马兜铃酸体内检测方法及代谢转化研究

1、马兜铃酸体内检测方法及代谢转化研究项目完成单位：国家药物及代谢产物分析研究中心项目完成人： 李亚伟摘 要 建立了简单、灵敏的高效液相色谱法（HPLC）测定大鼠血浆中马兜铃酸I浓度的方法。马兜铃酸I和内标吲哚美辛经乙酸乙酯液-液萃取后，用HPLC法进行分析。色谱柱为YMC C18柱（5µm, 3.0mm×150mm I.D.）；流动相为乙腈-水-冰醋酸（50:50:1）；流速0.3mL·min-1, 检测波长254nm。药代动力学研究表明大鼠口服马兜铃酸I后吸收很快，消除较慢，药-时曲线消除相存在有多峰现象，按非房室模型计算药代动力学参数。并且在血浆中发现了一个可能

2、的马兜铃酸I代谢产物。我们采用正、负离子化模式的ESI-MS、APCI-MS等多种质谱分析方法对马兜铃酸I及其代谢物进行了探索研究，但是由于马兜铃酸I离子化困难，离子化效率低，未得到理想的结果。然后我们通过往流动相中加入醋酸铵以及改变多种流动相体系等措施使马兜铃酸的离子化效率有所改善，从而分析研究了马兜铃酸的M+NH4+离子在LC-MS/MS谱上的裂解方式，并检测到可能是马兜铃内酰胺Ia的硫酸结合型II相代谢产物。但是本质谱分析方法还有待于进一步的改进。一、 研究背景近年来，欧洲学者报道了一系列含有马兜铃酸（Aristolochic acid, AA）的中草药导致肾损伤的病例，并将此称为“中草

3、药肾病”。目前，这一发现已经引起国内外学者的广泛关注，从而开始对AA所致肾损伤的临床表现及病理机制进行深入的研究。AA是马兜铃属植物中的主要成分，该属植物分布广泛，在我国有40多种，其中有些是常用中药，如马兜铃、关木通、广防己、青木香、天仙藤、寻骨风等。在一些减肥中药中，由于使用了含有AA的马兜铃属植物，特别是误将关木通、广防己用作为有利尿作用的木通，从而造成使用者肾脏功能损害，其临床表现是贫血和高血压，肾功能呈“亚急性”或“快速进展性”的不可逆损伤，停药后仍不能逆转，往往在数月或12年内发展为终末期肾病，严重者可致肾功能衰竭。医生建议在使用一些含有AA的中草药时应特别慎重，严防肾损伤的发生。

4、目前有关AA引起肾损伤的机制尚不十分清楚，它在人体内的吸收、分布、代谢及消除过程也未被充分阐明3。因此，研究AA的体内检测方法，了解其体内过程及药代动力学特点，将有助于深入研究其毒理机制，从而为其毒副作用的防治提供理论依据。另一方面，若能对患者体内的AA水平进行有效而准确的监测，则有可能对毒副反应的发生起到预警作用，最大限度地避免悲剧的重演。因此，AA的体内检测方法及代谢研究具有十分重要的理论和实际价值。近二十年来，除了有少量植物中AA的HPLC分析研究外，国内外有关AA体内分析方法的文献报道几乎没有。其药物动力学研究系采用紫外分光光度法，显然无论灵敏度和特异性均不能符合要求；而代谢产物的研究

5、则是从生物样品中分离制备代谢物纯品，这样往往可能遗漏含量较低的代谢物。因此我们拟采用HPLC、LC-MS、GC-MS等技术，研究建立AA在生物样品中新的分析方法，使其具有灵敏度高、特异性好的优点，并符合药物动力学研究和临床药物监测的需要，为全面研究AA的毒理机制、控制毒副反应的发生提供方法学基础，从而为中药现代化、科学化进程作出贡献。二、马兜铃酸体内检测方法及代谢转化研究策略建立了简单、灵敏的高效液相色谱法（HPLC）测定大鼠血浆中马兜铃酸I浓度的方法。以SD种雄性大鼠作为研究对象，研究了大鼠单次口服马兜铃酸I溶液后其药代动力学行为。另外采用正、负离子化模式的ESI-MS、APCI-MS等多种

6、质谱分析方法对马兜铃酸I及其代谢物进行了探索研究。具体实验设计如下：1、以SD种雄性大鼠作为研究对象，体重210±20g。 2、配制马兜铃酸I（1.00 gL-1）和内标物吲哚美辛（1.00 gL-1）的标准储备液。3、药代动力学实验部分所使用的液相条件：色谱柱为YMC C18柱（5µm, 3.0mm×150mm I.D.）；流动相为乙腈-水-冰醋酸（50:50:1）；流速0.3mL·min-1, 检测波长254nm。4、对血浆中的马兜铃酸I和内标吲哚美辛使用重蒸乙酸乙酯进行液-液萃取。5、对分析方法按有关规范要求进行了平均方法回收率、精密度与准确度和稳

7、定性的考察。6、研究了大鼠单次口服马兜铃酸I溶液后其药代动力学行为。 7、以苯巴比妥钠诱导大鼠，制备大鼠肝微粒体。8、对马兜铃酸I进行大鼠体外肝微粒体温孵体系中的代谢进行研究。用HPLC法对大鼠体外代谢产物进行分析。9、生物样品收集：大鼠（n=4）在给药前均禁食12小时，以含5%蔗糖的生理盐水维持，同时收集空白尿和粪。给药后收集0-24小时及24-72小时尿和粪。大鼠（n=4）禁食12小时后，做胆汁引流手术，观察3小时，同时收集空白胆汁，然后口服灌胃给药，收集0-24小时及24-72小时胆汁。10、建立马兜铃酸I在大鼠体内外代谢的生物样品前处理办法。11、我们采用正、负离子化模式的ESI-MS

8、、APCI-MS等多种质谱分析方法对马兜铃酸I及其代谢物进行了探索研究，并检测到可能是马兜铃内酰胺Ia的硫酸结合型II相代谢产物。三、马兜铃酸I在大鼠血浆中的药代动力学研究马兜铃酸I（Aristolochic acid I，AAI）和内标物吲哚美辛（Indomethacin）的结构式分别为以下所示： Aristolochic acid I IndomethacinFig. 3-2 Structures of AAI and Internal Standard (Indomethacin)1 仪器与材料 1.1 药品与试剂 马兜铃酸I对照品（鉴别用，纯度>95%） 中国药品生物制品检定所吲

9、哚美辛（含量测定用） 中国药品生物制品检定所肝素钠 常州新华活性材料研究所碳酸氢钠（分析纯） 北京化工厂乙腈（色谱纯） Merck公司甲醇（色谱纯） Merck公司 冰醋酸（分析纯） 北京化工厂乙酸乙酯（分析纯） 北京化工厂双蒸水 北京协和药厂1.2 动物 SD大鼠，体重210±20g， 北京维通利华实验动物公司提供, 许可证号：9CXK（京）2002-0003。 1.3 仪器 日本Jasco公司高效液相色谱仪（PU-980泵，UV-975检测器）；SRI MODEL 203 PeakSimple 液相色谱数据处理系统；TGL-16G型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；TTM-1

10、型旋涡混合器（日本SIBATA公司）；天平（LIBROR AEL-160型，Shimadzu公司；AG135型，METTLER TOLEDO公司）；微量移液器（40-200 µL，NICHIRYO公司；100-1000 µL，GILSON公司）。1.4 试药的配制 称取10.00 mg马兜铃酸I，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解超声促溶，配成1 gL-1的马兜铃酸I标准储备液。然后根据需要进行不同倍数的稀释，配制成相当于浓度为0.25，0.50，1.25，2.50， 5.00，10.00和20.00 g·mL-1马兜铃酸I的系列标准溶液。称取20.0 mg马兜铃

11、酸I，用1% NaHCO3溶液溶解，超声促溶，配成1.0 gL-1的溶液供大鼠口服。肝素钠用生理盐水配成4 gL-1的溶液。称取内标吲哚美辛5.00 mg，配成浓度为1.00 gL-1甲醇溶液作为储备液，准确转移0.75 mL至50 mL容量瓶中，用甲醇稀释为0.015 gL-1 的内标供试液。2 方法与结果2.1 血浆样品处理 取大鼠血浆0.2 mL，置于10 mL具塞离心管中。加入内标溶液（0.015 g·L-1 吲哚美辛甲醇溶液）200 L，混匀。加入乙酸乙酯3 mL，涡流震荡1 min，离心10 min （3000r·min-1），分取上层有机相。同法用乙酸乙酯再提

12、取一次合并有机相，于40氮气流下吹干，残留物溶于200 L流动相中，涡流1 min，离心后取上清液20 L进行HPLC分析。2.2 色谱条件和色谱行为色谱柱：YMC C18柱（5 m，3.0 mm×150 mm I.D.）流动相：乙腈-水-冰醋酸（50:50:1），流速： 0.3 mL·min-1, 检测波长254nm。在上述色谱条件下，空白血浆、含药血浆和实测血浆的HPLC谱图如Fig.3-3所示。结果显示马兜铃酸I和内标吲哚美辛的色谱峰不受内源性杂质峰的干扰，色谱分离良好（R>1.5），测定专属性强。马兜铃酸I的保留时间为11.87min，内标吲哚美辛的保留时间为

13、16.88min，色谱峰3可能为马兜铃酸I的一个代谢产物，其保留时间为5.77min。 (A) (B) (C)Fig.3-3 HPLC chromatograms of blank plasma(A), standard plasma(B) and test plasma(C).A: Blank plasma sample.B: Plasma sample spiked with 5g·mL-1AAI(1) and internal standard(2).C: 0.167h plasma sample after an oral administration of AAI(po.1

14、0 mg·kg-1) to a SD rat, a possible metabolite(3) of AAI. Internal Standard: Indomethacin2.3 标准曲线与线性范围 取大鼠空白血浆0.2 mL，置于10 mL具塞离心管中，加入马兜铃酸I系列标准溶液200 L，分别配制成相当于浓度为0.25，0.50，1.25，2.50， 5.00，10.00和20.00 g·mL-1的血浆样品，按照上述方法中“血浆样品处理”项下操作，建立标准曲线。以血浆中待测物浓度（C）为横坐标，待测物与内标物的峰面积之比（Y）为纵坐标，进行回归计算，求得直线回归方程

15、，建立标准曲线。回归方程为Y=0.0946C-0.0172，=0.9994，标准曲线见Fig.3-4。本方法在0.25-20.00g·mL-1范围内线性良好，最低定量浓度为0.25g·mL-1。Fig.3-4 A typical standard curve for the determination of AAI in rat plasma2.4 方法回收率分别取低、中、高3个浓度（0.25、2.50、20.00g·mL-1）的标准系列溶液，按“标准曲线与线性范围”项下方法操作，所测得的马兜铃酸I色谱峰面积值与标准溶液直接进样分析所得的面积值对比，考察各浓度点的

16、平均方法回收率。每一浓度进行5样本分析。结果见Tab.3-1。Tab.3-1 The relative extracted percentage of AAI at three different concentrationAdded(g·mL-1) 0.25g·mL-1 2.50g·mL-1 20.00g·mL-1Measured 0.28 2.62 20.34 (g·mL-1) 0.26 2.57 21.55 0.26 2.63 20.13 0.25 2.66 21.95 0.27 2.32 21.50 (g·mL-1) 0.26

17、 2.56 21.09RE(%) 4.72 2.40 5.47RSD(%) 4.67 5.39 3.82 2.5 精密度与准确度取空白血浆0.2 mL，按“标准曲线与线性范围”项下方法操作，分别制备浓度为0.25、2.50和20.00g·mL-1的马兜铃酸I待测样品，每一浓度进行5样本分析，连续测定2天，以标准曲线计算样品浓度，求算精密度与准确度，结果见Tab.3-2。精密度与准确度均符合有关国内外规范要求。Tab. 3-2 Precision and accuracy of the HPLC method to determine AAI in rat plasmaConcentr

18、ation0.25g·mL-12.50g·mL-120.00g·mL-1Inter-day（n=5） (g·mL-1)0.26 0.260.240.260.263.09 2.82 2.732.65 2.7119.94 20.16 21.18 20.45 21.20(g·mL-1)RE(%) RSD(%)0.26 2.32 3.552.80126.1820.592.932.90Inter-day（n=5）(g·mL-1)0.27 0.27 0.25 0.240.242.88 2.56 2.67 2.35 2.6521.12 19.03

19、20.84 20.96 21.01(g·mL-1)RE(%) RSD(%)0.25 1.36 6.012.80126.1820.592.94.272.6 样品稳定性考察 考察马兜铃酸I的高（20.00g·mL-1）、低（0.25g·mL-1）不同浓度的样品在不同保存条件下的稳定性。结果表明血浆样品在冷冻-融化循环3次实验中测定的马兜铃酸I的浓度没有明显降低（相对偏差在10%以内）。室温条件下马兜铃酸I在流动相中至少稳定存在24h。2.7 马兜铃酸I在大鼠体内药代动力学研究雄性SD大鼠5只，每只大鼠间隔一定的时间取血，取血时间点为0.017，0.083，0.13，0

20、.20，0.25，0.42，0.58，0.75，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0h。给药前禁食12h，全程不禁饮水。大鼠灌胃口服1% NaHCO3溶液配制的马兜铃酸I溶液（1.0gL-1），剂量为10.0 mg·kg-1，于不同时间点由大鼠眼眶后静脉丛取血约500 L，置于肝素化离心试管中，离心分离血浆，按上述方法中“血浆样品处理”项下操作，测得大鼠单次口服马兜铃酸I后各个采血点的血药浓度，数据见Tab.3-3。平均血药浓度-时间曲线如Fig.3-5所示。体内结果表明大鼠口服马兜铃酸I后药-时曲线存在有多峰现象。用WINNOLIN药代计算程序处理，按照非房室模型进行推算

21、、权重选择，拟合药-时曲线，并计算相关药代参数，有关药代动力学参数见Tab.3-4。Fig.3-5 Mean plasma concentration-time curve of AAI after oral single dose of 10.0 mg·kg-1 in ratsTab.3-3 Plasma concentration of AAI after oral single dose of 10.0 mg·kg-1 in ratsTime(h)12345MeanSD0.03330.08330.11670.18330.250.43330.58330.7511.522

22、.5340.538.1110.999.539.104.181.612.756.711.961.301.051.880.750.314.327.028.637.193.261.697.096.481.720.750.450.410.340.434.828.5310.1311.142.931.691.165.792.630.830.500.380.350.295.717.368.3810.122.061.012.271.332.220.830.500.420.296.9714.3812.4428.0019.6411.655.261.871.190.580.460.410.460.375.999.6

23、69.8213.116.413.533.714.441.940.860.620.720.460.111.563.071.628.457.434.552.422.620.540.270.290.650.16Tab.3-4 Pharmacokinetic parameters of AAI after single oral dose of 10.0 mg·kg-1 in ratsSubject Rsq Tmax Cmax AUClast AUC0 T1/2_z Vz/F Cl/F AUMC0 MRT0 (observed) (observed) (observed) (observed

24、) (observed) h ug·mL-1 mg·h·L-1 mg·h·L-1 h 1 0.624 0.117 10.99 10.66 12.00 1.246 0.449 0.250 21.467 1.7892 0.769 0.183 8.63 8.73 9.10 0.755 0.359 0.330 10.425 1.1463 0.817 0.250 11.14 8.21 8.57 0.722 0.365 0.350 10.020 1.1694 0.772 0.250 10.12 6.41 7.25 1.382 0.825 0.414 11.

25、833 1.6325 0.706 0.300 28.00 13.82 14.77 1.437 0.421 0.203 14.885 1.008 0.737 0.22 13.77 9.57 10.34 1.108 0.484 0.309 13.726 1.349SE 0.075 0.071 8.013 2.819 3.025 0.345 0.195 0.083 4.730 0.3413 讨论3.1 HPLC分析方法中各种影响因素的条件摸索利用高效液相色谱仪对马兜铃酸I的色谱峰进行了全波长扫描，发现马兜铃酸I的最大吸收波长与文献7报道基本接近：其最大吸收波长位于250nm、318nm、390nm处

26、，实验中为了避免杂质峰的干扰，同时兼顾最大吸收，保证其灵敏度，所以选择254nm为检测波长。 文献8-10报道的检测马兜铃酸的流动相组成有：甲醇：水：乙酸=70:29:1(v/v/v)；乙腈：0.1%磷酸缓冲液=60:40(v/v)，pH 2.5-2.8；乙腈：0.3%碳酸铵溶液=25:75(v/v)，pH 7.5。本实验参考以上流动相组成，对其进行了改进，使流动相组成适合生物样品分析要求，并且满足下一步LC-MS法对马兜铃酸生物样品的分析要求。本实验中在微径柱上使用甲醇/水/乙酸流动相组成体系时，需要将乙酸加至2%才能将保留时间调整合适，考虑到酸性太强会使柱寿命降低，所以未选用此体系。摸索发

27、现将乙腈/0.3%碳酸铵溶液体系调整比例为27:73（v/v）适合马兜铃酸I的分析，但是在此流动相组成下内标物吲哚美辛的色谱峰出现多峰现象，原因不明。最后选择的流动相组成为乙腈：水：乙酸=50:50:1（v/v/v），在此条件下马兜铃酸I和内标吲哚美辛的保留时间合适，适合生物样品分析的要求，分离良好，内源性杂质不干扰。3.2 内标物的选择在内标物的选择上，考察了包括马兜铃酸II和一些与马兜铃酸结构较为相似的化合物的色谱行为以及提取回收率和稳定性，其中马兜铃酸II的保留时间和原药马兜铃酸I在本实验所使用的液相条件下保留时间比较接近，分离度不是特别理想。萘的保留时间合适，与马兜铃酸I也 较为接近，

28、分离度良好，但是在按照上述方法中“血浆样品处理”项下操作过程中，萘的挥发性较强，分取上层有机相，于40氮气流下吹干，残留物复溶后进行HPLC分析时，未出现萘的色谱峰。综合考虑待选化合物的保留时间以及与原药相同的提取体系下待选内标物的回收率和稳定性等因素，最后选定吲哚美辛为内标物。3.3 提取溶剂的选择取大鼠空白血浆0.2 mL，加入内标溶液（0.015 g·L-1 吲哚美辛甲醇溶液）和马兜铃酸I （0.0025 g·L-1甲醇溶液）各200 L，考察了不同的提取溶剂体系对回收率和稳定性的影响，比较了用重蒸乙酸乙酯、重蒸乙酸乙酯-异丙醇（1:9）、二氯甲烷-异丙醇（9:1）的

29、液-液提取方法。另外还考察了加入氯化钠固体、甲醇、不同浓度盐酸酸化对提取回收率的影响。结果表明内标的甲醇溶液具有沉淀蛋白的作用，直接用乙酸乙酯做为提取体系的溶剂提取回收率和稳定性很合适，加入盐酸酸化并没有使提取率有明显的增加，为了简化操作步骤，直接利用乙酸乙酯作为液-液提取体系。3.4 马兜铃酸I在大鼠血浆中的药代动力学行为本研究采用RP-HPLC法测定大鼠血浆中马兜铃酸I浓度的过程中，发现保留时间为5.77 min的色谱峰可能为马兜铃酸I的一个代谢产物，见色谱图Fig.3-3（C）。对此色谱峰和马兜铃酸I的色谱峰进行紫外全波长扫描，其结果见Fig.3-6。经过对比发现两者的紫外吸收谱型非常相

30、似，且最大吸收波长也很接近。并且通过与空白血浆对照，初步可以判断其为马兜铃酸I的一个代谢产物。但是由于马兜铃酸I及其代谢产物在各种离子化条件下，包括电喷雾质谱（ESI-MS）和大气压化学电离（APCI-MS），其离子化效率均很低，所以相应的质谱分析方法尤其是LC-MS或GC-MS方法尚未建立起来，将血浆样品进行LC-MS和GC-MS方法分析时，可能的代谢产物没有被检测出来。为进一步确定这个可能代谢物的结构，将剩余的血浆样品合并后，装入自制的正相硅胶柱，使用氯仿、丙酮、异丙醇、甲醇、含1%冰醋酸的甲醇进行洗脱，经减压浓缩蒸干，复溶于流动相中，利用RP-HPLC进行分析，发现可能的代谢物在正相硅胶

31、柱上产生死吸附，没有被洗脱下来。大鼠口服马兜铃酸I后吸收很快，T1/2_z为1.108h，消除较慢。本研究首次发现大鼠口服马兜铃酸I后消除相存在多峰现象。药物的多峰现象一般与肠-肝循环、胃-肠循环或肠-肠循环有关。肠-肝循环受食物影响明显，在禁食给药后再摄取食物的情况下出现，这可能是因为摄食使得储存于胆囊中的药物随胆汁释放入肠道又被重新吸收的缘故。在本实验中由于大鼠被采血的时间较密集，所以给药后大鼠就被供给食物了，所以马兜铃酸I在大鼠体内的多峰现象有可能与肠-肝循环有关。这一结论有待于进一步研究来验证。 (A) (B)Fig.3-6 The UV spectra of AA I (A) and

32、 the possible metabolite of it (B)四、马兜铃酸I代谢产物的质谱分析方法探讨1 试剂与仪器1.1 试剂与药品 马兜铃酸I对照品（鉴别用，纯度>95%） 中国药品生物制品检定所 马兜铃酸混合物 Sigma 公司6-磷酸葡萄糖（G-6-P） Sigma公司6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-P DH） Sigma公司氧化型辅酶II（NADP） Sigma公司还原型辅酶I（NADH） 北京百泰生化试剂公司 乙腈（色谱纯） Merck公司甲醇（色谱纯） Merck公司 冰醋酸（分析纯） 北京化工厂双蒸水 北京协和药厂1.2 仪器高效液相色谱系统：日本Jasco公司（PU

33、-980泵，UV-975检测器） SRI MODEL 203 PeakSimple 液相色谱数据处理系统质谱仪1： AutoSpec Ultima-Tof串联质谱仪（Micromass，UK）质谱仪2： LCQ Advantage （Thermo Finnigan 公司） HPLC系统：Autosample Surveyor MS Pump Surveyor2 研究方法2.1 生物样品的收集 体外温孵体系的建立 采用大鼠肝微粒体体外有氧温孵体系，结合文献报道，考察了微粒体蛋白和马兜铃酸I的量对代谢转化率的影响，以便选择最佳温孵体系，体外温孵是在生理温度37下进行，整个系统用pH7.4 Tris

34、-HCl缓冲液维持pH值稳定。 往适量的pH7.4 Tris-HCl缓冲液中按Tab.3-6所示的浓度分别加入肝微粒体、NADP、NADH、G-6-P、G-6-P DH以及MgCl2后摇匀，置于37水浴中预温孵3分钟，加入适量经DMSO助溶的马兜铃酸I溶液，继续置于37水浴中振摇，每20分钟通氧气1分钟，2小时后撤离水浴，终止反应。空白对照管不加马兜铃酸I，其它操作与样品管相同，沸水浴灭活。Tab.3-6 Incubation systems with rat liver microsomes and cofactor solution（10ml）GroupNADPmmol/LNADHmmol

35、/LG-6-Pmmol/LG-6-PDHI.U./mLMg2+mmol/LMicrosomeProteinmg/mL AAImg123451.01.01.01.01.00.50.50.50.50.510.010.010.010.010.01.01.01.01.01.04.04.04.04.04.02.03.04.03.03.0 1.0 1.0 1.0 1.52.0 尿液和粪便的收集 SD雄性大鼠5只置于代谢笼中，禁食12小时，10%蔗糖溶液维持，收集24小时空白尿液和粪便，然后给大鼠口服灌胃1% NaHCO3溶液配制的马兜铃酸I溶液（1.0 g·L-1），剂量按体重计算为10.0 m

36、g·kg-1，分别收集0-24小时的尿液和0-72小时的粪便，-20下保存。 胆汁的收集SD雄性大鼠手术前禁食12小时，乙醚麻醉状态下做胆管插管手术，10%蔗糖生理盐水灌胃维持。给药前收集空白胆汁，然后给大鼠口服灌胃1% NaHCO3溶液配制的马兜铃酸I溶液（1.0 g·L-1），剂量按体重计算为10.0 mg·kg-1，收集给药以后的胆汁，在-20下保存。2.2 生物样品的前处理 体外温孵产物的前处理 温孵产物用乙酸乙酯10 mL提取，提取三次，合并有机相，于40减压蒸干，用流动相（甲醇：水=60:40）200 L复溶，离心后取上清液20 L进行HPLC分析。

37、尿液和粪便的前处理 将给药后收集的大鼠粪便研磨成粉末状，置于烧杯中，加入乙醇：水（50:50）混合溶剂300 mL浸泡过夜，过滤，残渣再加入同样溶剂提取一次，合并滤液。将大鼠粪便滤液和尿液分别于40减压浓缩，浓缩至小体积后，用反相C18硅胶拌样，凉干。 按1:25比例，取反相C18硅胶自行装柱，将硅胶填实，先用甲醇冲洗柱子，然后再用双蒸水冲洗，样品填入柱子后先用大量的双蒸水冲洗，然后用乙腈和水进行梯度洗脱，梯度洗脱流程如下：乙腈（mL）: 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.5 5.5 7.5 10 16双蒸水（mL）: 49.0 48.5 48.0 47.5 47.0 46.

38、5 45.5 44.5 42.5 40 34最后使用甲醇和含1%冰醋酸的甲醇冲洗，每份50 mL，分别于40减压蒸干，用流动相（甲醇：水=5:95或15:85）进行复溶，离心后取上清液进行HPLC分析。 胆汁的处理 将收集的大鼠空白胆汁和给药胆汁分别用乙酸乙酯提取（体积比为1:2），提取三次，合并有机相，于40减压蒸干，用流动相（甲醇：水=60:40）进行复溶，离心后取上清液进行HPLC分析。2.3 分析方法2.3.1 RP-HPLC分析方法 色谱条件色谱仪：Jasco公司PU-980泵，UV-975检测器，SRI MODEL 203 PeakSimple 液相色谱数据处理系统色谱柱：YMC

39、C18柱（5m, 3.0 mm×150 mm I.D.）流速：0.3 mL·min-1 检测波长：254nm进样量：20µl流动相1：甲醇：水：冰醋酸=5:95:1流动相2：甲醇：水：冰醋酸=10:90:1 流动相3：甲醇：水：冰醋酸=15:85:12.3.2 质谱分析方法质谱条件仪器型号：AutoSpec Ultima-Tof 串联质谱仪EI-MS：电离电压：70eV；分辨率：1000；加速电压：8000VFAB-MS：Cs+离子枪；分辨率：1000；加速电压：8000V 基质：甘油（Gly或G），间硝基苄醇（m-NBA） 硫代甘油（TG），二硫苏糖醇（DTT）

40、 ESI-MS：锥体电压： 20V 毛细管电压： 8.5KV 加速电压： 4KV 溶剂体系： 甲醇-醋酸铵（100:1） 流速： 20 µLmin-1 APCI-MS：Needle voltage: 60V Sampling Cone: 20V Skimmer Lens: 43.2V Ring Electrode: 18.1% Nebulizer Heater: 80 Solution: Methanol Flow Rate: 1.0 mLmin-1GC-MS: 色谱柱： DB-5（30m×0.25mm I.D.，0.25µm）毛细管柱 载气： He，1mLmin

41、-1 进样口温度：220；接口温度：220；离子源温度：220进样方式：不分流，1 µL柱升温程序：60 (2min) 20/min 220 (1min) 3/min 280(1min)10/min 300 (1min)仪器型号：LCQ Advantage （Thermo Finnigan 公司）ESI-MS: Spray voltage： 4.2 kv Sheath Gas Flow Rate： 40 psi Tube lens offset： 30 Capillary voltage： 3.00V Capillary temperature： 220Solution: Metha

42、nol APCI-MS: Vapouriser temperature： 450 Capillary temperature： 150 Needle current： 5 µAAuxiliary Gas Flow Rate: 20 psiSolution: MethanolLC-MS: 色谱柱： YMC C18柱（5m，3.0 mm×150 mm I.D.）流动相： 乙腈-水-冰醋酸（50:50:1）流速： 0.3 mL·min-1 样品处理：马兜铃酸I溶于甲醇-醋酸铵（100:1）溶剂体系3 实验结果与讨论3.1 马兜铃酸I的质谱分析马兜铃酸I标准品在EI-MS

43、谱（Fig.3-8）中得到分子离子m/z 341和碎片离子m/z 295、m/z 293和m/z 278，其中m/z 295为M-NO2+，而m/z 293和m/z 278分析判断为杂质峰。Fig.3-8 EI-MS of AAI with AutoSpec Ultima-Tof mass spectrometer在FAB-MS的正、负离子模式下，尝试使用各种底物，均没有得到分子离子峰。采用APCI离子化方式，分别在AutoSpec Ultima-Tof串联质谱仪和LCQ质谱仪上，均没有检测到马兜铃酸I的分子离子峰。利用AutoSpec Ultima-Tof串联质谱仪分析检测马兜铃酸I的 ESI-MS谱，见Fig.3-9。结果发现有多个加合离子，例如M+ Na +( m/z 364)，2M+Na+( m/z 705)，3M+Na+( m/z 1046)和4M+Na+( m/z 1387)。但是可以看出马兜铃酸I在正离子模式的ESI电离方式下也很难离子化，同时此结果也表明马兜铃酸I具有较强的分子间相互作用力。Fig.3-9 ESI-MS of AAI with AutoSpec Ultima-Tof mass spec