蛋白质定量新方法及相关技术研究

1、项目名称：蛋白质定量新方法及相关技术研究首席科学家：张丽华 中国科学院大连化学物理研究所起止年限：2012.1至2016.8依托部门：中国科学院一、关键科学问题及研究内容拟解决的关键科学问题随着对复杂生物体系蛋白质组质谱数据挖掘和蛋白质功能分析的深入进行，迫切需要获得大量蛋白质的定量信息。发展具有自主知识产权的高精度、高准确度、高覆盖率和高通量的规模化蛋白质定量新材料、新技术、新方法和新系统，对于推动蛋白质科学的深入研究具有重要意义。因此，本项目针对目前规模化蛋白质定量现有方法和技术存在的缺陷，拟重点解决以下关键科学和技术问题： （1）蛋白质或肽段回收率、分辨率和鉴定覆盖率低的问题； （2）蛋

2、白质组相对和绝对定量分析的精确度和准确度差的问题； （3）规模化蛋白质定量分析的通量和自动化程度低的问题。 研究内容针对科学问题（1），开展高效低残留的样品处理和分离新材料的研究（研究内容1）；针对科学问题（2），开展基于色谱-质谱的蛋白质组相对和绝对定量新方法和新技术的研究（研究内容2和3）；针对科学问题（3），开展集成化蛋白质组定量分析系统的研究（研究内容4）。此外，利用发展的新材料、新技术、新方法和新系统，示范性开展重要模式生物（如酵母）和肿瘤（如肝癌）相关蛋白质组的定量研究（研究内容5）。1. 高效低残留的蛋白质组样品处理和分离新材料 1）样品处理新材料：通过化学和物理方法，对磁性材料

3、、整体材料、介孔材料和多孔材料等样品处理材料进行表面修饰，有效降低基质的非特异性吸附，提高蛋白质和多肽的回收率； 2）蛋白质丰度均衡新技术：基于噬菌体展示文库、适配体文库等配基，发展蛋白质组均衡技术，通过在去除多种高丰度蛋白质的同时富集低丰度蛋白质，提高蛋白质组鉴定的覆盖率； 3）蛋白质高效分离新材料：研制新型大孔微球、超细粒径颗粒和杂化整体材料，实现蛋白质的低残留、高分辨分离。 2. 基于色谱-质谱的蛋白质组相对定量新方法和新技术1）标记相对定量方法：建立基于体内终端氨基酸同位素标记、串联18O同位素标记、金属离子或其他化学试剂等非同位素标记的大规模蛋白质相对定量新方法，提高标记相对定量的精

4、确度、准确度和覆盖率； 2）非标记相对定量方法：发展基于流动相添加内标、曲线拟合等色谱-质谱联合定量新方法、基于化学修饰的肽段高效率、高稳定性离子化新技术，以及基于蛋白质特征肽段的多反应监测质谱高通量相对定量方法，提高非标记相对定量的精确度和准确度； 3）定量数据解析算法：建立基于高阶线性分解模型、统计模型、分析模型等多种蛋白质组数据处理方法，提高对不同丰度蛋白质的定量分析能力；研究肽段一级谱特征的识别与提取、二级谱图母离子质量的校准、“混合”二级谱的识别与鉴定和肽段保留时间测算，提高质谱定量信息的可利用率；研究基于一级/二级谱图的标记/非标记定量算法和肽段/蛋白定量比值准确性评价算法，提高蛋

5、白质定量计算的准确度。 3. 基于色谱-质谱的蛋白质组绝对定量新方法和新技术 1）内标肽的设计、合成和表征：设计合成内标肽，并采用标准氨基酸、稳定同位素标记的氨基酸同位素稀释法，结合选择性反应检测质谱，建立内标肽的准确表征新方法，为蛋白质组的准确定量提供参考物质； 2）标记蛋白质组绝对定量新方法：发展蛋白质的生物双重标记、固相标记和金属元素标记等蛋白质多重标记技术，以及色谱保留时间与多反应监测质谱结合的目标蛋白质组绝对定量方法，提高蛋白质组绝对定量的通量，实现蛋白质组的动态监测； 3）非标记规模化蛋白质组绝对定量新方法：发展质谱图计数与多反应监测质谱结合的定量方法，以及绝对定量数据提取和处理方

6、法，提高复杂生物样本中蛋白质组绝对定量的准确度。 4. 集成化蛋白质组定量分析系统 1）在线样品处理系统：设计蛋白质在线变性、还原和烷基化装臵，研制缓冲溶液交换接口，制备高效低残留固定化酶反应器，并通过上述部件的集成，构建在线蛋白质组样品处理系统，实现蛋白质组的高效、高通量和低损失率的在线处理； 2）在线标记系统：研制基于新型样品处理材料的蛋白质组通用或选择捕集柱，并通过优化同位素或非同位素原位固相标记条件，构建在线标记系统，实现蛋白质或肽段的高通量标记； 3）集成化蛋白质组定量系统：构建样品处理、标记、分离、鉴定和数据处理的规模化蛋白质定量集成化系统。 5. 复杂样本的定量蛋白质组分析 1)

7、 采用国际通用的模式生物（如酵母），对发展的新材料、新技术和新方法进行评价，并建立标准化操作流程； 2) 针对肿瘤（如肝癌等）发生发展相关的潜在分子标记物群和治疗靶点群，示范性地开展相关蛋白质的规模化定量分析。二、预期目标1 总体目标 发展具有原始创新性的蛋白质定量新方法和相关技术，使我国在高效低残留的蛋白质样品处理和分离材料、基于色谱-质谱的蛋白质组绝对和相对定量技术，以及高通量、自动化的蛋白质组定量分析系统方面达到国际领先水平，并力争引领国际发展趋势。所发展的新材料、新方法、新技术和新系统能够为我国科学家实现重要生物体系蛋白质组的高精确度、高准确度、高通量和深度覆盖的定量分析，以及与疾病相

8、关的潜在生物标志物筛选以及药物靶标蛋白质的寻找等蛋白质科学前沿领域研究提供重要技术支撑。 2. 五年目标通过本项目的实施，发展一批具有自主知识产权或原始创新的规模化蛋白质定量新材料、新技术、新方法和新系统，显著改善规模化蛋白质定量的回收率、精确度、准确度、覆盖率和通量。具体目标包括： 1) 研制高效低残留蛋白质样品处理和分离材料，将蛋白质或肽段的回收率提高到90%以上，峰容量达到100以上； 2) 提供高精确度蛋白质组相对定量新方法，变异系数小于20%；提供高准确度蛋白质组绝对定量新方法，误差小于10%，经质谱鉴定的目标蛋白质的绝对定量覆盖率达到80%以上； 3) 构建自动化蛋白质定量分析系统

9、，实现样品在线处理、分离和鉴定，单次运行可以定量1000种以上蛋白质，变异系数小于15%； 4) 编制蛋白质定量软件，使谱图鉴定率提高到50，定量准确性比Census软件提高20%； 5) 发表SCI论文80篇以上，其中IF>8文章10篇，IF>5文章30篇；申请发明专利20项； 6) 培养杰青1-2人，博士30人，博士后10人；形成一支优秀的定量蛋白质组新方法和相关技术的人才队伍。 三、研究方案1. 总体学术思路、技术路线和可行性分析总体学术思路：本项目的总体学术思路如图1所示。将针对蛋白质组研究前沿领域迫切需要解决的规模化蛋白质定量精确度和准确度差、分析通量和覆盖率低等关键科学

10、问题，拟从样品处理和分离材料、高精度和高准确度的相对定量、绝对定量方法和技术，以及集成化定量分析系统四个层面出发，侧重发展可满足蛋白质组定量分析需求的新材料、新技术、新方法和新系统，为推动我国蛋白质科学的发展提供重要技术支撑。图1 项目总体学术思路技术途径： 本项目将通过蛋白质组样品处理和分离新材料、基于色谱-质谱的定量新技术、以及集成化定量分析平台等3个层面的多种途径实现总体学术思路。 1）高效低残留的样品处理和分离新材料：采用点击化学、可逆加成断裂链转移聚合和原子转移自由基聚合反应等方法，对样品预处理材料进行表面修饰；采用自组装、热聚合、光聚合、溶胶凝胶法、凝胶法、融盐法、分散聚合、沉淀聚

11、合和蒸馏沉淀聚合反应等方法，制备蛋白质分离材料；利用噬菌体展示抗体可变区片段文库和适配体库为配基，研制蛋白质均衡器。2）基于色谱-质谱的高精确度和高准确度的蛋白质定量新方法和新技术：采用体内终端氨基酸同位素标记、双功能试剂/稀土金属络合物化学标记、流动相添加内标法、曲线拟合法、化学衍生技术、可信肽段预测方法、高阶数据处理等技术，发展高精确度的蛋白质组相对定量新方法；采用化学合成内标肽技术、生物表达内标肽技术、稳定同位素标记的氨基酸同位素稀释法和质谱多反应监测等技术，发展高准确度的蛋白质组绝对定量新方法。 3）高通量、自动化定量分析新系统：采用热变性、化学变性、微透析技术、固定化酶反应器、固相标

12、记技术、缓冲液臵换技术、多维色谱分离、生物质谱鉴定等技术，构建集成化蛋白质组定量分析新系统；采用荧光标记、固相衍生、深紫外激光诱导荧光、量子点标记、细胞计数等技术，发展超高灵敏度的目标蛋白质群的定量分析新方法。 可行性分析：本项目设置的研究内容不仅是国家中长期规划纲要规定的研究任务，而且是目前国际蛋白质组学研究领域的前沿和热点问题。参加本项目的研究团队由在十五和十一期间国内从事蛋白质组分离鉴定新技术新方法研究的优势单位组成。不仅在蛋白质定性分析方面具有很好的基础，而且在规模化蛋白质定量分析方面研究水平处于国际前沿水平。因此，完全有能力在蛋白质组定量新方法和相关技术领域取得重大突破。 在样品处理

13、和分离材料方面，研制了新型亲水性人工抗体材料，在去除高丰度蛋白质的同时，避免了因非特异性吸附引起的低丰度蛋白质丢失，可将血清中鉴定的蛋白质数目提高30%以上（Chem. Comm., 2011, 47, 3969-3971; unpublished data）；制备了多种新型聚合物复合纳米材料，实现了低丰度蛋白质的富集效率达到3个数量级（Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3345-3349; Angew. Chem. Int. Ed., 2008, 47, 2646-2648; Anal. Chem., 2008, 80, 6758-6763），回收率达到80%

14、以上（Anal. Chem., 2009, 81, 503-508; Chem.-Eur. J., 2009, 15, 10158-10166; Chem.-Asian J., 2010, 5, 1185-1191)。在分离材料方面，研制了无机-有机杂化亲水整体材料，在改善蛋白质分离效率同时，提高了蛋白质的回收率（Anal. Chem., 2010, 82, 5447-5454）。此外，还通过溶胶-凝胶法发展了一系列以金属氧化物为基质的细粒径分离微球（Chem. Comm., 2009, 20, 2929-2931），显著改善了蛋白质的分离能力。 在蛋白质组相对和绝对定量新技术新方法方面，建立

15、了金属-双功能试剂-生物质谱方法、18O标记-双功能试剂-生物质谱法、氘代酸酐标记-生物质谱法以及同系物酸酐标记-两维凝胶电泳-生物质谱法等蛋白质相对定量新方法，并成功用于一氧化氮刺激的酵母蛋白质组变化研究、小鼠酒精脂肪肝蛋白质组研究，以及四氯化碳诱导肝损伤蛋白质组变化研究（Anal. Chem., 2006, 78, 6614-6621; Anal. Chem., 2007, 79, 7700-7707; Proteomics Clin. Appl., 2010, 4, 111）；将甲基化同位素标记技术与蛋白质分离技术相结合，提高了定量技术的整体通量，筛选出了501个在早期大肠癌和正常组织中

16、差异表达的蛋白质（J. Proteome Res., 2010, 9, 4701-4709）；利用串联18O同位素标记进行人卵巢癌血清的糖蛋白质组定量研究，发现了56 个糖肽的糖基化程度发生了显著改变（J. Proteome Res., 2010, 9, 227-236）；建立了基于稳定同位素稀释-多反应检测质谱的目标蛋白质绝对定量和验证方法，并将所建方法用于肝癌病人血浆中玻璃粘连蛋白和簇集蛋白的绝对定量分析，其结果与文献报道结果一致相对标准偏差小于20（J. Proteome Res., 2010, 9, 3319-3327）。 在集成化蛋白质组分析平台方面，实现了蛋白质在线变性、还原、酶解

17、、分离和鉴定的集成，将蛋白质组样品处理时间从离线的20 h缩短到在线的7 min（Anal. Chem., 2009, 81, 6534-6540）；研制了集成化蛋白质富集、缓冲溶液交换和酶解装臵，不仅可以显著提高蛋白质组样品的处理通量，而且可以避免多步离线操作而引起的蛋白质损失，蛋白质回收率达到80%以上（Anal. Chem., 2010, 82, 2574-2579）；发展了柱上标记技术，实现了肽段标记、分离和鉴定的集成化，提高了规模化蛋白质定量分析能力（Anal. Chem., 2010, 82, 3007-3015）。 此外，该研究团队不仅拥有利用基于色谱-质谱联用进行蛋白质定量的先

18、进设备，而且是一支年轻而又富有创新敬业精神的队伍，主要研究骨干均为工作在第一线的青年人才。基于以上考虑，该团队完全有条件和能力完成所确立的研究内容和任务，并取得一批具有自主知识产权的突破性和创新性研究成果。为推动我国蛋白质科学跨越式发展，并达到国际领先水平提供重要技术支撑。2. 创新点 1） 采用点击化学、可逆加成断裂链转移聚合和原子转移自由基聚合等可控反应策略，研制分辨率高、残留低的样品处理和分离材料，提高蛋白质组样品的回收率和分辨率；通过发展基于新型配基库的可降低蛋白质丰度分布范围的均衡器技术，提高蛋白质组鉴定的覆盖率； 2） 建立二级质谱特征肽段多对离子检测、可信肽段实时监测校正的非标记

19、定量方法，以及发展基于化学修饰的高稳定质谱离子化以及金属元素标记新技术，提高蛋白质组相对定量分析的精确度； 3） 采用蛋白质双重生物代谢标记、固定化标记内标肽技术和智能化的多反应监测质谱新方法，提高目标蛋白质组绝对定量分析的准确度； 4） 发展基于荧光标记、量子点标记的细胞计数与蛋白质定量相结合的新方法，提高目标蛋白质群定量的灵敏度； 5） 发展固相原位样品处理技术，构建集成化定量蛋白质组分析系统，实现定量蛋白质组高通量的自动化分析。 3. 课题设置本项目针对现有规模化蛋白质定量技术和方法存在的精确度和准确度差、覆盖率和分析通量低等科学问题，发展蛋白质组定量新方法和相关技术。根据总体学术思路，

20、设臵四个课题。第一课题重点研制高效低残留的蛋白质组样品处理和分离新材料，解决蛋白质回收率和分离效率低的问题；第二课题重点发展基于色谱-质谱的蛋白质相对定量新技术新方法，解决规模化蛋白质定量分析精确度差的问题；第三课题重点发展基于色谱-质谱的蛋白质组绝对定量新技术新方法，解决规模化蛋白质定量分析准确度差的问题；第四课题重点构建集成化蛋白质组定量分析系统，提高规模化蛋白质定量的分析通量、覆盖率和自动化水平。四个课题之间紧密相关(见图2) 。前三个课题重点发展新材料、新技术和新方法；课题四将对所发展的新材料、新技术和新方法进行集成，实现高精度的规模化蛋白质定量分析。此外，将采用模式生物-酵母对上述发

21、展的定量新方法和相关技术体系进行评价，并示范性地开展肿瘤相关蛋白质的规模化定量分析。课题1 ： 高效低残留的蛋白质样品处理和分离新材料研究内容： 鉴于在蛋白质样品处理方面存在因基质材料的非特异性吸附和“海绵效应”（蛋白质间非特异性相互作用）引起的蛋白质损失，以及蛋白质分离能力有限等诸多问题，本课题拟从以下三个方面开展研究，提高定量蛋白质组分析的回收率、覆盖率和分辨率。 具体内容包括：1）新型蛋白质/多肽处理材料的功能化修饰：基于活性/可控聚合反应或点击化学的修饰方法，在磁性材料表面键合亲水性可控的聚合物链段，提高蛋白质组样品在基于磁性材料的处理过程中的回收率。研制具有传质速度快、背压小等优点的

22、新型整体材料，实现蛋白质组样品的在线处理。研制表面性能可控、孔径可调的新型介孔材料和多孔材料，实现基于体积排阻机理的蛋白质和多肽的分离。2）降低蛋白质丰度范围的均衡技术：通过制备亲水性冷凝胶基质材料和亲水性磁性颗粒基质材料，降低蛋白质在基质材料表面的非特异性吸附；基于生物分子间特异性相互作用，分别选择M13噬菌体展示抗体可变区片段文库和随机寡核苷酸库作为配基，并将其键合到亲水性基质材料上，实现配基库的高效、高容量固载；优化样品上样和洗脱条件，在去除多种（含未知）高丰度蛋白质的同时，实现低丰度蛋白质的富集；通过降低蛋白质的丰度分布范围，提高蛋白质组定量的覆盖率。3）新型高效蛋白质分离材料的研制：

23、分别基于点击化学、可逆加成断裂链转移聚合和原子转移自由基聚合反应等方法，在已有大孔硅胶微球或聚合物微球表面进行功能基团和亲水基团的可控修饰，制备新型蛋白质分离微球，提高蛋白质分离的分辨率和回收率。采取不同方法（热聚合、光聚合、溶胶凝胶法）制备适于蛋白质分离的聚合物整体材料、硅胶整体材料和有机-无机杂化整体材料，并在此基础上，研制可实现理化性质差异显著的蛋白质分离的高效、低残留的超长超细内径毛细管整体柱。采用凝胶法、融盐法、分散聚合、沉淀聚合或蒸馏沉淀聚合法，制备超细粒径微球材料，并通过修饰功能基团和亲水基团，实现蛋白质的高效、低残留分离。预期目标： 1）通过对样品处理材料进行表面化学修饰，有效

24、降低基质的非特异性吸附，提高蛋白质和多肽的回收率；2）通过发展可显著降低蛋白质组丰度分布范围的均衡技术，提高蛋白质组鉴定的覆盖率；3）通过研制新型分离材料，提高蛋白质分离的分辨率和回收率。承担单位： 中国科学院大连化学物理研究所、南开大学课题负责人： 杨开广经费比例： 22%课题2 ： 基于色谱-质谱的蛋白质组相对定量新方法和新技术研究内容：针对规模化蛋白质相对定量中标记反应效率低、非标记方法重复性差以及定量软件效能低等科学问题，本课题拟开展三个方面的研究，提高相对定量方法的精确度、准确度以及覆盖率。 具体内容包括：1）标记相对定量新方法和新技术：通过复合纳米材料对低丰度蛋白质高效率、高回收率

25、富集和体内终端氨基酸标记（IVATL）二级质谱定量技术的结合，实现复杂生物体系中低丰度蛋白质的定量分析。采用硼酸修饰纳米材料富集糖基化修饰肽段，对非糖肽进行标记（如iTRAQ），并根据其同位素峰强度的差异对糖蛋白进行定量；再对糖基化位点进行18O标记，并根据糖肽同位素峰强度的差异对其糖基化程度进行定量分析。发展基于非同位素双功能试剂/稀土金属络合物化学标记的蛋白质组相对定量新方法。2）非记相对定量新方法和新技术：通过引入信噪比、正确的质荷比和同位素峰分布等参数滤去噪音信息，提高肽段质谱峰预测的准确性；在此基础上，通过“可信肽段预测”，即根据可信肽段鉴定结果来预测该肽段在液相色谱柱中的洗脱时间，

26、并结合母离子的m/z值来定位该肽段在其他液质联用循环中的信号，提高鉴定到的肽段的非标记定量的准确性。通过在流动相中加入设计和优化的内标肽，实时监测质谱电喷雾的状况，并发展合适的算法对获取的数据进行归一化，实现对质谱信号的实时地校正，从而提高无标定量分析的重现性。通过发展高稳定的离子化技术，提高肽段的质谱响应，进而确保蛋白质组的精确性和准确性3）关键计算问题研究与软件系统开发：充分发挥色谱-质谱联用数据与高阶数据处理技术相互结合的优势，用高阶校正方法同时改善蛋白质组质谱定性色谱定量的数据处理效果；根据色谱质谱数据的特点，开发与之相适应的高阶张量分解算法，提高蛋白质组定量数据处理的速度和效率。对原

27、始质谱数据中的一级与二级谱图信息进行整合分析，尽可能去除由于仪器引入的误差与干扰，提高质谱信息的可利用率；对定性和定量分析结果进行严格、准确地评价与过滤，尽可能排除假阳和假阴性结果；开发支持新型标记和非标记定量策略的算法库，以及通量大、可靠性好、扩展性强和易于操作的具有完全自主知识产权的定量蛋白质组学数据分析系统。预期目标：1）通过建立规模化蛋白质标记相对定量新方法，提高定量的精确度、准确度和覆盖率； 2）通过发展规模化蛋白质非标记相对定量新方法，提高定量的精确度和准确度； 3）通过发展定量数据解析算法，提高对不同丰度蛋白质的定量分析能力、质谱定量信息的可利用率和蛋白质定量计算的准确度。承担单

28、位： 复旦大学、中国科学院计算技术研究所课题负责人： 陆豪杰经费比例： 24%课题3 ： 基于色谱-质谱的蛋白质组绝对定量新方法和新技术研究内容： 针对绝对定量蛋白质组学中存在的规模化内标肽制备困难、标记反应效率低、规模化多反应监测难以实现和非标记方法重复性差等科学问题，本课题拟开展三个方面的研究，提高绝对定量方法的准确度、通量和精确度。具体内容包括：1）内标肽的设计、合成和表征：针对需要定量的蛋白质组样品，根据文献报道和已有蛋白质表达谱数据库，考察其色谱行为和质谱特性，选择每种蛋白质的特征肽段；设计化学合成或生物表达内标肽技术路线，制备内标肽；建立对其进行色谱纯化的方法，以及基于标准氨基酸、

29、稳定同位素标记的氨基酸同位素稀释法结合选择性反应检测质谱等对其含量进行准确表征的方法，进而确定内标肽的准确含量，并制备出内标肽，为目标蛋白质组绝对定量提供参考物质。2）蛋白质组绝对定量标记新方法：发展蛋白质的生物双重标记、固相标记和金属元素标记等蛋白质多重标记技术以及色谱保留时间与多反应监测质谱结合的目标蛋白质组绝对定量方法，提高目标蛋白质组准确定量的通量，实现目标蛋白质组的动态监测和绝对定量分析。3）非标记规模化蛋白质组绝对定量新方法：对生物样本中蛋白质组的酶切混合物进行高精度的液质联用分析，然后对获取的质谱图计数归一化处理，获得绝对定量结果；在不同动态范围选择至少五种蛋白质，对这些蛋白质进

30、行多反应监测质谱准确定量；通过相应蛋白质的非标定量与准确定量结果的相关系数对其他非标定量结果进行校正；通过发展绝对定量数据提取和处理方法，提高复杂生物样本中蛋白质组绝对定量的准确度。预期目标：1）通过建立内标肽的设计、合成和表征方法，为蛋白质组的准确绝对定量提供参考物质； 2）通过建立蛋白质组标记以及色谱保留时间与多反应监测质谱结合的蛋白质组绝对定量方法，实现蛋白质组的动态监测和绝对定量分析； 3）通过建立非标记规模化蛋白质组绝对定量新方法，同时发展绝对定量数据提取和处理方法，提高复杂生物样本中蛋白质组绝对定量的准确度。承担单位： 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所、北京理工大学

31、 课题负责人： 张养军经费比例： 24%课题4 ： 集成化蛋白质组定量分析系统 研究内容： 针对蛋白质组样品处理、分离和定量分析费时、费力、样品易污染、易丢失等科学问题，本课题拟发展蛋白质定量样品处理新装臵、自动化标记新技术，构建集成化定量蛋白质组分析系统，提高规模化蛋白质定量的通量和自动化水平。具体内容包括：1） 在线样品处理装置：设计蛋白质在线变性、还原和烷基化装臵，研制缓冲溶液交换接口，制备高效低残留固定化酶反应器，并通过上述部件的集成，研制在线蛋白质组样品处理装臵，实现蛋白质组的高效、高通量和低损失率处理。2） 原位固相标记系统：制备性能稳定、背压低、上样量大的通用性或选择型蛋白质或多

32、肽捕集柱，并以此为反应器，通过在固相介质上连续引入标记试剂，实现全蛋白质组或目标蛋白质组的固相原位标记。将在线标记系统与分离鉴定系统联用，实现样品标记、色谱分离和质谱鉴定的全自动分析，提高规模化蛋白质定量分析的精确度和分析通量。3） 集成化蛋白质定量分析系统构建：通过将研制的新材料、新方法、新技术和新系统在线集成，构建适于细胞、组织或体液定量分析的高精度蛋白质定量集成化分析系统，实现蛋白质组样品的高分辨、高精度、高准确度、高通量和深度覆盖定量分析。4）超高灵敏度蛋白质定量分析方法和系统：构建基于多维色谱的蛋白质分离平台，并利用疾病标识蛋白质在多维色谱分离中进行色谱峰定位；利用固相衍生和激光诱导

33、荧光检测联用技术制作目标蛋白的定量标准曲线。利用上述色谱峰定位和定量标准曲线的结合，实现疾病样品中目标低丰度蛋白质的高灵敏度定量，并利用质谱进行鉴定和结果验证。预期目标： 1）通过研制蛋白质组在线样品处理装臵，实现蛋白质组的高效、高通量和低损失率处理； 2）通过发展蛋白质组在线标记系统，提高蛋白质或肽段的标记通量； 3）通过构建集成化定量蛋白质组分析系统，并制定标准化操作流程，提高蛋白质组定量分析的精确度、准确度、通量和覆盖率。承担单位： 中国科学院大连化学物理研究所、复旦大学 课题负责人： 张丽华经费比例： 30% 四、年度计划研究内容预期目标第一年1. 通过对磁性材料的表面修饰，研制低残留

34、样品处理磁性材料；探索超细粒径微球的制备方法，用于多肽的高效分离方法；2. 研究基于细胞培养代谢标记结合二级质谱定量策略、二级质谱定量过程中谱图识别和分析新方法、基于串联18O标记的定量新技术，以及多种标记和18O标记技术进行串联组合定量策略；3. 发展化学和生物合成标准肽段方法、内标肽的色谱纯化和储存方法，以及色谱和质谱纯度表征方法，以及基于标准氨基酸、稳定同位素标记的氨基酸同位素稀释法结合选择性反应检测质谱的含量测定方法；4. 研制蛋白质样品的传输载体膜材料、热变性装置、缓冲液置换接口和低残留固定化酶反应器；1. 研制2-3种低残留的样品预处理磁性材料和1-2种多肽高效分离填料；2. 建立

35、并标准化细胞培养代谢标记结合二级质谱定量的新方法和串联18O标记的定量新技术；发展1种基于二级质谱定量的新算法；3. 建立2种内标肽的设计合成方法、1种内标肽储存方法、1种内标肽色谱纯化方法和2种纯度表征方法，以及1种内标肽含量测定方法；4. 提供1种低残留的蛋白质传质膜材料；研制1种缓冲液置换接口，使缓冲液置换效率达到90%以上；制备2-3种低残留固定化酶反应器，酶解时间小于2 min；5. 发表SCI收录文章8篇，申请发明专利3项；第二年1. 研制新型聚合物整体材料、硅胶整体材料和无机-有机杂化整体材料；2. 研究纳米材料富集和细胞培养代谢标记和二级质谱定量相结合的高精度定量技术、硼酸修饰

36、纳米材料富集糖基化修饰肽段和串联18O标记定量相结合的糖蛋白质定量技术，以及MRM结合可信肽段预测技术的低丰度目标蛋白质的定量技术；3. 发展固定化酶反应器的制备技术；建立磁球固定化酶18O酶促标记结合色谱保留时间依赖的智能化多反应检测质谱方法；将所建方法用于实际生物样本中目标蛋白质组的分析，对方法进行优化，建立高通量、低成本的蛋白质绝对定量新方法。4. 优化各级样品处理的条件，构建集成化蛋白质组在线样品预处理装置；研制通用性在线固相标记系统；构建基于多维色谱的蛋白质分离平台；1. 提供2-3种高效低残留的样品处理和分离整体柱；2. 实现1-2种复杂生物体系中低丰度蛋白质的定量分析、1-2种重

37、大疾病相关的组织/细胞中糖基化蛋白质的蛋白质水平和糖基化程度水平的同时定量以及几个低丰度目标蛋白质的高灵敏度、高准确度定量；3. 发展两种固定化酶技术；建立一种固定化酶18O酶促的蛋白质组标记以及色谱保留时间与多反应监测质谱结合对蛋白质组进行绝对定量的方法，实现目标蛋白质组和关键蛋白质的动态监测和绝对定量分析，并使绝对定量方法的误差小于10%；4. 在30 min内实现蛋白质组高效、快速、低损耗的在线变性、还原和酶解，并形成标准操作流程；制备2-3种通用型蛋白质或多肽捕集柱，并以此为反应器，在15 min内实现全蛋白质组的固相原位标记，标记效率达到90%；构建1-2种多维色谱蛋白质分离技术平台

38、，实现蛋白质组样品的高效、快速分离；5. 发表SCI收录文章19篇，申请发明专利4项；第三年1. 通过聚合物自组装技术，制备亲水的介孔/多孔聚合物材料；研制适于生物分子固载的亲水冷凝胶整体材料；2. 研究非同位素化学标记试剂及其用于蛋白质组相对定量新方法、支持新型化学标记试剂的标记定量策略的算法，以及化学衍生等高稳定的离子化技术；3. 建立双功能试剂的选择、改性方法，以及非同位素标记结合质谱分析的目标蛋白质绝对定量新方法；将所建方法用于实际生物样本的分析；4. 研制选择性在线固相标记系统；发展在线标记与分离鉴定系统的联用方法；发展固相衍生和激光诱导荧光检测联用技术；1. 提供1-2种低残留的样品处理聚合物材料和1种蛋白质均衡器基质材料；2. 筛选到1-2种合适的化学标记试剂，并建立蛋白质组相对定量的新方法；发展1-2种适于新型化学标记定量的新算法，以及1种提高肽段的质谱响应的新技术，为提高低丰度肽段定量稳