植物生理学中各项生理指标的测定方法

1、植物生理学中各项生理指标的测定方法.实验内容实验1MDA（丙二醛）含量测定所需试剂：10%三氯乙酸（TCA（纯）0.25%硫代巴妥酸（纯）实验2：可溶性蛋白含量测定所需试剂：考马斯亮蓝G-25095%乙醇85%磷酸实验3:SOD®氧化物歧化酶）酶活性测定所需试剂：dl-甲硫氨酸（Met）NBTEDTA-Na2核实验4:CAT过氧化氢酶）活性（过氧化氢酶）测定所需试剂：PBS（PH=7.0）30%H2O2实验五：Apx（抗坏血酸过氧化物酶）活性（即ASA-POD舌性）测定所需试剂：ASA（分子量167.12）（乙=胺四乙酸二钠）EDTANa2PBS（pH7.0）30%H2O实验6:AS

2、A（维生素C）含量测定偏磷酸95%乙醇磷酸4%2,2-二联吡啶FeCI3（或FeCI3?6H2O实验7:GSH?胱甘肽,媚力肽GSHGS灌由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物）含量测定所需试剂：NaH2PO42H2ODTNB二硫代硝基苯甲酸）PBS（PH6.8）实验8：脯氨酸测定所需试剂：磺基水杨酸甲苯茚三酮冰乙酸85%磷酸试验9：叶绿素含量测定。80%丙酮试验9:GF活性测定试验10：过氧化氢含量测定。三氯乙酸试验11：超氧阴离子含量测定二酶液和母液提取1 .酶液提取所需试剂：50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）（内含1%（m/v）聚乙烯吡哆烷酮PVP），O.lmmol/LE

3、DTAN戴EDTA也可为（内含2%（m/v）PVP,0.2mmol/LEDTANa或EDTA（先配制后用缓冲液定容）2 .ASA.GSH母液提取所需试剂：5%偏磷酸1抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CA：T1g（根据样品的量，少的可以适当减少）叶片加入预冷5mL50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）C冷冻15000g离心20分钟上清液即为酶液（5c下保存一两天内备用，中短期用-20C保存）2.ASA.GSH母液提取：0.1g叶片加入3ml预冷5%偏磷酸溶液4c冷冻14000g离心10分钟上清液即为母液（5°C下保存备用）（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护AS酶液提取所需试剂：PVP

4、（聚乙烯叱哆烷酮）：1%（1g溶于100ml水），1000ml需称取10g,此处用PBSEDTA-Na:0.1mmol/L（37.2mgEDTA-Na容于1000ml蒸馏水），此处用PBSPBS（缓冲液）配制方法：NaHPO412H2C©NaHPO4?2H2O取71.64g，蒸馏水定容至1L,取31.21g定容至1L,放置4C冰箱备用PH=7.8取91.5ml+8.5ml=100ml（浓度0.2mol/L）需要0.05mol/Lf将上述溶液烯释至400ml（0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V）母液提取所需试剂：5%偏磷酸：称5g纯偏磷酸，定容至100ml蒸馏水（需加热溶

5、解，温度在50-60c）偏磷酸有剧毒（偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）（现所用为38%HPQf以需称65.7895g,定容至500ml）三实验步骤实验1:MD给量测定1.1 所需试剂：10%三氯乙酸（TCA（纯）称10g定容至100ml0.25%硫代巴妥酸（纯）称0.25g用10%TC能容至100ml（配制时，可一次完成，先配TC必要定容，再加入硫代巴比妥酸，然后定容，若难溶解，可以在磁力搅拌器上微热）1.2 步骤：取0.3g叶片，加4ml磷酸缓冲液研磨，加入4ml0.25%的硫代巴比妥酸（溶于10%的三氯乙酸）溶液J摇匀95°C加热15分钟J快

6、速冷却3000g离心15分钟取上清测定OD532，OD600，OD450值按公式求MDA浓度=6.45X（OD2-OD。）-0.56OD45（Pmol/L）可溶性糖浓度=11.71X。由（mmol/L）最后计算MDA含量（Pmol/gFW）=4X（MDA浓度x）X103/0.1同时，可测得可溶性糖含量（mmol/gFW）=4X（可溶性糖浓度x）X10-3/0.1（用多波长测定，在测定之前一定要矫正基线，公式中的参数可以直接在分光光度计上输入）注意：以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零MD给量测定的改进1 .可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定MD给量，用量可以定为1.0、1.5或2.0（较好

7、）ml。2 .硫代巴妥酸溶液改为0.5%的硫代巴比妥酸（溶于20%的三氯乙酸）溶液。实验2:可溶性蛋白含量（参照Bradford方法测定），以BSA作为标准蛋白（牛血清蛋白）2.1 所需试剂及配制：牛血清蛋白（BSA考马斯亮蓝G-250,95%噌享，85嫡酸考马斯亮蓝G-250蛋白染色剂的配制：称取100m烤马斯亮蓝G-250,溶于50ml95%L醇，加入100ml85%的磷酸，最后蒸偏水定容到1L,混匀，放置过夜，过滤后贮放在棕色瓶中，常温下可放置一个月。?标准曲线制作： 标准溶液配制：称取10mg牛血清蛋白标准液，溶于蒸储水，定容至100ml,制成100Pg/ml的标准液，4°C

8、下保存备用。（必须是牛血清蛋白向水中溶解，不能颠倒） 取6支具塞试管（10ml）,按下表配制含0-100Pg/ml的牛血清蛋白液各1ml（调零管）123456蛋白标准 液（ml）00.20.40.60.81.0蒸储水（ml）1.00.80.60.40.2020406080100（g）各试管加入5mlG-250染色剂，翻转混合，放置2分钟595nm比色，绘制过原点标准曲线（方程式）。（相关系数要两个9以上）2.2步骤： 标准曲线（参考邹琦）（595nm比色）注意：制作通过原点的标准曲线，以含0Pg蛋白质液调零 取0.1g样品，力口5ml蒸偏水提取，5000g离心10分钟，取上清1ml测定1ml样

9、液+5mlG-250液盖塞翻转混合数次，最后595nm比色，直接从标准曲线读含量。（此方法反应十分迅速，2分钟即达到平衡，其结合物在室温下1小时内保持稳定）实验3:SODW舌性3.1步骤：1.取50口l酶液 加入2ml39mmol/L甲硫氨酸（Met） 2ml0.225mmol/LNBT,（氮蓝四唾）1ml0.6mmol/LEDTA-Na?（可以配制在一个试齐ij瓶里）1ml0.012mmol/L核黄素，摇匀。（现配现用）2. （人工培养箱内）4000Lx日光灯下放置30分钟后，温度控制在30°C，于暗处终止反应。（用大烧杯套着小烧杯，将试管放在同心圆内，每隔5min转过90度，转四

10、次。对照（不加酶液）每次至少对称地放3支，调零的不照光和不加酶液）3. 560nm处测吸光值，酶活性以抑制NBT光反应50渤一个酶活单位表示。（实验中可将除酶液和核黄素外其它试剂按比例混合好后，一次加入5ml，然后依次加入核黄素和酶液，以不加酶液的照光管为对照。）_3.2所需试剂：dl-甲硫氨酸（Met）39mmol/L1.1638g/g00ml以NBT0.225mmol/L（0.01840均克）/100ml0.0368g/200mlEDTA-Na0.6mmol/L0.0223g/100ml核黄素0.012mmol/L0.0045g/L或0.0045g/100ml用时稀释10倍各试剂溶液均在用

11、前配置，配置好后均应避光保存，尤其是核黄素，必须随用随配，避光保存。试验进行时一次性加5ml的反应混合液配置方法：Met+NBT+EDTA-Na2SOC酶测定时，酶液量50Pl偏少，改为100Pl为佳,200mll+200ml+100ml另外反应时间30分钟过长，改为20分钟适合SO席性（酶单位u/gFW=（A0-A1）*V/A0*0.5*FW*aA0-对照照光管光吸收值；A1-样品管光吸收值。V-样液总体积（ml）5mlFW-鲜重（g）1ga-测定用样品的量（ml）0.1ml实验4:CAT活性（过氧化氢酶）4.1 所需试剂： PB（SPH=7.0）50mmol/L（61份50mmol/lNa

12、2HPO4,39份50mmol/lNaH2PO4） 15mmol/L"0（以30%HQ配）（取85.2PL30%HQ,以50mmol/LPBS（PH7.0）定容至100ml）4.2 步骤:1. 3ml50mmol/LPBS（PH7.0）力口入50Pl酶液（加比色杯的盖子摇2-3下，让酶液与缓冲液充分分散）再加入5l15mmol/LH2Q摇匀（加比色杯的盖子摇2-3下，让酶液与缓冲液充分分散）。2. 240nm处作时间才3描（每0.5分钟测1次，共测3分钟）3. CAT活性以每分钟消耗1Pmol的HO为一个酶活单位。活性计算改动：（以每分钟OD®减少0.01为一个酶活单位u）

13、（2005和2006年均是按ODfi减少0.01算的）（以每分钟ODS减少0.1为一个酶活单位u）注意：以PBS作空白调零50mmol/L实验5:APX活性（抗坏血酸过氧化物酶）（即ASA-PO席性）5.1所需试剂：ASA（分子量167.12）0.3mmol=0.052836（g）（乙=胺四乙酸=钠）EDTArNa2（以PBS配成0.1mmol/L=0.0372（g）/L）50mmol/LPBS（pH7.0）9mmol/LH2Q（以30%bD配制）（51Pl30%H2Q定容至100ml）计算为：K1=2.8,K2=3,K3=-1,K4=100可得至U总取样（5ml酶液或1g样）的最终活性。酶活

14、性单位为Imol/g（鲜重）?min以后APX活性测定可参考沈文巡：抗坏血酸过氧化物酶活性测定的探讨3ml反应液中含50mmol/LPBS,pH7.0,0.1mmol/LEDTA（或EDTA-Na2），0.1mmol/LH2O20.5（或0.3）mmol/LAsA最后加入适量酶液（20、50、100ul均可）启动反应，连续记录测定室温下290nm吸收值的变化。以不加H2O2乍为对照，H2O瘁身对AsA的氧化作用在测定时间内由于吸收值变化太小可忽略不计。室温下每分钟氧化1umolAsA的酶量作为一个酶活性单位（U）（吸光系数为2.8mmol/Lcm）5.2步骤：1 .配反应液（50mmol/LP

15、BS（pH7.0），内含0.1mmol/LEDTA-Na2含0.3mmol/LASA）2 .样品池加入3ml反应液，加入50Pl酶液，最后加入5Pl9mmol/LH2O2（盖上比色杯的盖子摇匀，2-3次）在290nm处作时间才3描，每10秒测一次，共测30秒。（注意：在测定中消光值应该是不断减小的）3.根据OD值变化，计算单位时间内AsA消耗量，（ASA氧化消耗量按消光系数2.8mmol/L?cni,酶活性以单位时间每消耗1itmol的ASA为一个酶活单位，最后计算样品的APX活性（单位为：U/g（鲜重）?min）。（活性计算改动）根据OD29值变化，计算单位时间内AsA减少量（ASAK化量按

16、消光系2.8mmol/L?cmm，并计算样品APX终活性。酶活性单位为tmol/g（鲜重）?min实验6ASA含量测定6.1 步骤：1. 取样品母液0.2ml,1.4ml，75mmol/lNaH2PO4溶液（pH值7.4）（2.34gNaH2PO4?2H2淀容至200ml,用NaOKpH调至7.4）混合；（75mmol/lNaH2P。4§液亦可用150mmol/lNaH2PO4溶液稀释1倍得到）2. 依次加入（ 1） 10%偏磷酸（26.3158g38%偏磷酸定容至100ml）0.4ml;（ 2） 44%磷酸（26ml85%磷酸+41ml蒸馏水）0.4ml;（3）4%2,2'

17、-二联吡啶（称取4.0g2,2-二联吡啶用70%酒精定容至100ml）0.4ml;70%酒精配制（95%乙醇70份重量+蒸馏水25份重量）3%FeCI30.2ml（称取5.0gFeCI3?6H2O定容至100ml）,摇匀，于37°C保温1.0h（5）测525nm波长下的光吸收值4.以标准曲线方程计算ASA含量6.2 标准曲线的制作：（1）称取10mgAS汾析纯，以5姗磷酸定容至100ml,成100微克/毫升的标准液；(2)按下表取8支试管，按照表中的程序加液j式管编勺12345678标准液(ml)00.020).040.060.08().100.120.145%?偏磷酸(ml)0.2

18、00).180.160.140.12().100.080.06AS给k(微02468101214按前面步骤1、2所述依次加入各反应液，最后测525nm长下的光吸收值，作过原点标准曲线，求线性方程。实验7:GSHW量测定7.1步骤：1 .取样品母液0.2ml,加入150mmol/LNaH2PO希液(pH7.7)(11.70gNaH2PO42H2Cfe容至500ml用氢氧化钠调pH至7.7)2.6ml2 .混匀再加入0.2mlDTNEB§«(二硫代硝基苯甲酸DTNB75.3mg溶于30ml0.1mol/L磷酸缓冲液pH6.8)摇匀。实际配置时，称75.3X2=150.6mg,即

19、0.1506gDTNB§于60mlPBS中3 .在30°C保温5分钟，测定412nm波长下的光吸收值。【有些文献(如龚吉蕊、於丙军)方法同样用DTNBS色，都是在常温下显色30分钟因此可将反应时间适当延长至10分钟】7.2根据标准曲线（GSH程，计算GSH量。标准曲线制作：1.称取100mgGSH析纯，以5姗磷酸定容至100mL成1mg/ml即1000ug/ml的标准液。2.参照实验6标液方法。1式管编12345678，准液1（ml）00.020).040.060.08().100.120.145%偏磷(ml)0.200).180.160.140.12().100.080.

20、06GSH版克）X02468101214正确GSI含量（微k）0H204060801001201403.以GSH量为0的溶液调零，制作过原点标准曲线（及方程所需试剂：NaH2PO4150mmol/L）人称23.41gNaH2PO42H2O定容至1L（或称5.85定容至250ml）DTNB（二硫代硝基苯甲酸）0.1mol/LPBS（PH6.8）（参照邹琦的书实验8脯氨酸测定8.1步骤：1.取0.5g叶片，用5ml3%磺基水扬酸溶液提取，匀浆液在沸水浴浸提10分钟，冷却后，以3000g离心10分钟，上清液待测。2.取2ml待测液，加入2ml蒸储水，再加入2ml冰乙酸和4ml2.5%功三酮溶液，置沸水溶显色60min,冷却后，加入4ml甲苯充分振荡提取红色物后，静置后，取甲苯相（将移液枪的量程调至3.0ml吸取甲苯相，注意不要将枪伸到水相中。）测定520nm波长处的吸收值，依据标准曲线计算含量。8.2标准曲线制作：1 .标准液配制；准确称取25mg脯氨酸，用蒸储水溶解后定容至250ml,其浓度为100Pg/ml,再取10ml此液，蒸储水定容至100ml,即为10口g?ml-1的脯氨酸标准液。（脯氨酸标准液最好现用现配，放在冰箱也易变性）1标准脯氨酸 0（ml）H2O（ ml）2冰乙酸（ml） 2