沈阳药科大学毕业论文1

1、沈 阳 药 科 大 学本 科 毕 业 论 文 论文题目：HPLC同时测定了哥王中4种香豆素的含量 起止时间：2012年10月09日 2013年 6月10日 姓名学号： 学院专业：中药学院中药学专业 年级班级：2009级中药学一班指导教师：实习单位：药学院药物分析教研室目 录摘 要1Abstract2第一章 前言31.1 香豆素类化合物的基本知识31.1.1 香豆素类化合物的基本结构31.1.2 香豆素类化合物分类31.1.3 香豆素类化合物的药理活性41.2 研究思路与立题依据6第二章 实验部分72.1 实验材料72.2 溶液的配制72.2.1 对照品溶液的制备72.2.2 供试品溶液的制备8

2、2.3 色谱条件与系统适用性试验82.4 方法学验证92.4.1 线性关系考察92.4.2 检测限与定量限的确定92.4.3 精密度试验92.4.4 稳定性试验102.4.5 重复性试验102.4.6 回收率试验102.5 样品含量测定10第三章 结果与讨论133.1 结果133.2 讨论13参考文献14致 谢16HPLC同时测定了哥王中4种香豆素的含量摘 要目的：建立HPLC同时测定了哥王中伞形花内酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的含量。方法：该方法采用依利特Hypersil-ODS色谱柱(200 mm×4.6 mm，5 m)，乙腈-0.1%

3、磷酸水溶液为流动相梯度洗脱，检测波长345 nm，流速1.0 mL·min-1，柱温30 ，进样量20 L。结果：伞形花内酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的质量浓度分别在0.070 0.770 (r=0.9999)，0.1902.09 (r=0.9999)，0.7658.42 (r=0.9998)，4.0844.9 mg·L-1 (r=0.9999)与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率分别为98.0% (RSD=1.9%)，96.6% (RSD=1.2%)，96.5% (RSD=1.7%)，101.3% (RSD=1.1%)。结论：该

4、方法简便、快速、结果准确，可作为了哥王药材的质量控制方法。关键词：了哥王；HPLC；伞形花内酯；西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷；triumbelletin；西瑞香素；含量测定Simultaneous determination of four coumarins in Wikstroemia indica (L.) C. A. Mey. by HPLCAbstractObjective: To establish a reversed-phase high performance liquid chromatographic method for simultaneous determinat

5、ion of 4 coumarins in Wikstroemia indica (L.) C. A. Mey. Method: The chromatographic separation was performed on an Elite Hypersil-ODS column (4.6 mm×200 mm, 5 m) with a gradient elution of acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution as the mobile phase, the UV detection wavelength was s

6、et at 345 nm, the flow rate was 1.0 mL·min-1, the column temperature was maintained at 30 and the injection volumn was 20 L. Result: All the standard compounds showed a good linearity in the relatively wide concentration range of 0.070-0.770 (r = 0.9999), 0.190-2.09 (r = 0.9999), 0.765-8.42 (r

7、= 0.9998), 4.08-44.9 mg·L-1 (r = 0.9999) for umbelliferone, daphnoretin-7-O-D-glucoside, triumbelletin and daphnoretin, respectively. Under these conditions, the average recoveries of the four coumarins were 98.0%, 96.6%, 96.5%, 101.3%, respectively and the relative standard deviations (RSD) we

8、re 1.9%, 1.2%, 1.7%, 1.1%, respectively. Conclusion: The developed method was found to be accurate, sensitive and reproducible, and could be successfully applied to the quality control of Wikstroemia indica (L.) C. A. Mey.Key words: Wikstroemia indica (L.) C. A. Mey.; HPLC; umbelliferone; daphnoreti

9、n-7-O-D-glucoside; triumbelletin; daphnoretin; content determination第一章 前言瑞香科植物在世界上约有48属650种以上，广泛分布于南北半球的热带和亚热带地区，多分布于非洲、大洋洲和地中海沿岸。我国有10属100种左右，其中主要以瑞香属和荛花属居多，各省均有分布，但主产于长江流域及以南地区。该科植物多有一定毒性，对皮肤及粘膜有强烈刺激性，可供药用植物不多，但近年来进行了大量的化学工作，分离得到了许多重要化合物的结构，其相关药理实验表明该科植物具有多种显著的生理活性，引起了各国学者的关注。了哥王 (Wikstroemia ind

10、ica (L.) C. A. Mey.)为瑞香科荛花属植物，又名岭南荛花，分布于我国浙江、江西、福建、湖南、广东、广西等省区。了哥王性味苦寒、微辛、有毒，具有清热解毒、化痰散结、消肿止痛等作用，主治风湿性关节炎、扁桃体炎、痈肿、跌打损伤等1。已知了哥王含有黄酮类、香豆素类、多糖类、木脂素类、挥发油类、甾体类、皂苷类等成分2-4。1.1 香豆素类化合物的基本知识1.1.1 香豆素类化合物的基本结构香豆素 (Coumarin)，化学名称为2H-1-苯并吡喃-2-酮 (2H-1-Benzopyran-2-one)，即苯并-吡喃酮。香豆素是顺式-邻羟基桂皮酸的内酯，是一种具有芳香气味的化合物，其化学结

11、构式见图1-1。图1-1 香豆素的化学结构式Fig.1-1 Chemical structure of coumarin1.1.2 香豆素类化合物分类5香豆素类化合物主要分为以下几类：(1) 简单香豆素类：这类化合物是指仅在苯环有取代基的香豆素类。绝大多数香豆素在C-7位都有含氧基团存在，仅少数例外。其他C-5、C-6、C-8位也有含氧基团取代的可能，常见的含氧基团有羟基、甲氧基、亚甲二氧基。这类香豆素常见的有伞形科植物中的伞形花内酯，瑞香中的瑞香素，蛇床子中的蛇床子素，独活中的当归内酯等；(2) 呋喃香豆素类 (furocoumarins)：苯环上的异戊烯基与其邻位的酚羟基环缩合而成的化合物

12、。成环后常伴随着降解，失去3个碳原子，根据呋喃环的位置，此类化合物通常被分为线型 (linear)和角型 (angular)。如存在于补骨脂中的补骨脂内酯，旱前胡中的旱前胡甲素、旱前胡乙素等；(3) 吡喃香豆素类 (pyranocoumarins)：由香豆素苯环上的异戊烯基与邻位的酚羟基环缩合形成2,2-二甲基-吡喃环结构的化合物，与呋喃香豆素类似，根据吡喃环环合的位置，也分为角型和线型两种类型。如狭缝芹中的狭缝芹素，白花前胡中的北美芹素、白花前胡丙素等；(4) 异香豆素类 (isocoumarin)：是香豆素的异构体，分布比较零散，局限在少数科属中；(5) 其他香豆素类：从植物中发现的天然香

13、豆素类成分，还有些化合物的结构不能归属于上述4种类型。常见的取代基有苯基、羟基、异戊烯基等基团，如茵陈中的茵陈素，白花丹中的白花丹精等。1.1.3 香豆素类化合物的药理活性香豆素类物质具有多种多样的生理活性：对植物有双重生理活性，在低浓度时促进植物生长，在高浓度时抑制植物生长；对人体则具有抗肿瘤、抗HIV、抗菌、抗凝血、抗氧化、消炎止痛、止咳平喘、降压等作用，特别是某些衍生物具有抗肿瘤活性和抗HIV活性，引起了国内外学者广泛的关注。(1) 抗肿瘤作用通过对香豆素类化合物的抗肿瘤作用研究，发现许多香豆素类化合物具有抗肿瘤活性，为抗肿瘤药物的研发提供了先导化合物。双香豆素在临床上作为凝血剂广泛使用

14、。双香豆素是NADPH (醌类氧化还原酶)的竞争性抑制剂，可以增加细胞内过氧化物的生成和影响肿瘤细胞的增殖，Gonzalez-Aragon等6研究首次表明，双香豆素可以抑制骨髓性白血病HL-60细胞内线粒体的电子传送，逆转复合体II电子流方向引起过氧化物释放，并且抑制嘧啶的生物合成；Kostova等7研究了三种双香豆素衍生物铈配合物的细胞毒性，实验中使用急性骨髓性白血病HL-60细胞株和慢性骨髓性白血病 (CML)BV-17细胞株。通过凝胶电泳分析DNA来评价化合物引起程序细胞死亡的能力。此外，还阐明了程序细胞死亡的形态学特征。(2) 抗炎镇痛作用Tsai等8研究发现白花丹属植物中的吡喃香豆素

15、Seselin能抑制植物凝集素 (PHA)，这种植物凝集素能刺激人类周边血液中单核细胞 (PBMC)增殖，IC50为 (53.87±0.74) M。Seselin抑制PBMC增殖并不是通过细胞毒性，而是通过抑制炎症性细胞因子白介素2 (IL-2)和干扰素 (IFN-)。此外，Seselin能显著抑制PBMC中IL-2和IFN-的基因表达。(3) 对心血管系统的作用天然香豆素类化合物对心血管系统的作用机制主要是基于其钙离子拮抗剂的作用，具有心血管活性的天然香豆素可抑制钙离子经钙通道进入细胞，从而产生降压、抗心律失常、负性肌力等生物学作用。Dongmo等9从植物Mammea africa

16、na茎皮分离得到的4-n-propylcoumarins，4-phenylcoumarins表现出微弱的血管松弛作用。(4) 抗菌及抗微生物作用Ferreira等10从植物Helietta apiculata茎皮中分离得到3- (1-二甲基烯丙基)-紫花前胡醇当归酯和叙利亚芸香素 (-)-heliettin，在体外对利什曼原虫的前鞭毛体形式作用温和，IC50为450 g·mL-1；对感染亚马逊利什曼原虫的小鼠疗效显著。(5) 抗HIV作用Sancho等11研究发现欧前胡素有明显的抗HIV-1活性。Zhou等12从五福花阿魏根中分离得到的水合氧化前胡素、独活醇、氧化前胡素和甲酸氧化前胡

17、素具有明显的抗HIV作用。Shikishima等13从Prangos tschimganica分离得到的补骨脂素能抑制H9淋巴细胞中HIV-1复制，EC50为0.1 g·mL-1；抑制未受感染的H9淋巴细胞增殖，IC50为19.1 g·mL-1，治疗指数TI为191 (通常TI大于5就认为药物有治疗作用)；石当归素和佛手内酯也有很强的抗HIV活性，TI分别为11.7和69.9。1.1.4 香豆素类化合物的含量测定方法香豆素类化合物的含量测定方法有：高效液相色谱法、比色法、荧光法、核磁共振波谱法、紫外分光光度法、气相色谱法、薄层扫描法、极谱法等。国外研究者还报道了几种改进的技

18、术，如胶束电动毛细管技术、直角纳米通道技术、凝胶溶胶通道技术等来检测香豆素类物质14。目前，应用最多的是高效液相色谱法，选用合适的色谱柱和流动相，可以很好地分离许多香豆素类物质。顾源远等15采用紫外分光光度法测定明党参中总香豆素的含量，以珊瑚菜内酯为对照品，检测波长为268 nm，并对该方法的重复性、稳定性、精密度及加样回收率进行试验，该法简便、可靠，为有效控制明党参药材的质量奠定了一定基础；周兴旺等16等用双波长薄层扫描法测定了5种产地的地骨皮药材中莨菪亭 (Scopoletin)的含量，以山西产地骨皮 (LyciumchinenseMill.)的含量最高；郑丽容等17用高效液相色谱法测定复

19、方胆通胶囊中羟甲香豆素的含量，方法简单、快速、准确；刘丽霞等18采用HPLC法测定了哥王中伞形花内酯的含量，为完善了哥王药材质量控制提供数据；李艳敏等19 采用HPLC法测定了哥王中西瑞香素的含量，具有操作简便准确，回收率好，精密度、重现性高，分析快速的优点，可作为了哥王药材的质量控制方法。1.2 研究思路与立题依据香豆素类化合物具有抗HIV、抗癌、降压、抗心律失常、抗骨质疏松、镇痛、平喘及抗菌等多种生物活性，具有潜在的药用价值，其中抗肿瘤作用是一个研究热点。因此，研究开发更多的天然植物香豆素类成分，寻找高效低毒的香豆素类化合物及其衍生物已成为当今药物研究与开发工作的重中之重。香豆素类成分是了

20、哥王药材中主要的抗肿瘤活性成分之一，且含量较大。目前，在了哥王中香豆素的含量测定方面，仅是关于西瑞香素和伞型花内酯的研究，相关报道有限，不足以作为评价药材质量的标准。因此，有必要对了哥王香豆素类化合物的质量控制进行深入系统的研究，以期提供了哥王抗肿瘤活性的物质基础，寻找了哥王中有效可控成分，完善了哥王的质量控制标准。基于上述情况，本文拟采用的基本研究思路如下：拟建立HPLC同时测定不同产地了哥王中伞形花内酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的含量。第二章 实验部分2.1 实验材料仪器LC-20A 高效液相色谱仪日本SHIMADZUSPD-20A紫外检测器日本

21、SHIMADZULC solution 色谱工作站日本SHIMADZUTG332A分析天平湘仪天平仪器厂KQ5200B型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司QE100药材粉碎机浙江省武义县屹立工具有限公司试剂甲醇 (色谱纯)山东禹王实业有限公司禹城化工厂乙腈 (色谱纯)山东禹王实业有限公司禹城化工厂纯净水杭州娃哈哈集团有限公司甲醇 (分析纯)天津市富宇精细化工有限公司无水乙醇 (分析纯)天津市富宇精细化工有限公司磷酸 (色谱级)天津市科密欧化学试剂有限公司 药材：了哥王药材9批，分别购于云南、江西、四川等地，由沈阳药科大学孙启时教授鉴定为瑞香科荛花属植物了哥王Wikstroemia indica

22、 (L.) C. A. Mey.的干燥根茎；对照品：伞形花内酯 (天津马克生物技术有限公司，批号20120308，纯度大于99.0%)、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素 (本实验室自制，纯度均大于98.5%)，4种香豆素化合物的结构见附图2-1。2.2 溶液的配制2.2.1 对照品溶液的制备 分别取干燥至恒重的伞型花内酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素对照品约适量，精密称定，分别置25，100，25，25 mL的量瓶中，用体积分数为80%的甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为70.00，15.80，85.0，2

23、04.2 mg·L-1的伞型花内酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素对照品储备液。分别精密量取上述对照品储备液0.50，6.0，4.5，10 mL至25 mL量瓶中，用体积分数为80%的甲醇稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为1.400，3.792，15.30，81.68 mg·L-1的伞型花内酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素混合对照品储备液，4 备用。2.2.2 供试品溶液的制备取了哥王干燥药材细粉 (过60目筛)约0.7 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为80%的甲醇30

24、 mL，密塞，精密称定其重量，超声处理45 min，放冷，再称定其重量，用提取溶剂补足失重，摇匀，经0.45 m微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。2.3 色谱条件与系统适用性试验 依利特Hypersil-ODS色谱柱 (200 mm×4.6 mm，5 m)；流动相：乙腈 (A)-0.1%磷酸水溶液 (B)，梯度洗脱程序：05 min，18%A；620 min，20%A；2333 min，30%A；3439 min，50%A；3942 min，18%A；4145 min，18%A；流速1.0 mL·min-1；检测波长345 nm；柱温30 ；进样量20 L。在上述色谱条件下，伞

25、形花内酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的理论塔板数均大于3000，与相邻峰间的分离度均大于1.5，色谱峰对称因子均在0.951.05。典型色谱图见附图2-2。 a b c d 图2-1 伞形花内酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的化学结构式Fig.2-1 Structures of umbelliferone (a), daphnoretin-7-O-D-glucoside (b), triumbelletin (c) and daphnoretin (d)BA1-umbelliferone; 2-daphnoret

26、in-7-O-D-glucoside; 3-triumbelletin; 4-daphnoretin图2-2 混合对照溶液 (A)和供试品溶液 (B)的高效液相色谱图Fig.2-2 HPLC chromatograms of standard solution (A) and sample solution (B)2.4 方法学验证2.4.1 线性关系考察 精密量取混合对照品储备液0.5，1.5，2.5，3.5，4.5，5.5 mL，分别置10 mL量瓶中，加体积分数为80%的甲醇稀释至刻度，摇匀，得伞型花内酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的系列标准溶液

27、。按“2.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以对照品溶液质量浓度 (mg·L-1)为横坐标，峰面积 (A)为纵坐标，绘制标准曲线，得伞型花内酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的回归方程，分别为：Y=8.348×104X-3.292×102 (r=0.9999)，Y=7.291×104X-2.776×103 (r=0.9999)，Y=7.203×104X+2.899×102 (r=0.9998)，Y=8.024×104X-1.620×104 (r =0.9999)。

28、结果表明伞型花内酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素分别在0.0700.770，0.1902.09，0.7658.42，4.0844.9 mg·L-1与峰面积呈良好线性关系。2.4.2 检测限与定量限的确定 分别将伞型花内酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素对照品溶液稀释成不同的质量浓度进行HPLC分析，测得其检测限 (信号S和噪音N的比值S/N=3)分别为3.5，7.9，8.5，4.1 ng·ml-1，定量限 (信号S和噪音N的比值S/N=10)分别为7.0，15.8，21.3，10.2 ng

29、3;ml-1。2.4.3 精密度试验精密吸取“”项下系列标准溶液 (伞型花内酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的质量浓度分别为0.350，0.948，3.82，20.4 mg·L-1)20 L，按“2.3”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果伞型花内酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素峰面积的RSD分别为0.88%，0.56%，1.1%，0.31%，结果表明仪器精密度良好。 稳定性试验 取供试品溶液，室温放置，按“2.3”项下色谱条件，分别在0，2，4，6，8，10，12，24 h进样测定，记录峰面积。伞

30、型花内酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素峰面积的RSD分别为1.9%，2.3%，1.9%，1.8%，结果表明供试品溶液室温放置24 h内稳定性良好。 重复性试验取了哥王干燥药材细粉 (过60目筛，No.3)，按“”项下方法平行制备6份供试溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定。测得伞型花内酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的平均含量分别为0.0108，0.0440，0.272，1.26 mg·g-1；RSD分别为1.3%，1.5%，1.2%，1.3%，结果表明方法的重复性良好。2.4.6 回收率试验采用加样回

31、收试验法。取已知含量 (伞型花内酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的平均含量分别为0.0108，0.0440，0.272，1.26 mg·g-1)的了哥王干燥药材细粉 (过60目筛，No.3)约0.35 g，共9份，精密称定，分别加入低、中、高3个质量浓度的对照品溶液 (分别相当于药材原有含量的80%、100%、120%)，每一质量浓度取3份，按“”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。伞型花内酯的平均回收率为98.0%，RSD为1.9% (n=9)；西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷的平均回收率为96.6%，RS

32、D为1.2% (n=9)；triumbelletin的平均回收率为96.5%，RSD为1.7% (n=9)；西瑞香素的平均回收率为101.3%，RSD为1.1% (n=9)。结果表明回收率试验符合要求，方法的准确度良好，计算结果见表2-1。2.5 样品含量测定取9个产地的了哥王干燥药材细粉 (过60目筛)，按“”项下方法操作 (其中No.2、No.5和No.7供试品溶液分别稀释5倍、2.5倍和2倍后进行HPLC测定)，按“2.3”项下色谱条件进样测定，按标准曲线法计算伞型花内酯、西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷、triumbelletin、西瑞香素的含量，结果见表2-2。表2-1 了哥王中4种香

33、豆素的回收率测定结果Table.2-1 Recoveries of the four coumarins in Wikstroemia indica (L.)C.A.Mey. (n=9)Marker compoudmorigin/gmadded /gmfound /gRecovery /%Average/%RSD/%umbelliferone3.7993.1506.84796.898.01.93.8053.1506.85596.83.8033.1506.94199.63.8143.8507.51996.23.7893.8507.643100.13.7993.8507.47795.53.8014

34、.5508.24097.63.7884.5508.30399.23.7944.5508.366100.5daphnoretin-7-O-D-glucoside15.4812.3227.6398.696.61.215.5012.3227.6298.415.4912.3227.3396.115.5415.3330.3096.315.4415.3330.2096.315.4815.3330.1595.715.4818.3333.1496.315.4318.3332.8995.215.4618.3333.2396.9triumbelletin95.6976.50171.699.296.51.795.8

35、376.50170.197.195.7776.50171.599.096.0495.70187.395.495.4295.70187.396.095.6995.70187.095.495.72113.2203.995.695.39113.2202.995.095.55113.2203.995.7daphnoretin443.3355.3806.1102.1101.31.1443.9355.3805.8101.9443.6355.3808.3102.6444.9439.0890.4101.5442.0439.0884.4100.8443.3439.0893.2102.5443.4526.3968

36、.499.8441.9526.3964.899.4442.6526.3972.6100.7表2-2 不同产地了哥王中4种香豆素的含量测定结果Table.2-2 Contents of the four coumarins in Wikstroemia indica (L.)C.A.Mey. collected from different regions (n=3)NO.Sampleumbelliferonedaphnoretin-7-O-D-glucosidetriumbelletindaphnoretinContent RSD Content RSDContent RSDContent R

37、SD /g·g-1 /%/g·g-1 /%/g·g-1 /%/g·g-1 /%1Yunnan15.8431.823.371.8-1.7889.01.52Yunnan215.551.9235.31.7169.31.615161.53Guangxi110.801.644.002.0272.00.612601.44Guangxi26.1972.067.791.7351.71.215720.75Guangxi310.281.2183.81.7-2.214621.76Sichuan6.5280.722.401.1170.82.1744.41.97Jiangxi9.

38、5470.838.601.0426.70.810580.98Hunan11.262.025.601.7234.61.314761.69Guizhou16.852.0 35.50 1.2-1.817291.9- Means not detected第三章 结论与讨论3.1 结论该方法简便、准确、重复性好，适用于中药了哥王的质量控制。经测定发现各产地了哥王药材含量差异较大，可能受地域环境或气候影响所致。3.2 讨论a. 分别取适宜浓度的4种香豆素的对照品溶液在200400 nm波长作紫外扫描，结果在345 nm下4个香豆素有共同的较大紫外吸收。且作HPLC检测时，该波长下干扰小，待测组分达到基线分

39、离，重现性良好。故本实验中吸收波长选用345 nm。b. 考察甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%冰醋酸水溶液等流动相系统，结果显示以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相时分离度及峰形能达到较好效果，同时在流动相中加入四氢呋喃，并未明显改善分离效果，故确定以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相系统进行梯度洗脱。c. 分别考察了乙醇、体积分数为25%，50%，75%，80%，90%的甲醇、甲醇作为提取溶剂，采用超声提取法提取了哥王中的4种香豆素，结果表明乙醇提取待测物的色谱峰干扰较严重，本底较高，故不予采用；体积分数为80%的甲醇提取待测成分的含量均较高

40、，故采用体积分数为80%的甲醇为提取溶剂。以体积分数为80%的甲醇为提取溶剂比较加热回流提取法和超声提取法，结果超声提取法的提取率较高。以体积分数为80%的甲醇为提取溶剂，超声处理30，45，60 min，结果表明超声处理45 min样品中的待测成分已基本提取完全，综合考虑提取量和色谱峰的干扰情况，故本研究采用体积分数为80%的甲醇超声处理45 min提取方法。d. 样品测定实验结果：了哥王中triumbelletin和西瑞香素含量明显高于伞型花内酯和西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷。不同产地的了哥王中伞形花内酯和西瑞香素含量差异较小，而西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷和triumbelletin

41、含量差异较大，其中云南产地 (NO.2)的西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷含量最高，四川产地 (NO.6)的西瑞香素-7-O-D-葡萄糖苷含量最低；江西产地 (NO.7)的triumbelletin含量最高，而云南产地 (NO.1)、广西产地 (NO.5)和贵州产地 (NO.9)未测到triumbelletin。本文与参考文献18, 20对比，了哥王中伞形花内酯和西瑞香素的平均含量分别降低约10倍和3倍，说明不同的生长环境、温度、湿度等因素都对了哥王中这2种成分的含量有影响。参考文献1宋小妹, 等. 中药化学成分提取分离与制备M. 北京: 人民卫生出版社, 2004: 48-50. 2何建芳,

42、等. 了哥王研究进展J. 浙江中西医结合杂志, 2001, 11 (2): 129-132. 3耿立冬, 等. 了哥王化学成分研究J. 中国中药杂志, 2006, 31 (10): 817-819. 4耿立冬, 等. 了哥王中的1 个新双香豆素J. 中国中药杂志, 2006, 31 (1): 43-45.5卢艳花. 中药有效成分提取分离技术J. 化学工业出版社, 2006: 215-218.6Gonzalez-Aragon D, Ariza J, Villalba J M. Dicoumarol impairs mitochondrial electron transport and pyri

43、midine biosynthesis in human myeloid leukemia HL-60 cells J. Biochemical Pharmacology, 2007, 73: 427-439.7Kostova I, Momekov G. New cerium (III) complexes of coumarins-synthesis, characterization and cytotoxicity evaluation J. European Journal of Medicinal Chemistry, 2008, 43: 178-188.8Tsai W J, Che

44、n Y C, Wu M H, et al. Seselin from Plumbago zeylanica inhibits phytohemagglutinin (PHA)-stimulated cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells J. Journal of Ethnopharmacology, 2008, 119 (1) : 67-73.9Dongmo A B, Azebaze A G B, Nguelefack T B, et al. Vasodilator effect of the extracts and some coumarins from the stem bark of Mammea africana (Guttiferae) J. Journal of Et