食品中微生物的检验

1、食品中微生物的检验一、概念和分类微生物并不是生物学分类学上的专门名词，而是对所有形体微小，单细胞的或个体结构较为简单的多细胞的、甚至没有细胞结构的低等生物的统称。微生物群体非常庞杂，种类繁多，包括细胞型和非细胞型两类。凡具有细胞形态的微生物称为细胞型微生物。细胞型微生物按细胞结构又分为原核微生物和真核微生物。 原核生物的主要特点：细胞内有明显的核区，但没有核膜包围；核区内含有一条双链DNA构成的染色体；能量代谢和很多合成代谢均在质膜上进行，核糖体分布在细胞之中；相对于原核微生物，真核微生物的细胞结构有了真正的细胞核,有多种细胞器；而病毒则不具有细胞结构，由核酸和蛋白质组成，可以认为是超显微的、

2、没有细胞结构的、专性活细胞内寄生的实体。它们在活细胞外具有一般化学大分子的特征，在宿主细胞内又具有生命特征。可以作为了解的是，病毒可以通过细菌滤器，且对抗生素不敏感，对干扰素敏感。二、细菌、霉菌、酵母菌和致病菌介绍细菌的细胞结构在原核生物中具有代表性，主要由细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等部分构成,有的细菌还有夹膜、鞭毛、菌毛等特殊结构。在自然界中细菌是分布最广、数量最多的一类生物，并与食品关系最为密切。是食品理论、工业发酵和酿造研究的主要对象，也是导致食品腐败的主要类群。细菌的基本形态有球状、杆状和螺旋状,分别被称为球菌、杆菌和螺旋菌。霉菌是一些丝状真菌的统称。在自然界分布极广，它的营养来源

3、主要是糖类和少量氮、矿物盐等，极易在含糖的食品、饼干、面包和各种谷物、水果上生长。经常会有食品会因为发生霉变而不能食用，还有些霉菌会产生毒性很大的毒素，比如黄曲霉素、黄米毒素、杂色曲霉素和展青霉素等等，都可能导致癌症，这类霉菌在大米和花生中最多。由此，对霉菌的检测尤为重要。霉菌菌体是由分支或不分支的菌丝组成，菌丝细胞均由细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、线粒体、核糖体以及内含物组成。在固体培养基上，部分菌丝深入培养基内吸收养料，称为营养菌丝；另一部分则向空气生长，称为气生菌丝；有的气生菌丝发育到一定阶段分化为繁殖菌丝。霉菌的菌落一般比细菌菌落大几倍到几十倍，同一种霉菌，在不同成分的培养基上形成的

4、菌落特征可能有变化，但各种霉菌，在一定的培养基上形成的菌落大小、形状、颜色等却相对稳定。菌落特征也是鉴定霉菌的重要依据之一。酵母菌多数为单细胞，一般呈圆形、椭圆形、圆柱形或柠檬形，也有些酵母菌细胞与其子代细胞连在一起成为链状，形成假菌丝，称为假丝酵母。酵母菌在适宜的培养基上形成的菌落与细菌相似，但比细菌菌落大而且厚，菌落表面湿润、粘稠、易被调起，有些种因培养时间太长使菌落表面皱缩。三、培养基（北京陆桥）1、微生物的营养微生物同其他生物一样，需要不断地从外部环境中获取营养，才能够维持生命。微生物细胞主要有水、有机物和无机盐等化学成份组成，不同的微生物种类其细胞的化学组成也不相同，而且含量也有差异

5、。因此，维持微生物生长所需要的化学元素的种类与含量也不相同。一般来说细胞含有某种元素的量高则细胞对这种元素的需要量也就大，含量低则需要量也小。这也是为什么我们不同的微生物培养要选择不同的培养基。另外，同一种微生物在不同的培养基上的菌落形态也有差别，所以在选择培养基是要注意。微生物所需要的营养物质按照它们在机体中的生理作用不同，可以分为碳源、氮源、无机盐和生长因子四种类型。能被微生物用来构成细胞物质的或代谢产物中碳（氮）素来源的营养物质称为碳（氮）原物质；无机盐为微生物机体提供金属元素；有些微生物在含有氮源、碳源、无机盐的培养基上人不能生长，而需要添加某些生长因子，满足生长的需要，比如维生素、氨

6、基酸、嘌呤碱基等。我们经常用到营养物质：单糖、淀粉等（碳源）；尿素、硫酸铵、蛋白胨、牛肉膏等（氮源）；硫酸锌等（无机盐）。2、培养基配制培养基是人工配制的合适于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，是进行微生物培养的基础。配制培养基需要遵循一定的原则：第一，根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基；自养型微生物合成能力强，可以利用简单的无机物质合成复杂的细胞物质，其培养基可以由简单的无机物质组成。而异样型微生物合成能力差，不能以无机物质作为唯一营养源，就要在培养基中添加一些有机物质（比如葡萄糖等）。另外细菌和酵母菌对培养基的要求也不同，细菌一般用牛肉膏蛋白胨培养基培养，而酵母菌则用麦芽汁

7、培养基培养。第二，注意各种营养物质的浓度和配比；微生物生长所需要的营养物往往是在浓度合适的条件下才表现出良好的作用，浓度大时反而对微生物生长期抑制作用。微生物只有在适合生长的条件下，才表现出应有的形态特征，而不适合的条件下生长，会是微生物的形态特征发生改变。第三，将培养基的pH控制在一定的范围之内，满足不同类型微生物的生长繁殖或积累代谢产物。各种微生物生长的最适pH各不相同，一般来说，细菌生长的pH在中性和微碱性之间（pH在7-7.5），酵母菌和霉菌生长的pH值通常是偏酸的（pH在4.5-6）。另外由于微生物在生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，会改变培养基的pH值，如

8、果不及时控制，往往会导致生长停止。因此，为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐。3、培养基的类型及应用培养基的种类很多，按培养基组成物质的化学成分分为合成培养基和天然培养基；根据物理状态不同分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基（常用凝固剂有琼脂、明胶和硅胶，硅胶是由无几的硅酸钠和硅酸钾被盐酸及硫酸中和时凝聚而成的胶体，不含有机物，因而适合于用来分离和培养自养型微生物）；根据培养基的特殊用途，可将培养基分成基础培养基、加富培养基、选择培养基、鉴别培养基等。基础培养基：含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基；加

9、富培养基：在普通培养基上加入其他营养物质，用以培养某种或某类营养要求苛刻的一样微生物；选择培养基：根据某种或某一类微生物的特殊营养需求或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的一类培养基。利用这种培养基可以将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。比如，我们在培养基中加入青霉素或者四环素等抗生素（生长抑制剂，抑制细菌和放线菌生长），可以分离酵母菌和霉菌；通过在培养基中加入结晶紫或提高培养基中氯化钠的浓度（7.5%），可以从混杂的微生物群体中分别分离出革兰氏阴性菌或葡萄球菌；加孔雀石绿可以分离出革兰氏阳性菌。鉴别培养基：在普通培养基内加入某种试剂或化学药品，使得某种微生物在这个培养基上生长后，

10、可以产生某种代谢产物，这种代谢产物可以与培养基中的特定试剂或化学药品起反应，产生某种明显的特征性变化。根据这种特点来区分微生物。比如：大肠菌群测定中，液体培养基中加入溴甲酚紫和发酵管，来指示微生物生长过程中是否产酸产气；伊红美蓝培养基是一种鉴别培养基，常用于检查乳制品和饮用水中是否含有致病性的肠道细菌，伊红为酸性染料，美蓝则为碱性染料。当大肠杆菌发酵乳糖产生混合酸时，与伊红染色，再与美蓝结合生成紫黑色化合物。在此培养基上生长的大肠杆菌形成呈紫黑色带金属光泽的小菌落。而产气杆菌则形成呈棕色的大菌落。不能发酵乳糖的细菌产碱性物较多，带负电荷，与美蓝结合，被染成蓝色菌落。还可以加入明胶，看液化明胶的

11、情况。四、微生物检验食品中的微生物检验项目主要有四个：菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母菌、致病菌。其中致病菌又主要包括沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌。首先，我们看一下菌落总数的测定。我们先弄清楚几个概念什么是菌落、菌落总数和细菌总数？我们都知道单个细菌用肉眼是看不见的，但是，当单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，便会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。而菌落总数就是指食品经过检样处理，在一定条件下进行培养后（如培养基成分、培养温度和时间、PH、需氧性质等），所得1mL（g）检样中所含菌落的总数。更确切地说即在需氧情况下，36±1培养48h，能在普通营养

12、琼脂平板上生长的菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。可见把菌落总数就等同于细菌总数是不确切的。我们可以看看长在营养琼脂平板上最常见的菌落形态，当然并不是所有的菌落都会长的这么规则，而且也不是所有的菌落都会长的这么大，像葡萄酒、水这样的样品长出的菌落就会很小。这就需要我们借助放大镜来观察，防止漏数菌落数。弄清这几个概念后，我们就来看一下菌落总数测定的具体操作步骤：（1）以无菌操作，将检样25g(25ml)剪碎放

13、于含有225ml，灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器以8000-10000r/min的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液。（2）用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，做成1：100的稀释液。（3）另取1ml灭菌吸管，按上面操作顺序，做10递增稀释液，如此每增加一次，即换用1支1ml灭菌吸管。（4）根据样品卫生标准要求或对样本污染情况进行估计，选择2-3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该

14、稀释度的吸管移1 ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。（5）稀释液移入平皿后，应及时（从检样稀释到倾注平板不超过20min）将凉至46左右营养琼脂培养基注入平皿内15ml，并转动平皿使混合均匀。同时，将营养琼脂培养基倾入不加有1ml稀释液的灭菌平皿内作空白对照。（6）待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1温箱内培养48±2h，。取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。 在操作过程中要注意几个事项：1.操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行灭菌处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包

15、装开口处擦拭后取样。操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。2采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。3.倾注用培养基应在46水浴内保温，温度过高会影响菌的生长，过低琼脂易于凝固而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。4.倾注培养基的量规定不一，从1220ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。5.为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两

16、个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。6为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4环境中放置，以便计数时作对照观察。 7.在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。 8.吸管上端要塞上棉花，避免交叉污染；棉花塞得不宜过紧也不能过松。 9.倒培养基前，瓶口要过火焰。 10.做空白对照，顺便可以鉴定一下你的器皿、培养基以及水是否灭好菌了。 11.平板一定要倒置放入培养箱里，因为培养箱内环

17、境温热，培养基内水份充足，培养过程中会形成水份，蒸发，遇到平板的顶部会凝聚形成水珠，这时如果不倒置，会滴到培养基表面，使琼脂表面湿润，细菌就会长“糊”了，从而不利于形成菌落。 培养完后还要进行菌落计数的报告，这点也很重要，前面的工作做的再好，不会计数或是记得不准确前面的一切都是徒劳。（1）平板菌落数的选择 选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准，一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌数生长时，则不宜采用，应以无片状菌数生长的平板柞为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2代表全皿菌落数，平皿

18、内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线）若仅有一条链，可视为一个菌落，如有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。（2）稀释度的选择1.应选择平均菌落数在30300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之（见表1中例1）。2.若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30300之间，则视两者之比如何来决定若其比值小于或等于2，应报告其平均数；

19、若大于2则报告其中较小的数字（见表1中例2及例3）。3.若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中例4）。4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中例5）。5.若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之（见表1中例6）.6.若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1例7）。（3）菌落数的报告 菌落数在100以内时，按其实有数报告；大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后

20、面的数值，以四舍五入的方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示（见表1）。例次稀释液及菌落数两稀释液之比菌落总数cfu/g(mL)报告方式cfu/g(mL)10110²1031多不可计164201640016000或1. 6×1042多不可计295461.63775038000或3.8×1043多不可计271602.22710027000或2.7×1044多不可计多不可计313313000310000或3.1×104527115270270或2.7×10260001×10107多不可计305123050031

21、000或3.1×104微生物检测的第二个重要指标就是大肠菌群的测定，大肠菌群系指一群在37度能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群系以100mL（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。大肠菌群MPN是采用一定的方法，应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近似数值。大肠菌群MPN常规的检验方法有三管系列、五管系列和其它系列，最常用的是三管系列，也有采用五官系列的，像生活饮用水中总大肠菌群的测定采用的就是五官系列。其原理相同，区别在于接种样品

22、的稀释度和各稀释度的管数，三管系列接种三个稀释度、每个稀释度三管、五管系列接种五个稀释度、每个稀释度五管。以三管系列较为简便。那我们就以三管系列为例说说大肠菌群测定的步骤，其实食品中微生物的检测首先第一步都是要进行检样处理，然后根据样品标准中微生物的限量及污染程度，选择合适的稀释度，根据要培养的菌种选择适宜的培养基及时间、温度等。前面我们已经讲过菌落总数测定的检样过程，就不重复了，我们看下面的操作，将处理好的样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1m1及1m1以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，每一稀释度接种3管，置36±1温箱内，培养24±2小

23、时，如所有乳糖胆盐发酵管均不产气，则可报告为大肠菌群阴性。如有产气者，按下列程序进行。分离培养：将产气的发酵管分别转种到伊红美兰琼脂平板上，置36±1温箱内培养1824小 时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 证实试验：对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。由于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面与大肠菌群的检出率密切相关。国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有绿色金属光泽或无金属光泽时，检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤

24、其当菌落不典型时，很难避免假阴性的出现。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。将挑取的可疑大肠菌群菌落进行革兰氏染色。同时接种乳糖发酵 管，置36±1温箱内培养24±2小时，观察产气情况，凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。到这里我们就要了解一下什么是革兰氏染色？革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，通过这一染色，可把几乎所有的细菌分成革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌两大类，因此它是分类鉴定菌种的重要方法。我们来看看这种方法的步骤：细菌先经碱性染料结晶紫溶液初染后，分别染上紫色，而经碘液媒染，结晶紫就

25、与碘分子形成了一个分子量较大的染色较牢固的复合物。接着用95%酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，脱色后再用一种红色染料如碱性番红等进行复染，前者仍带紫色，后者则被染上红色。因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G）。有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现阴性反应。染色反应的主要依据就是革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不

26、易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色。另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应。此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。所以脱色时间，脱色方法也应严格控制。革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：）涂片干燥固定。涂片不宜过后，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热否则会改变甚至破坏细胞形态

27、。）草酸铵结晶紫染1分钟。）自来水冲洗。）加碘液覆盖涂面染1分钟。）水洗，用吸水纸吸去水分。）加95%酒精数滴进行脱色，直至流出的乙醇无紫色，立即水洗，吸去水分。结果是否正确，这步是关键。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间为2030秒。）番红染色液（稀）染1分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。染色的结果，革兰氏阳性反应菌体都呈紫色，阴性反应菌体都呈红色。证实实验完成后就可以进行报告了，报告：根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN的检索表(见表)，报告每100ml(g)大肠菌群的最近似数(MPN)。阳性管数MPN 100mL(g)1mL(g)×30.1

28、mL(g)×30.01mL(g)×300030001300026000390010300116001290表内所列检样量如改用10、1、0.1时，则表内数字应相应降低10倍；如改用0. 1、0.01、0.001时，则表内数字应相应增加10倍。标准中还提到了粪大肠菌群的检出，它从属于大肠菌群，我在这里简单地给大家提一下，用接种环将前面讲述的操作中所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物转种于EC肉汤中，置44.5±0.2水浴箱内培养24±2h,培养后不产气则报告为阴性；将产气的EC肉汤管分别转种于EMB上，培养1824h，凡平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性

29、。报告同上。 微生物检验还有两个重要指标就是霉菌、酵母的计数及致病菌的检验，因为企业的出厂检验微生物这块主要是菌落总数和大肠菌群，所以后两个指标我就给大家简单介绍一下，让大家了解一下。霉菌和酵母的培养可以使用同一种培养基，通过长出的菌落形态特征来判断计数，霉菌最显著的特征就是一般有菌丝，不规则无固定大小，最初往往是白色或浅色，当长出孢子后就成好多颜色，像红色、绿色、黑色等等。而酵母菌一般比较光滑，隆起，多为乳白色，少数有红色，与细菌菌落特征相似。一般使用的培养基是孟加拉红，检样操作和前面一样，但是培养霉菌要求稀释样品要充分振摇30min以上，还要反复吹吸50次，一是霉菌孢子充分散开。检样完毕后

30、选择合适的稀释度，取1mL稀释液加到平板内，加入培养基待凝固后倒置放入2528的培养箱内，3天后开始观察，共培养观察5天。然后选择菌落数在10150之间的进行报数，稀释度的选择及菌落的报告方式都可参照菌落总数报出方式。我们再来说说致病菌的检验，主要的是三种沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌。我们以沙门氏菌为例简单的介绍一下操作，致病菌的检测第一步都要进行增菌，将25g样品加入到225mL缓冲蛋白胨水（BP）中于36±1培养4h,取10mL加入到100mL四硫酸钠煌绿增菌液(TTB)内于42培养18h24h,同时，另取10mL于100mL亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液内于36±

31、1培养18h24h。分离，取增菌液划线接种一个亚硫酸铋（BS）琼脂和一个HEKTOEN氏肠道菌（HE）琼脂上，于36±1培养18h24h，BS 上培养4048h。根据沙门氏菌在每种培养基上菌落形态挑取典型的可疑菌落(BS上产硫化氢的菌落呈褐色，灰色或黑色，有时带有金属光泽。有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色的菌落，周围培养基不变；HE上菌落呈兰绿至兰色，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可呈现大的光泽黑色中心或几乎全部黑色的菌落，多数产硫化氢)进行生化试验接种到三糖铁上，于36±1培养18h24h，通过在TSI内的反应来判定，然后进一步进行血清学的鉴定。我们都知道微生物的检

32、测最主要的就是要保证无菌操作，只有这样才能保证出具数据的真实性和可靠性。下面讲的内容就是怎样做才能保证数据的准确。首先我们来区别两个概念，消毒和灭菌这两个词在实际使用中常被混用，其实它们的含义是有所不同的。消毒是指应用消毒剂等方法杀灭物体表面和内部的病原菌营养体的方法，而灭菌是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物，使之呈无菌状态。从概念中我们就能看出来我们在做微生物的试验是要进行前期的灭菌工作，而不是简单的消毒。我们就来看看通常采用地灭菌方法：一、物理方法：有高温、辐射、超声波、激光、过滤等等，在实验室中最常用的就是高温灭菌和辐射灭菌。1、高温利用高温进行灭菌、消毒或防腐，是最常用

33、而又方便有效的方法。高温可使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，从而起灭菌作用，不光是高温可以杀菌，通常低温也可以起抑菌作用，所以我们可以把预先配好的培养基放到冰箱里进行保存。高温灭菌包括干热灭菌法和湿热灭菌法，在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好，这是因为一方面湿热易于传递热量，另一方面由于湿热更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键结构，从而加速蛋白质变性而迅速死亡。）干热灭菌法:a.灼烧灭菌法：利用火焰直接把微生物烧死。此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物品，所以使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及放培养基的瓶口，检样使用的剪子镊子等。b.干热空气灭菌法：即把待灭菌的物品均匀地放入

34、烘箱中，升温至160°C，恒温1小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。这一般这可以用来烘干灭好菌的平板和吸管。）湿热灭菌法:多数细菌和真菌的营养细胞在60左右处理510分钟即可杀死，酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用80以上处理才能杀死，而细菌的芽孢最耐热，一般要在120下处理15分钟才能杀死。这就是为什么器皿及蒸馏水的灭菌都要在121高压灭菌15分钟以上，而一般的培养基灭菌也都采用121高压灭菌15分钟。湿热灭菌法包括常压法和加压法。常压法：a.巴氏消毒法：有些食物会因高温破坏营养成分或影响质量，如牛奶、酱油、啤酒等，所以只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持食物

35、的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。该法一般在6085处理15秒至30分钟既可达到消毒目的。此法为法国微生物学家巴斯德首创，故名为巴氏消毒法。b.煮沸消毒法：直接将要消毒的物品放入清水中，煮沸数分钟，即可杀死细菌的全部营养和部分芽孢。此法适用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。c.间歇灭菌法：适用于不耐热培养基的灭菌。具体做法是：将待灭菌的培养基在80100°C蒸煮1560分钟，杀死其中所有微生物的营养细胞。然后置室温或放入37°C恒温箱中过夜，诱导残留的芽孢发芽。第2天再重复上述步骤，三次左右，就可达到灭菌的目的。此法不需加压灭菌锅，但操作麻烦，所需时间长。加压法：常

36、规加压灭菌法和连续加压灭菌法 常规 加压灭菌法：这是发酵工业、医疗保健、食品检测和微生物学实验室中最常用的一种灭菌方法。它适用于各种耐热、体积大的培养基的灭菌，也适用于玻璃器皿、工作服等物品的灭菌。常规加压蒸汽灭菌是把待灭菌的物品放在一个可密闭的盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅中，把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的空气彻底驱尽后将锅密封。再继续加热就会使其中压力升高。由于蒸汽压的上升，从而温度也随之提高到100以上。在蒸汽压达到1kg/厘米2时即0.1MPa，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121°C。在这种情况下，微生物（包括芽孢）在1520分钟便会被杀死，而达到灭菌目的。如灭菌的对象是砂土

37、、石蜡油等面积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长灭菌时间。在加压蒸汽灭菌中，要引起注意的一个问题是，在恒压之前，一定要排尽灭菌锅中的冷空气，否则表上的蒸汽压与蒸汽温度之间不具对应关系，这样会大大降低灭菌效果。2影响加压蒸汽灭菌的因素a.不同的微生物或同种微生物的不同菌龄对高温的敏感性不同。多数微生物的营养体和病毒在5065°C，10分钟就会被杀死；但各种孢子、特别是细菌芽孢最能抗热，要在121°C，15分钟才被杀死。对同种微生物来讲，幼龄菌比老龄菌对热更敏感。b.微生物的数量多少显然会影响灭菌的效果，数量越多，热死时间越长。c.灭菌对象PH的影响 PH6.08.0时，微

38、生物较不易死亡；PH6.0时，最易引起死亡。d.灭菌锅内空气排除程度的影响 原理是在驱尽锅内空气的前提下，通过加热把密闭锅内纯水蒸汽的压力升高而使蒸汽温度相应提高，也就是说是依靠温度而不是压力达到灭菌的目的。因此，在一切利用加压蒸汽灭菌法的场合下，必须做到彻底排除灭菌锅内的残余空气。e.灭菌对象的体积 灭菌对象体积的大小会影响热的传导速率。3灭菌对培养基成分的影响 除对培养基中的淀粉成分有促进糊化和水解等少数有利影响外，很多是不利因素：a.pH值改变，普遍下降。b.产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反应而产生混浊或沉淀。例如Ca+2与PO4-3化合，就会产生磷酸钙沉淀。c.破坏营养，

39、提高色泽，不少培养基颜色加深。d.体积和浓度有所变化，降低浓度气温低时会增加冷凝水。可以采用特殊加热灭菌的方法消除有害影响，像对含有在高温下易破坏成分的培养基，如含糖组合培养基，可进行低压灭菌15分钟，所以像我们培养大肠菌群所用的乳糖胆盐培养基就是采用了1150.07MPa左右灭菌15分钟。、辐射利用辐射进行灭菌消毒，可以避免高温灭菌或化学药剂消毒的缺点，所以应用越来越广，目前主要应用在以下几个方面：）像微生物实验室、超净工作台都应用紫外灯杀菌。避免紫外灯的照射，打开时人员要离开。）还有应用射线作食品表面杀菌，射线用于食品内部杀菌。经辐射后的食品，因大量微生物被杀灭，再用冷冻保藏，可使保存期延

40、长。、过滤采用机械方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子，做成各种过滤器。通过过滤，只让液体培养基从筛子中流下，而把各种微生物菌体留在筛子上面，从而达到除菌的目的。这种灭菌方法适用于一些对热不稳定的体积小的液体培养基的灭菌以及气体的灭菌。它的最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分。但是比细菌还小的病毒仍然能留在液体培养基内，有时会给实验带来一定的麻烦。二、化学方法一般化学药剂无法杀死所有的微生物，而只能杀死其中的病原微生物，所以是起消毒剂的作用，而不是灭菌剂。能迅速杀灭病原微生物的药物，称为消毒剂。能抑制或阻止微生物生长繁殖的药物，称为防腐剂。但是一种化学药物是杀菌还是抑菌，常不易严格区分。消

41、毒剂在低浓度时也能杀菌（如1：1000硫柳汞）。由于消毒防腐剂没有选择性，因此对一切活细胞都有毒性，不仅能杀死或抑制病原微生物，而且对人体组织细胞也有损伤作用，所以只能用于体表、器械、排泄物和周围环境的消毒。常用的化学消毒剂有：石碳酸、来苏水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。像在做试验时可以用75%的酒精对手进行消毒。为了保证灭好菌的器皿和培养基不被污染都要将口包好密封，而且为了避免微生物的滋生和繁殖，做完实验的器具必须先进行灭菌再洗刷。总之微生物检验既要保证环境的无菌又要保证操作规范不引入外来菌。我想在座的各位其中应该有罐头生产企业，罐头的微生物检验要求商业无菌，那我简单的介绍一下商业无菌

42、的检测。首先打开一罐测一下PH值，PH值等于或小于4.6的为酸性罐头，大于4.6的为低酸性罐头，然后最少取3罐进行保温，低酸型于36±1保温10天，酸性的于30±1保温10天。保温过程中每天观察，如有胖听或泄漏等现象，立即剔出作开罐检查。胖听是由于罐头内微生物活动或化学作用产生气体，形成正压，使一端或两端外凸的现象。泄漏是罐头密封结构有缺陷，或由于撞击而破坏密封，或罐壁腐蚀而穿孔致使微生物侵入的现象。开罐检查包括PH测定，看与开始时有否显著差异；感官检查，外观、色泽、状态、气味等进行观察和嗅闻、用餐具按住食品或戴薄纸套以手指触感，鉴别是否腐败变质。对感官或PH检查结果认为可

43、疑的，进行涂片染色镜检。若是出现胖听、泄漏或开罐检查发现PH、感官异常、腐败变质，进一步镜检发现有异常，均应及时进行微生物接种培养。以上就是我对食品中微生物检测的一些总结和个人的理解和积累，希望对大家有所帮助。谢谢大家！ 第三节致病性微生物食品首先是应考虑其安全性，其次才是可食性和其他，食品中一旦含有致病性微生物，其安全性就随之丧失，当然其食用性也不复存在了；各国的卫生部门对致病性微生物都作了严格的规定，把它作为食品卫生质量的最重要的指标。一、食品中常见的致病性微生物食品生产是一个时间长、环节多的复杂过程。总之，与食品有直接和间接关系的致病性微生物都可能污染食品。（以乳制品为例）1、能引起人类

44、疾病和食物中毒的致病性微生物：沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、副溶血性弧菌，口蹄疫病毒等。2、能产生毒襄并引起食物中毒的微生物：肉毒梭菌、葡萄球菌和产气荚膜杆菌，也包括一些真菌，都会产生毒素。二、食品中致病性微生物的检验1、致病性微生物的检验按照国家统一的方法进行检验。2、特例：在加工食品中能够存活下来的致病性微生物注往受到了某种程度的损伤，它们会受到增菌液中抑制剂的影响而不能被检测出来。因此，需要进行前增菌，以帮助致病菌恢复到正常状态。前增菌的适宜方法和使用的培养基则因食品的理化性质、加工方法不同而异。以检验沙门氏菌为例，干蛋品中的细菌用缓冲蛋白胨水进行前增菌，脱脂乳粉中的细菌用煌绿水进行前增菌

45、，全脂乳粉则用灭菌蒸馏水进行前增菌，椰子用乳糖肉汤，干酵母用胰酪胨大豆肉汤前增菌。第四节细菌相与食品卫生的关系1、细菌相：指存在于某一物质中的细菌种类及其相对数量的构成。食品中的各种细菌就构成了该食品的细菌相，水中的细菌构成了水的细菌相。细菌相是对细菌的种类面言，在菌相中相对数量较大的一种或几种细菌被称为优势菌。2、嗜冷菌：这类细菌在接近0时生长得比较好，最适温度为10一20，最高温度在30一35。3、嗜温菌：这类细菌都能在25气40迅速生长，在55不生长。4、嗜热菌：这类细菌生长范围为4375，最适为50C一55C，在32C以下很难生长。嗜温菌和嗜热菌的一些细菌在生长温度范围上有重迭，产生芽

46、胞的细菌尤其如此。一、细菌相对食品卫生质量的影响1、新鲜畜禽肉的细菌相：主要是嗜温菌，包括大肠菌群、肠球菌、金黄色葡萄球菌、魏氏梭菌和沙门氏菌等。新鲜肉类的细菌相以嗜温菌为主，在温度适宜时，嗜温菌会大量繁殖造成肉的变质，同时发生臭味；在冷藏条件下，嗜温菌生长很慢甚至不生长，嗜冷菌开始大量繁殖，逐渐成为优势菌，最后会导致肉表面形成粘液并产生气味；在冷冻条件下，所有的细菌都不再生长繁殖，因而可以较长期保存而不变质。2、液体蛋晶的细菌相：主要是革兰氏阴性菌，包括假单胞菌属、产碱杆菌属、变形菌属和埃希氏菌属等。3、鲜鱼的细菌相以嗜冷菌为主，有假单胞菌属、黄色杆菌属和弧菌属等。如在水产品中发现了沙门氏菌

47、，一般认为是外来污染，应对该产品的生产，加工过程进行分析、检测，从而找到污染源。二、食品的正常菌相和细菌数量食品及原料都有正常的细菌相，它们因受多种因素的影响，其种类和数量有很大差别。1、鲜肉的细菌相以嗜温菌为主，其次为嗜冷菌。加工良好的鲜肉细菌数为103个g左右，如加工不良会达到106个g，肉制品的细菌数约为103104个g，大肠菌群MPN为10102个100g，金黄色葡萄球菌为10-102个g。2、鲜蛋的细菌相以革兰氏阳性球菌为主，革兰氏阴性杆菌数量很少。3、液体蛋晶的细菌相是革兰氏阴性菌，包括假单胞菌属、产碱杆菌属、变形菌属和埃希氏菌属，细菌数量一般为104106个g，大肠菌群为1031

48、05个100g，沙门氏菌为1100个g。、无菌操作培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。图5斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞志贺氏菌的检验一、增菌称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36培养68h。培养时间视细菌生长情况而

49、定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。二、分离和初步生化试验取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各1个，于36培养1824h。 志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36培养1824h，分别观察结果。下述培养物可以弃去：a.在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；b.在1824h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；c.不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；d.产气的培养物；e.有动力的培养物；f.产生硫化氢的培养物。凡是乳糖、蔗

50、糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。三、血清学分型挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用115各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝

51、集，可用痢疾志贺氏菌312型多价血清及各型因子血清检查。四、进一步的生化试验在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：葡萄糖铵西蒙氏柠檬酸盐赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶pH7.2尿素KCN生长水杨苷和七叶苷的分解除宋内氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。必要时还应做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5%乳糖发酵甘露醇棉子糖甘油的发酵靛基质试验志贺氏菌属4个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特性与

52、A群或C群相似。五、结果报告：综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。 金黄色葡萄球菌的检验我们以SN标准中的最近似值(MPN)测定法来进行讲解：这种方法适用于检测认为带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的食品中的少量金黄色 葡萄球菌。 1、样品制备：固体或半固体食品: 以无菌操作称取25g样品,放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌均 质杯内,于8000r/min均质12min,制成1:10样品匀液。 液体食品: 用灭菌吸管吸取25mL样品,放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内 (瓶内预置适当数量的玻璃珠),经充分振摇制成1:10样品匀液。 供计数检验时,可按十进位递

53、增稀释法将样品匀液再进行适当稀释。2、选三个连续稀释度，从每个稀释度分别取1 mL稀释样品液，接种3管含10氯化钠why? 还记得么？ 金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。 因此，这事实上是一种选择性的增菌。胰蛋白胨大豆肉汤。样品的最高稀释度必须达到能获得阴性终点,置36±1培养48 h。 3、用3 mm接种环,从有细菌生长的各管中移取1 环,划线接种于表面干燥的Baird- Parker琼脂平板,置36±1培养4548h。 4、从有细菌生长的每一平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落,移种到肉汤培养基中,置36±1培养2024 h

54、。 5、取肉汤培养物0.3mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆于8mm×100mm试管内充分混合,置 36±1培养,定时观察是否有凝块形成,至少观察6 h,以内容物完全凝固,使试管倒置或 倾斜时不流动者为阳性。试验中需同时做巳知阳性和阴性对照。对可疑结果,应进行革兰氏染色、镜检和其他辅助试验如耐热核酸酶试验等 加以证实。6、报告结果：根据凝固酶试验结果查最近似值(MPN)表,报告金黄色葡萄球菌 的MPN/g (mL)。 志贺氏菌的生物学特性志贺氏菌属（Shigella） 的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率

55、甚高。志贺氏菌和大肠杆菌都属于肠杆菌科，根据DNA杂交研究结果表明，志贺氏菌属的四个种和大肠杆菌属在生化上是难以区分的，因为有产气的志贺氏菌，也有乳糖阴性、不产气、不运动的大肠杆菌，有些大肠杆菌也能引起痢疾状的腹泻。志贺氏菌的形态学特征：志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3 m ,宽0.5-0.7 m 。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，不运动，有菌毛。志贺氏菌的培养特性：需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37，最适pH为6.4-7.8。37培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，宋内氏菌

56、菌落一般较大，较不透明，并常出现扁平的粗糙型菌落。在液体培养基中呈均匀浑浊生长，无菌膜形成。志贺氏菌的生化特性：本菌属都能分解葡萄糖，产酸不产气。大多不发酵乳糖，仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。靛基质产生不定，甲基红阳性，VP试验阴性，不分解尿素，不产生H2S。根据生化反应可进行初步分类。志贺氏菌属的细菌对甘露醇分解能力不同，可分为二大组。志贺氏菌的抗原构造与分型：志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原（O）及表面抗原（K）组成。主要抗原有三种。型特异性抗原、群特异性抗原、表面抗原（K抗原）。根据抗原构造的不同，按最新国际分类法，将本属细菌分为四个群、39个血清型（包括亚型）志贺氏菌的抵抗力：志贺氏菌属在

57、外界环境中的生存力，以宋内氏最强，福氏菌次之，志贺氏菌最弱。一般在潮湿土壤中能存活34天，37水中存活20天，在粪便内（室温）存活11天。日光直接照射30分钟，56-6010分即被杀死，对高温和化学消毒剂很敏感，1%石炭酸中15-30分钟即被杀死，对氯霉素、磺胺类、链霉素敏感，但易产生耐药性。志贺氏菌的变异性：S-R型变异：菌落可由光滑型变为粗糙型，同时常伴有生化反应、抗原构造和致病性的变异。在机体内，尤其在慢性患者和恢复期患者，志贺氏菌可发生变异而失去原来的生化和抗原特性，成为不典型菌株。但其中部分不典型菌株，可通过10%胆汁肉汤等返祖为典型菌株。故在慢性患者或带菌者粪便检查时，对这类菌株要特别注意，必须多次反复检查。因这对传染源的发现及控制有重要意义。耐药性