细胞杀伤力曲线测定

1、2012-10-10DMEM/F12培养基配制gibco D-MEM/F-12干粉培养基，每包装配1L。直接溶于1L纯净水中，加2.438g碳酸氢钠，搅拌2小时，pH试纸检测中性。0.22m滤器过滤180ml培养基入250ml血清瓶。5瓶180ml，1瓶不到180ml。其中1瓶180ml培养基加入FBS 20ml。2012-10-11CHO-S细胞复苏：41迅速溶解1min；2ml细胞液+6ml DMEM/F12 10%FBS加入离心管，轻柔吹散。离心1000rpm 5min；弃上清；加入3ml DMEM/F12 10%FBS，轻柔吹散,加入75ml细胞方瓶，补3ml DMEM/F12 10%

2、FBS；轻柔混匀，镜下观察，细胞密度85%-90%，细胞呈圆形悬浮；37 CO2培养；2012-10-12细胞观察：贴壁，90%密度；95%呈圆形，少量有梭型倾向，密度过高，决定传代；细胞传代：13:00弃上清；加入胰酶，2滴管（37回温）；室温显微镜下观察，有微量脱落，1min；倒出胰酶，加入5ml DMEM/F12 10%FBS，9区吹扫程序3次；1传2，补2.5ml DMEM/F12 10%FBS；原瓶中还有未脱落细胞，又加入5ml DMEM/F12 10%FBS继续培养，胶布标记。2012-10-13观察细胞状态：贴壁，有少量呈梭型，大部分为原型，但并不圆润。2012-10-15观察细

3、胞：大部分为梭型，少量为原型，约80%，培养基开始变浅。细胞传代：两瓶量多的1传2；2012-10-16观察细胞：传代时分散不好的细胞过夜培养后镜下观察，成团状生长，有展开细胞。换培养液：13:00未脱落细胞换液，生长良好。配PBS:NaCL 1.6g, KCL 0.04g, KH2PO4 0.04g, Na2HPO4.12H2O 0.726g, H2O 200ml, 高压灭菌。2012-10-17胰酶消化分散传代：PBS清洗2遍；胰酶侵润，立即倾倒或保持；显微镜下观察1min；加入5ml培养基；吹扫分散，1传2；2012-10-18细胞观察：尹骏传代的4瓶有2瓶没贴壁，我怀疑是第一次做的时候

4、胰酶消化的时间过长，损伤了细胞壁；（需要严格控制消化时间，尤其注意，胰酶在倒出后，应立即加入终止培养基。）我传代的6瓶贴壁生长正常，但还是有团块生长；（这种团块生长可能是第一次传代为吹匀所致，并不是第二次传代可以吹散的，计划降低接种比例，延长生长时间，逐步减少团块数量。）2012-10-19配制胰酶：life science进口分装胰酶；0.25%，100mlPBS溶解；0.22m过滤；冻存液配制：5%DMSO，250LDMSO，4750L含血清培养基。细胞冻存：选密度较高，展开细胞较多，团块较少的4瓶细胞消化冻存；倒掉培养基；2ml胰酶，室温60秒静置；倒掉胰酶；加入5ml培养基，9区吹扫，

5、液面下吹打80次；1000rpm离心5min；倒掉上清；加入冻存液；立即放入4，1h；-20，3h；液氮口过夜；装入液氮存储核；6B416B426B346B22其中有一只冻存管细胞较少，已标明。细胞传代：一瓶1传2；一瓶1:4传代。（新配的胰酶很好用，细胞容易打散）2012-10-20尹骏传代的两瓶贴壁不好的细胞今日换液，去除死细胞2012-10-21细胞观察：1:4传代的一瓶（原瓶）培养基变黄，细胞贴壁展开非常好，比其他几瓶都好，未见染菌。推测细胞展开良好，没有接触抑制，代谢旺盛，生长迅速。建议立即换液。细胞换液：1:4传代的一瓶（原瓶）2012-10-22细胞观察：前日培养基颜色变化很大的

6、一瓶细胞，换液过夜后颜色变化依然很大，并且细胞形态由展开向收缩发展，决定放弃。细胞传代：取三瓶细胞形态较好的1:4传代；共传6瓶，计划4瓶冻存，2瓶用于DNA提取；使用吸管吹散，细胞分离不完全，见2-8个聚集。培养基配制：从马格非分装血清中分出80ml，其中20ml加入180ml培养基中待用，60ml储存。细胞复苏：尹骏复苏了2012-10-19冻存的细胞一只。2012-10-24细胞观察：22日1:4传代细胞有聚集有展开，不是最佳状态，可能不适于冻存，原因可能是上次用吸管吹的力度比较小，为完全吹散；按照罗成的建议可以适当这延长消化时间，尽量减少吹打的损伤；胰酶消化和枪吹散哪种更损伤细胞？20

7、12-10-25细胞冻存：冻存4只细胞（有一只打破了还剩3只）冻存液配制：10%DMSO，400LDMSO，3600L含血清（10%）培养基。细胞冻存：倒掉培养基；PBS漂洗2遍；2ml胰酶，室温70秒静置；倒掉胰酶；加入5ml培养基，9区吹扫，液面下吹打80次；1000rpm离心5min，弃上清；加入1ml冻存液，迅速混匀；41h，-202h，液氮口过夜（绳子太长了接触到液氮了），放入液氮存储盒里，6B34/6B22/6C23。胰酶消化一瓶细胞，离心收集，用于全DNA提取。2012-10-25CHO-S全DNA提取：2012-10-26细胞传代：3ml吹扫，0.3:4.7接种；1ml枪弹簧很

8、松，吹打了110下，细胞基本分散；传代4瓶。2012-10-27细胞复苏：19:002012-10-25冻存细胞（10%DMSO）；离心管加入4ml培养基；细胞瓶加入2ml培养基：取出冻存细胞，42水浴，快速震荡，至融化。加入到含4ml培养基离心管；离心1000rpm，1min；弃上清；加入5ml培养基，短暂吹打，重悬；加入含2ml培养基细胞瓶，7ml过夜培养（加大对DMSO的稀释比例）。2012-10-28细胞观察：9:0027日复苏细胞有30%贴壁，呈圆形，未展开，分布均匀；26日传代细胞贴壁，50%展开，有少量悬浮，计划29日换液。细胞换液：对27日复苏细胞进行换液，为进一步降低DMSO

9、影响。2012-10-28引物稀释：8Lout加H2O 521l稀释为10M，分装3管10l；8Rout加H2O 636l稀释为10M，分装3管10l。2012-10-2926日传代细胞观察：26日传代细胞状态良好，展开率高。27日复苏细胞观察：27日复苏细胞基本没有分裂，形态介于展开间，形态异常2012-10-29Prime STAR PCR：buffer 10ldNTP Mix 4lCHO-S DNA(10/25) 1l8Lout 1l 8Rout 1l Prime STAR 1l H2O 32l1：95 5min2-30：94 30s 52 30s 72 30s31：72 5min 20

10、12-10-3026日传代细胞冻存：3只5B52/6B22/6C23传代4瓶：0.5:4.52012-10-302012-10-3130日传代细胞观察：有一瓶明显展开率偏低，还观察到一个异常的大细胞，内部有几个膨胀囊泡，用白胶布做标记。27日复苏细胞观察：随生长缓慢，但以开始展开，未见悬浮死亡。2012-10-31电泳：在500左右位置可见一相对高亮条带，但比较模糊，无法提取。见弥散性杂带，提高退火温度可以缓解。可条带貌似比500小，理论应该比500大。2012-11-130日冻存细胞复苏：30日传代细胞观察：异常的那瓶细胞出现死亡现象，漂浮细胞明显增多；计划下午三点对其余三瓶细胞换液。27日

11、复苏细胞观察：细胞形态趋于正常。2012-11-12012-11-22012-11-22012-11-330日传代细胞再传代：8瓶，1传4比例，用于冻存，建立野生型细胞库。2012-11-3CHO-DNA提取：1瓶细胞提2管，双倍的GB，70共40分钟，少量不溶胶状物用枪挑出，电泳可见条带。Prime STAR PCR：buffer 10ldNTP Mix 4lCHO-S DNA(11/3) 1l8Lout 1l 8Rout 1l Prime STAR 1l H2O 32l1：95 5min2-30：94 30s 58 30s 72 30s31：72 5min 10/31的PCR显示特异性和效

12、率不高，退火温度为52，本次11/4提高了退火温度到58，为见PCR条带，怀疑退火温度提高太大，引物Tm值为61到63，理论退火温度56。为了兼顾效率和特异性计划使用touchdown PCR。2012-11-4touchdown PCR1: 95 30s2-14: 94 30s 58-52 30s 72 30s14-32: 94 30s 52 30s 72 30s33: 72 5minPrime STAR PCR：buffer 10ldNTP Mix 4lCHO-S DNA 1l8Lout 1l 8Rout 1l Prime STAR 1l H2O 32l电泳未显示条带，发现有人将第二次基因

13、组提取时用的乙醇换成了TIRS，正是第二次提取的DNA两次PCR都没有条带。2012-11-510/30冻存11/1复苏转瓶：消化，分散，全转新瓶。2012-11-5用第一次提取的DNA进行PCR，Prime STAR和Taq两组，touchdown PCR条件。Prime STAR PCR：buffer 10ldNTP Mix 4lCHO-S DNA 1l8Lout 1l 8Rout 1l Prime STAR 1l H2O 32lTaq PCR：Buffer 5l MgCl2 5ldNTP 8l8Lout 1l 8Rout 1l CHO-S DNA 1lTaq 1lH2O 28l 1: 9

14、5 30s2-14: 94 30s 58-52 30s 72 30s14-32: 94 30s 52 30s 72 30s33: 72 5min目的条带亮度很低，与普通PCR条件相比目的条带附近杂带较少，而大分子量杂带较多。按照位置推算正确。做基因提取应该可以。考虑染色体结构庞大复杂，建议延长变性时间。条带回收：第二轮Prime STAR PCR：1：95 5min2-30：94 30s 52 30s 72 30s31：72 5min 2012-11-611/3传代细胞冻存：7只，有一瓶培养基变黄，与其他7瓶颜色明显不同，未见染菌，放弃；使用HYCLONE南美血清配制培养基，用于分散离心，用原

15、培养基配5%DMSO冻存；由于处理量比较大，先消化分散，加入离心管，带都操作完统一离心，后发现在离心管中停留的时间太长，细胞重新贴壁，离心后堆积较少，仔细观察壁上细胞较多，加入DMSO培养基重悬，不敢过长时间吹打，冻存细胞密度可能偏低。3C54 11/6, 5B52 11/6, 6B41 11/6, 6B42 11/6, 6B33 11/6, 6B34 11/6, 6C22 11/6 10/30冻存11/1复苏11/5全转新瓶细胞生长良好。2012-11-6回收：Taq PCR：Buffer 5l MgCl2 5ldNTP 8l8Lout 1l 8Rout 1l FUT81lTaq 1lH2O

16、 28l 1：95 5min2-30：94 30s 52 30s 72 30s31：72 5min 2012-11-7电泳：未成功2012-11-82012-11-92012-11-102012-11-112012-11-122012-11-13Taq PCR：Buffer 5l MgCl2 5ldNTP 8l8Lout 1l 8Rout 1l FUT81lTaq 1lH2O 28l 1：95 5min2-30：94 30s 52 30s 72 30s31：72 5min2012-11-13DH5甘油菌200l接种Amp LB 20ml 过夜37；2012-11-14电泳：切胶分离：回收：发现

17、比预期小的位置还有一条带，看强度应该是扩增所得，prime STAR扩增未见，第一次Taq扩增也未见，也可能是第一次电泳条带太浅，怀疑是非特异性扩增。两条带都回收，计划都进行测序。2012-11-14DH5保甘油菌；制作平板AMP 4块（其中1块不含抗性，3块含AMP）；每块20ml 4块80ml LBTryptone 0.8gYeast expract 0.4gNaCl 0.8g琼脂 1.6gDH5平板划线，过夜37。2012-11-15pMD18-T载体连接：Solution I 5lpMD18-T 1lFUT8-A 4l16过夜连接2012-11-15从平板上挑DH5单菌落接入20ml

18、LB，37过夜培养。2012-11-16（五）2012-11-16（五）取200l接入20ml LB，371.5-3h培养。4离心 6000rpm 5min。弃上清。600l预冷0.1M CaCl2重悬。冰浴30min。4离心 6000rpm 5min。弃上清。100l预冷0.1M CaCl2重悬。2012-11-17（六）转化：8T5/8T3 10l感受太细胞 100l冰浴 30min42 90s冰浴 2minLB 500l37 1h涂平板：过夜培养。2012-11-18单克隆摇菌管：过夜培养；2012-11-19甘油菌：8T5A/B/C，8T3A测序：结果异常2012-11-202012-

19、11-212012-11-222012-11-232012-11-242012-11-252012-11-262012-11-27新设计的引物：8LoutB，8RoutB；引物稀释：8LoutB：nmoles 25.3 0.253ml H2O 100M10l 90l H2O 10M20l 分装8RoutB：nmoles 18.6 0.186ml H2O 100M10l 90l H2O 10M20l 分装Prime STAR PCR：buffer 10ldNTP Mix 4lCHO-S DNA 1l8Lout 1l 8Rout 1l Prime STAR 1l H2O 321：95 5min2-

20、30：94 45s 53 30s 72 30s31：72 5min 电泳：2012-11-28处理细胞培养用品：2012-11-29（四）处理细胞培养用品：高压，烘干。配PBS：PBS配制：200mlNaCl 1.6gKCl 0.04gKH2PO4 0.04gNa2HPO4.12H2O 0.726gorNa2HPO4 0.58g高压灭菌。2012-12-3（一）过夜贴壁换液：hyclonen南美FBS观察（复苏后12h）：感觉培养基变色较快,但未见染菌现象；部分细胞贴壁，但倒出液体后，发现一些细胞又被倒出，可能贴壁不牢固；有待后续观察。2012-12-4（二）2012-12-5（三）换液：hy

21、clonen南美FBS观察（复苏后60h）：培养基颜色未见更显著变化；贴壁细胞已分裂，形成群落，约<10个细胞，细胞形态未全部展开。2012-12-6（四）100mg/ml G418配制：1g G418加10ml PBS（直接溶在原瓶中），过滤分装1.5ml EP管，-20保存。细胞观察：消化换瓶：冷胰酶消化70秒，1 ml 移液器吹扫100下。2012-12-8（六）细胞换液：1700-1800一多半细胞形态正常一些圆形未展开的细胞上有小突触还有散在的S行管状那个S型的东西我前些天看看到过 但只找到一个 还以为是什么杂质 但今天明显增多了2012-12-9（日）细胞观察：培养基变色较快，漂浮单细胞增多，为展开贴壁细胞比以前同期多，展开细胞形态正常贴补层状态良好，未见大面积脱落及成团漂浮初步排除大面积染菌的可能。乐观的解释是，在最近的24小时中，细胞进入对数增长期，培养基养分过快消耗，造成一些细胞脱落和培养基变色。如果传代后恢复正常状态，就能支持这种解释。下一步计划，传代1:4、铺板、保存原瓶细胞次日用于提取DNA。消化细胞：1:4传代铺板：0.30.4