植物细胞工程快繁周记

1、植物细胞工程植物快繁周记专业：制药工程姓名：陈琪学号：19100101试验时间:3.146.6.上课时间：每周四晚指导老师：陆长梅实验一、培养基贮备液(母液)的配制2013年3月14日一、实验目的：1 .熟悉MSW养基的组成，掌握贮备液的配制方法。2 .清洗和准备下次实验所需器械，如培养皿、培养瓶等。二、实验药品及仪器药品：MgSO4?7H2O,NH4NO3,CaCl2?2H2O,KNO3,KH2PO4仪器：天平、量筒、烧杯、容量瓶、培养皿、培养瓶、洗衣粉三、实验过程各组分别配制MSW养基贮备液贮备液I(g)贮备液III(mg)MgSO47H2O3.70500mLFeSO47H2O278100

2、mLNH4NO316.50Na2-EDTA-2H2O373CaCl22H2O4.40生长调节剂KNO319.006-BA50mg50mLKH2PO41.70NAA50mg50mL贮备液II(mg)贮备液IV(mg)KI8.3100mL肌醇1000100mLH3BO362烟酸5MnSO44H2O223盐酸硫胺素1ZnSO47H2O86盐酸口比哆醇5Na2MoO42H2O2.5甘氨酸20CuSO45H2O0.25称量溶解混合定容C0CI26H2O0.251.我组配制贮备液I(g)(20X):分别称取MgSO4?7H20370g,NH4NO316.50g，CaCl2?2H2O4.4g，KNO319.

3、00g，KH2PO41.70g，分别置于小烧杯中分别溶解，再一次混合，并定容至500mL。2.其他组配制贮备液H(mg)(100X)100mL,贮备液田(mg)(100x)100mL,贮备液IV(mg)(100X)100mL,生长调节剂：浓度为1mg/mL的6-BA和NAA各50mL。3各种母液配制完成后分别用玻璃瓶贮存，贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期、组别等，保存在冰箱的冷藏室内。4另配制超净台上各种试剂：1mol/L的NaOH1瓶1mol/LHCL1瓶0.1%的升汞：每个超净工作台一瓶7075%酒精：每个超净工作台一瓶95%酒精：每个超净工作台一瓶酒精棉球：每个超净工作台一瓶实验二、

4、固体培养基的配制与灭菌2013年3月21日一、实验目的1. 学习掌握植物组织固体培养基的配置和灭菌方法。2. 为下次实验准备各种灭菌好的培养基和器械二、实验材料试剂材料：培养基母液，蔗糖，琼脂，1mol/LHCL，1mol/L的NaOH实验仪器：分析天平，高压灭菌锅，pH计，电炉三、实验过程1接种用具洗涤、灭菌、烘干。2清洗培养皿（6个），清洗完成后，每个培养皿中放一张滤纸，然后用牛皮纸将培养皿包裹好，准备灭菌。3无菌水（6瓶）：在清洗干净的培养瓶中装入2/3的自来水，盖紧瓶盖，准备灭菌。4.配MSt养基（500mL:分别量取贮备液I25mL贮备液H5mL贮备液m5mL,贮备液IV5mL加入4

5、00mL*,加3姗糖，混合土匀后调节pH至5.8,称取0.8%琼脂剪碎加入到已调好pH的溶液中加热使琼脂完全溶解，最后定容至500mL混合均匀，趁热分装至20个清洗干净的培养瓶中，约25mL/fi。5将用牛皮纸包好的培养皿、无菌水以及分装完毕的培养基放在同一金属小筐中，放入高压灭菌锅中121，20min灭菌。灭菌完毕后，将培养皿放入烘箱中烘干，无菌水及培养基放在组培室中。6. 准备好超净台内的物品：剪刀、镊子、解剖刀、无菌水、无菌培养皿（部分培养皿内放滤纸）、酒精棉球、95%酒精瓶、废液缸、打火机、酒精灯。7. 甲醛熏蒸接种间。四、注意事项1 .配制培养液时应注意：在使用提前配制的母液时，应在

6、量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。2 .溶化琼脂需要注意的是：在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。3 .培养基的灭菌：常规方法是放入高压灭菌锅内加热加压灭菌。一般少量的液体只要12

7、1即每平方厘米1.1kg的压力20分钟就能达到彻底灭菌。灭菌的功效主要是靠温度，而不是压力。4 .玻璃器皿及耐热用具等可采用干热灭菌，即利用烘箱加热到160-180的温度来杀灭微生物。5 .用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌。五、实验结束后将所有灭菌过的器皿、培养基等放置在培养室一星期，观察是否长菌以确定是否灭菌彻底。实验三、无菌苗的培养2013年3月28日一、实验目的要求1. 了解组织培养的基本程序。2. 掌握接种的方法和材料的培养过程。3. 掌握无菌操作技术。二、实验用具：烧杯、移液管、量筒、长镊子、超净工作台、剪刀、培养室（含空调、调节温度器）三、实验材料：番茄种子，荷兰马齿苋种子，MS培养

8、基四、实验过程1 检查上周准备的培养基是否有长菌的现象，没有则可以使用。2检查超净工作台内东西是否齐全，包括酒精棉球，75%酒精溶液，95%酒精溶液，酒精灯，打火机，废液缸，剪刀，镊子，解剖刀。3将上周准备的灭菌并烘干的培养皿、培养瓶及无菌水放入超净工作台内，用75%酒精擦拭工作台面，关闭工作台移门，将紫外灯打开紫外灭菌半小时。4半小时后，将紫外灯关闭，但不打开日光灯，仅打开风机，防止菌体的光修复并去除臭氧，至少10min后才可上工作台进行操作。5选用荷兰马齿苋和番茄的种子，放入一个烧杯中，流水冲洗半小时，浮于表面的种子说明是干瘪的，弃用，滤去水，超净工作台准备完毕即可移至超净工作台继续后面的

9、操作。6 用75%酒精消毒双手，尤其是手指指甲处仔细擦拭，避免手上的细菌污染接种材料，上超净工作台，并将酒精灯点燃。7 .将冲洗后的种子用75%酉精浸泡45s,迅速加入无菌水终止消毒，倒掉之后，加入升汞没过种子即可，浸泡10min,然后用无菌水冲洗4-5次，然后将种子铺在装有滤纸的培养皿中，将多余水分吸干。8打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将种子置于培养基上，每个培养基上放34粒种子，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。9. 循环接种剩下的培养基，期间每次操作皆要消毒。10. 培养瓶贴上标签，做好标记，最后放到光照培养箱中或培养室培养架上进行培养，条件为2000LX，261。五、注意事项

10、1. 每瓶放置4-5个种子，保证发芽率，种子放置在培养基中间，分开放置，不要放置在壁上，不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。2. 接种用的酒精灯，火焰不要调得太高，接种时应靠近酒精灯火焰操作，接种动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。3. 接种时严防超净工作台内着火。4. 为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。5. 培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。6. 工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面

11、发生污染。7. 废液处理：酒精要回收，放原处；升汞有剧毒，小心不要溅出，废液倒回原处。六、实验结果上周配制的培养基没有长菌的，凝固也很好，正常使用。实验四、无菌苗的生长与外植体的培养基配制2013年4月18日一、实验任务1 .观察上次实验情况。2 .配制接种外植体用的培养基二、实验材料试剂材料：培养基母液，蔗糖，琼脂，1mol/LHCL，1mol/L的NaOH实验仪器：分析天平，高压灭菌锅，pH计，电炉三、实验过程1观察无菌苗的生长情况2配制月季诱导培养基：MS+6-BA1+NAA0.1（500mL）分别量取贮备液I25mL贮备液115mL贮备液田5mL,贮备液IV5mL6-BAO.5mLNA

12、A0.05mL加入400mLTK,力口3姗糖，混合土匀后调节pH至5.8,称取0.8%琼脂剪碎加入到已调好pH的溶液中加热使琼脂完全溶解，最后定容至500mL混合均匀，趁热分装至20个清洗干净的培养瓶中，约25mL加。3培养基灭菌4再一次灭菌培养皿、无菌水等，为下周接种子叶、下胚轴做准备四、实验结果无菌苗已生长3周，总体情况多是荷兰马齿苋种子的萌发率高，而番茄种子的萌发率低，我组亦然。番茄的种子基本没有萌发（图一），可能原因：番茄与马齿苋是放在一起培养的，马齿苋生长需光，番茄需暗，为了马齿苋的生长将光打开，可能影响到了番茄的萌发。荷兰马齿苋萌发率较高（图二），无菌苗的下胚轴长得很长，只有子叶，

13、子叶蔫了，可能原因：温度太高，空调温度失控（设置20，实际跑到30）。有部分培养瓶中长菌，有的是霉菌，有的是细菌（图三）图一番茄未萌发下胚轴长得长，只有萼掉的子叶发霉菌）实验五、植物外植体的接种与培养2013年4月25日一、实验任务1继续观察无菌苗的生长情况。2外植体的清洗、消毒和接种。二、实验过程1观察无菌苗生长情况2收拾超净工作台并紫外灭菌3外植体的清洗、消毒、接种（1）选材：月季的叶片、茎、花，薄荷的叶片，番茄的下胚轴（2）修剪与清洗：去除较老的叶片，尽量减小体积，减少污染用洗衣粉将外植体表面灰尘及绒毛等洗净，用自来水流水冲洗30分钟。（3）消毒：分别将月季和薄荷进行以下消毒，75%乙醇

14、浸泡30s,加入无菌水终止消毒，倒掉后，加0.1%升汞浸泡10分钟，最后大量无菌水冲洗4-5次。无菌苗只需直接放在无菌水里清洗即可。（4）无菌修剪：用无菌镊子和剪刀进一步去除多余的叶片，依据需要切割成相应大小的茎段（带2-3个叶片）。a.月季及薄荷叶片的制备方法是：用解剖刀切取，切成1cmx1cm的小方片；b.月季的茎：需切取两个节之间的节间部分，长约1cm；c.番茄下胚轴一一切去子叶胚根，切成1-2cm一段；切取的外植体要放入带滤纸的无菌培养皿中。（5）接种：无菌操作将处理好的材料接种于培养基上。（6）培养：25，光照培养。三、注意事项1 .要根据植物材料对灭菌剂的敏感性来选用不同的药剂，确

15、定适宜的处理时间和水洗的次数。不同植物、部位、组织年龄及环境状况番番灭菌时间不同2 .在无菌条件下，将消毒过的实验材料切成小块，制备外植体。3 .外植体放入培养基时，注意方向。每瓶放置外植体的数量，应该根据培养瓶瓶的大小来确定，一般放置2-4块。注意外植体也不要放得太少，以充分利用培养基中的营养成分。4 .工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。5 .接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中。四、实验结果一周后观察外植体愈伤组织生长情况。实验六、石楠生根培养基的配制与灭菌2013年5月2日一、实验任务1观察上周外植体愈伤组织的生长情况。2

16、清除长菌的培养瓶。3配制石楠生根培养基。二、实验过程1观察上周外植体愈伤组织的生长情况。2配制石楠生根培养基：1/2MS+NAA0.2+IBA0.5（1000mL）分别量取贮备液I25mL,贮备液H5mL,贮备液田5mL,贮备液IV5mL,IBA0.5mL,NAA0.2mL,加入600mL水，力口2%蔗糖，混合均匀后调节pH至5.8,称取0.9%琼脂剪碎加入到已调好pH的溶液中加热使琼脂完全溶解，最后定容至1000mL,混合均匀，趁热分装至20个清洗干净的培养瓶中，约50mL/瓶。3培养基灭菌4.再一次灭菌培养皿、无菌水等，为下周接种生根材料做准备。三、实验结果我组情况：有4个培养瓶：月季的叶

17、片消毒过度，死亡（图四）有1个培养瓶：月季的茎消毒时间不够，染菌（图五）有2个培养瓶：月季的茎，开始长芽（图六）有2个培养瓶：月季的花，继续生长，其中一个培养基底部有黑色分泌物，疑似长菌，继续观察（图七）有8个培养瓶：月季叶片生长无明显变化（图八），但薄荷的叶片形状有所变化，说明开始生长愈伤组织（图九）有3个培养瓶：无菌苗番茄，长势良好，下胚轴膨大，愈伤组织开始形成，且比外植体长势好（图十）其他组发现：1. 马齿苋和番茄无菌苗不易染菌，一周内就开始愈伤组织长出2. 薄荷：叶片很容易灭菌过度，但叶芽容易长出，在节部和节间易长出白色的不定根。3 .菊花：茎很容易灭菌过度又很容易染菌，几乎所有的茎段

18、全部死亡。叶片相对较好。（可能是由于有大量绒毛的缘故）。4 .驱蚊草：叶片比较容易除菌，不容易死，茎段太粗，且有两组长菌。5 .双色茉莉染菌不严重。图八月季叶片无明显变化图九薄荷叶片形状有变化图十番茄下胚轴膨大愈伤组织形成实验七、外植体的生根培养2013年5月9日一、实验任务1观察所接植物的生长情况。2清除长菌的培养瓶。3接种生根用外植体。4配制诱导月季生芽培养基。二、实验材料石楠，小叶女贞，大叶女贞三、实验过程1观察前几次实验现象2收拾超净工作台并紫外灭菌3清洗外植体：用洗衣粉将外植体表面灰尘及绒毛等洗净，用自来水流水冲洗至少30分钟。4接种石楠、小叶女贞、大叶女贞，选择嫩芽、花苞或嫩茎切取

19、两个节之间的节间部分，长约1cm接种）5整理实验台，将接种好的组培瓶放入培养室中培养。6配制诱导月季生芽培养基：MS+6-BA1+NAA0.1分别量取贮备液I25mL贮备液H5mL贮备液田5mL,贮备液IV5mL6-BAO.5mLNAA0.05mL,加入400mL*,力口3姗糖，混合土匀后调节pH至5.8,称取0.8%琼脂剪碎加入到已调好pH的溶液中加热使琼脂完全溶解，最后定容至500mL混合均匀，趁热分装至20个清洗干净的培养瓶中，约25mL/fi。四、实验结果番茄的愈伤组织继续生长（图十一）；月季叶片的愈伤组织已经开始形成，但是不多，很小（图十二）；月季的花枯萎，估计会死亡（图十三）；月季

20、的茎上新长的芽继续生长（图十四）；薄荷叶片的愈伤组织上周已经长出了了，但是这周观察感觉没有上周长得好，有些萎缩（图十五），继续培养，下周观察其生长情况。略有生长图十三月季花枯萎可能死亡图十五薄荷叶片愈伤组织似乎萎缩了实验八、观察无菌苗及外植体生长情况2013年5月16日上周|生根培养|结果:我组：由于外植体消毒不彻底，有6个培养瓶内长了霉菌，1个培养瓶内长了细菌（图十六）；1个培养瓶内，植物体（石楠）伤口上有雾状物质一一内生菌（图十七）；1个培养瓶内，大叶女贞枯萎（图十八）。其他的培养瓶内暂时看不出有何变化，未长菌，未生根（图十九）其他组：无菌苗无内生菌，生根很快，已经长出根，番茄的下胚轴整个

21、“睡”在培养基上，其上直接长根（图二十），说明生长素对跟的影响很大。有的根已经长出（图二十一），有的根萌动但未长（图二十二），可能是培养基的差异。图十八大叶女面枯荽图二十无菌苗番茄很快生根下胚轴上直接长根图二十一马齿范已有根长出图二十二马国英根有萌动，但未长愈伤组织勺培养情况:番茄的愈伤组织膨胀得更大（图二十三）；马齿宽下胚轴愈伤组织长势最好（图二十四）；月季叶片中间细胞死亡的长不出愈伤组织，周围细胞没死的则长出了遇上组织（图二十五）；月季的花苞死亡，但叶片仍然生长（图二十六）；月季的茎继续生长，长出了新的叶片（图二十七）；薄荷的叶片培养一周后长出了愈伤组织，但第二周再观察时，感觉萎缩了，没有第一周时的大，培养到第三周，死亡（图二十八），猜想：月季的诱导培养基能够诱导薄荷愈伤组织的形成，但是无法使其长久的生长。缸十三番糊蝴卿雕霰大图二十四马齿觅愈伤组织长势最好国二十六月季花苞死亡叶片仍然生长图二十七月季茎继续生长，长出新叶实验九、愈伤组织诱导生芽的培养、芽生芽的培养2013年5月23日一、实验任务1 .观察上次实验结果2 .收拾超净工作台3 .接种愈伤组织、无菌苗4 .清洗长菌培养瓶二、实验步骤1 .选材：马齿宽、月季2 .清洗：将马齿尼和月季的用无菌水清洗干净，去除上面的琼脂。3 .接种：将马齿尼的愈