行了液体培养过程，两阶段有何不同？为什么？ 2、细胞固定化有何意义？如何制备固定化细胞？酿造酒工艺学实验二：白兰地蒸馏实验白兰地是一种蒸馏酒，它是以水果为原料，经过发酵、蒸馏、贮藏、陈酿而成的。按国际惯例，白兰地就是指葡萄白兰地，而以其他水果为原料酿成的白兰地，在白兰地之前应冠以原料名称。法国是世界第一位生产白兰地的国家，其次为意大利，西班牙，美国和希腊等地区。将葡萄采收、榨汁、发酵制成葡萄酒外，白兰地还须要经过下列的程序，如蒸馏、储存、调配、经发酵完成的葡萄原酒，需尽快进行蒸馏