朊蛋白在阿尔兹海默症中作用的研究进展

1、朊蛋白在阿尔兹海默症中的作用摘要：蛋白质构象病是一类由于蛋白构象错误而引发组织病变的疾病。阿尔兹海默症是一类 典型的蛋白质构象病，而关于其相关蛋白， 淀粉样多肽（A）诱发疾病的机理目前有很多 种说法，最近发现朊蛋白在 A 诱发阿尔兹海默症的过程中有着较为重要的作用。本文综述 了朊蛋白与 A 的主要作用方式以及这些相互作用与阿尔兹海默症关系研究的最新研究进 展。关键词：生物化学；阿尔兹海默症； 淀粉样多肽；朊蛋白阿尔兹海默症（Alzheimers Disease，AD）是一类最常见的老年痴呆症，由阿尔兹海默（Alois Alzheimer）博士最早于 1906 年报道1。其临床表现为认知功能退化

2、、记忆力和学习 能力降低，最终丧失自主生活能力2。随着我国人口老龄化程度的加剧，阿尔兹海默症已经 成为了我国国民的重要的健康隐患3。目前对于阿尔兹海默症尚无有效的早期诊断手段和治疗方法，已发现的病理特征为神经 元内部的神经缠结和细胞外的淀粉样斑块4。神经纤维缠结是由一种微管结合蛋白（tau 蛋 白）因过磷酸化从微管上脱离并且自聚集成为纤维状蛋白所导致的。此聚集容易造成神经元 细胞骨架崩解，进而引发神经炎症，同时聚集的纤维在细胞内堆积会造成神经信号通路的敏 感性降低5。淀粉样斑块是由 淀粉样多肽（Amyloid-，A）在大脑的海马区及皮层发生沉积（聚集）造成的，A 是一段长度为 40 多个氨基酸

3、的多肽，由其前体淀粉样蛋白前 体（Amyloid Precusor Protein，APP）水解得到6-8。APP 是一个一次跨膜蛋白，其 N 端暴露在细胞外，在 分泌酶（-secretase，又称 Beta site APP Cleaving Enzyme，BACE1）和 分泌酶（-secretase）的共同切割下可以得到完整的 A 蛋白9-11。由于切割位 点的多样性，得到的蛋白会含有不同数量的氨基酸残基，在人体内含量较多的 A 形式是含有 40 个氨基酸的 A1-40（A40）和含有 42 个氨基酸的 A1-42（A42）. 目前的研究进展表明，A 蛋白的聚集在阿尔兹海默症的发病过程中有

4、着重要的作用，是最重要的致病因素之一13, 14。目前的研究又发现，在神经系统中有着关键生理作用的朊 蛋白在 A 诱发阿尔兹海默症的过程中有着重要的调控作用15。因此，本文旨在讨论朊蛋白 在阿尔兹海默症的发病过程中所起到的复杂作用，同时对多种复杂关系进行分析，对以朊蛋 白为靶点的治疗手段进行了预测。1A 的致病过程和朊蛋白的生理功能 (1).A 的致病过程在 A 的聚集过程中，通常会经过两种状态，首先形成球状的可溶性寡聚 体，寡聚体再进一步形成纤维丝状结构沉淀在细胞膜表面。从单体到寡聚体再到纤维丝要经 历不同的构象，通常 A 蛋白形成纤维丝时会呈现出大量的反向平行的 折叠结构，此结构 对于细胞

5、膜会有伤害并引发细胞凋亡16。然而，有研究表明，在 A 聚集的过程之中，寡聚体往往具有更大的毒性18。实验证明 将寡聚体注射到小鼠脑内会造成小鼠的学习记忆能力降低19，大量细胞实验也证明寡聚体对于细胞具有更大的毒性20-22，甚至有研究表明 tau 蛋白的过磷酸化也可能是由于 A 寡聚 体造成的23。 目前，普遍认为 A 寡聚体通过两种方式造成细胞毒性和神经系统退行：一方面是 A 寡聚体能够附着于细胞膜上从而改变细胞膜通透性24, 25。有实验表明，A 蛋白形成的寡聚 体在膜环境下，往往倾向于形成 螺旋的构象，这一构象容易插入磷脂膜内形成跨膜蛋白26。计算研究发现多个这样的跨膜单位能够组成跨膜

6、通道，进而使得膜内外的水分子和离子的通透性大大增加，最终由于渗透压的改变导致细胞膜的崩解和神经元的凋亡27。在体外的模 拟实验中，也观察到 A 蛋白能够改变磷脂脂质体的离子通透性28。另一方面，A 寡聚体能够与受体结合，介导细胞凋亡和细胞炎症的相关通路29-31。即A 蛋白寡聚体不直接与磷脂膜作用时，而是作为信号分子或信号分子的抑制剂与细胞膜表面的 A 受体结合，导致细胞内异常通路的激活或者正常通路的抑制30。由于生物信号具有 很大的扩增作用，在发病过程中这种效应往往能够发生更大的效用。在目前的研究中，被发 现的受体分子有胰岛素受体等30, 32。不同的受体会有不同的功能，其中朊蛋白是较为特殊

7、 的一种受体15。(2). 朊蛋白的生理功能朊蛋白是动物体内一种高度保守的蛋白，在神经系统中有较高的表达33。成熟的朊蛋 白包含 209 个氨基酸残基并有较为复杂的糖基化修饰，它的 C 端通过糖基磷脂酰肌醇锚定 在细胞膜的脂筏上，并暴露在细胞膜外侧34。游离的朊蛋白容易与糖基化磷脂酰肌醇结合 并定位在脂筏上35, 36。在其 N 端有若干个八肽重复序列，据报道和铜离子有较好的结合能 力37。虽然错误折叠的朊蛋白会引发疯牛病、羊搔痒症等很多传染性神经退行疾病，但是正常 的朊蛋白（也称细胞型朊蛋白，cellular prion protein，prpc）在神经系统中有着较为重要的功 能35。目前发

8、现敲除了朊蛋白基因核心区段的小鼠在低龄期已发生神经退行38, 39，而敲除 不同区段的朊蛋白基因会对神经系统有不同的影响15，说明其对于神经发育有着较为重要 而复杂的作用。同时，朊蛋白在神经系统中还有调节细胞膜内外氧化压力以及离子平衡的作用40，是神经系统中表达量较高而且较为重要的一种蛋白。2朊蛋白在在阿尔兹海默症中对 A 蛋白毒性的影响目前对于朊蛋白在阿尔兹海默症的发病过程中的影响主要有两种观点：其一认为朊蛋白 作为膜锚定蛋白能够起到信号分子受体的作用，通过与细胞外的 A 寡聚体结合引发细胞内 的通路而产生毒性12；另一观点认为朊蛋白能够影响 A 的生成从而起到神经保护作用。实际上，由于朊蛋

9、白本身结构特点以及糖基化修饰的复杂性导致了其本身具有多种功能，此二种功能可能在体内同时存在并且均发挥一定的作用。 (1). 朊蛋白介导 A 引发的神经毒性a.朊蛋白作为受体介导 A 寡聚体诱发的神经毒性Stephen 课题组在 2009 年报道发现，敲除了朊蛋白基因的细胞系对于 A 寡聚体介导的神经毒性不敏感15。剑桥大学 Alun Williams 课题组发现向敲除朊蛋白基因的细胞的培养基 中加入游离的朊蛋白时，A 寡聚体对细胞的毒性会随着加入的朊蛋白量的增加而逐渐恢复 敏感性36，说明很有可能 A 蛋白寡聚体诱发细胞毒性的过程中需要朊蛋白介导。且 AlunWilliams 课题组还发现，朊

10、蛋白的表达量并没有影响 A 蛋白的聚集程度。后来陆续发现，朊蛋白能够介导 A 引起多种生理反应，包括电位失常15, 41、突触损伤36、跨膜物质运输 效率降低36甚至细胞凋亡42等。在体外利用 A 蛋白寡聚体和朊蛋白的实验证据表明，A 蛋白寡聚体和细胞膜上的朊 蛋白能够直接结合，而此结合是细胞毒性产生的原因15, 36, 43-45。Stephen 教授以及都柏林大 学的 Dominic Walsh 教授、伦敦学院大学的 John Collinge 教授等人利用朊蛋白的单克隆抗体 与两种蛋白的结合位点相互作用而阻断朊蛋白和 A 寡聚体的结合，发现神经毒性也随之消 失。Dominic Walsh

11、 教授和 John Collinge 教授还在体外利用免疫学实验证明二者之间的结合 具有特异性，而且结合位点位于朊蛋白的 91-119 位氨基酸之间15。Stephen 教授也发现 95-110 位氨基酸是朊蛋白和 A42 蛋白的结合位点15，敲除这些位点或者利用单克隆抗体与这一位 点结合后，细胞对于 A 寡聚体所诱导的毒性再次显示出不敏感性。Alun Williams 教授、Dominic Walsh 教授以及 John Collinge 教授等人通过实验和计算中 发现，朊蛋白往往以 2:1 甚至更高的比例和 A 蛋白寡聚体相结合15, 36，与多个朊蛋白结合 使得 A 寡聚体与细胞膜表面的

12、朊蛋白集合更牢固。而且有报道表明，A 蛋白寡聚体能够 使得细胞膜表面的朊蛋白增加并富集在 A 寡聚体周围33。因此，由于朊蛋白暴露在细胞膜 外，A 蛋白寡聚体可能通过与朊蛋白结合导致其引发细胞膜内的代谢异常；同时，由于朊 蛋白在神经系统中具有重要的生理功能，A 寡聚体与大量的朊蛋白结合后会造成朊蛋白正 常的功能紊乱。因此我们可以推测朊蛋白在 A 寡聚体诱导神经毒性的过程中有着重要的作 用。b.朊蛋白受体介导神经毒性的作用机理在研究朊蛋白介导的 A 蛋白寡聚体诱发神经毒性的过程中，可以通过对细胞内各种功 能物质和反应的变化来确定朊蛋白受体引发的细胞内反应。2009 年 Alun Williams

13、 教授发现 细胞中突触泡蛋白的量会随着外源朊蛋白加入量的增加而减少，而细胞内被激活的细胞磷脂 酶（cellular phosphalipase A2，cPLA2）会随之增加36。由于突触泡蛋白是跨膜蛋白，细胞膜 的损伤会造成膜蛋白脱落，因而细胞膜的损伤显然是由于细胞磷脂酶的激活引起的。细胞磷 脂酶被激活之后，能够使得细胞膜崩解、突触退化、运输能力降低以及突触膜蛋白脱落等一 系列神经损伤。因此，根据 Alun Williams 小组的工作，朊蛋白介导 A 蛋白诱导神经毒性 的机理很可能是其激活了细胞磷脂酶。虽然朊蛋白不是跨膜蛋白，但是其依然能够传递生物信号，这很可能是因为朊蛋白锚定 在细胞膜的脂

14、筏区，而脂筏是细胞膜功能特异性的区域，在此区域朊蛋白和 A 蛋白寡聚体 的结合或许会影响细胞正常的生理代谢功能。Alun Williams 教授组在离心细胞裂解物时发 现激活的细胞磷脂酶主要出现在脂筏所存在的组分中，说明细胞磷脂酶转移到了脂筏上并且 很可能定位到朊蛋白附近。而从细胞裂解物中分离出脂筏后，利用免疫化学方法能够确定该 组分中有 A 蛋白寡聚体、朊蛋白和细胞磷脂酶的共同存在36。这说明在 A 蛋白寡聚体与 朊蛋白相结合的时候，会使激活的细胞磷脂酶转移到脂筏上，而此时激活的细胞磷脂酶在细 胞膜附近时会对其造成伤害。但如果在细胞裂解物中加入能使脂筏崩解的表面活性剂，则离 心之后无法得到三

15、种蛋白的共聚物36，说明了这三者并非直接作用，而是依赖于脂筏这一 复杂的多功能结构相结合。Alun Williams 教授还通过分析朊蛋白和 A 寡聚体的复合物发现， 在此诱导毒性的过程中，A 蛋白的寡聚体与朊蛋白以 1:2 的比例结合，若使用有两个朊蛋 白表位单克隆抗体与细胞直接作用时，发现细胞毒性和细胞磷脂酶的激活与 A 寡聚体的作用结果相同。这说明 A 寡聚体很可能并不是必需的，而只需要两个朊蛋白分子互相靠近即可。因此推测朊蛋白介导 A 寡聚体的细胞毒性的作用机理有可能是 A 寡聚体其导致细胞 膜表面的朊蛋白的二聚化或相互靠近所导致的， 朊蛋白作为受体介导 A 蛋白寡聚体毒性的过程36，

16、图中黑色星形表示 A 寡聚体，黑色三叉形 表示朊蛋白抗体，其中 prpc 为细胞内朊蛋白，cPLA2 是一种细胞磷脂酶，被锚定在脂筏上。因此，朊蛋白介导 A 寡聚体毒性的关键是二者在脂筏区的结合以及随后诱导的细胞磷 脂酶的激活和定位。Alun Williams 教授组利用抑制剂抑制细胞磷脂酶的作用后，发现朊蛋 白介导 A 寡聚体诱发神经毒性的能力也消失了46，结合 Stephen 教授以及 Dominic Walsh 教授、John collinge 教授等人利用单克隆抗体的方法，可知朊蛋白和 A 寡聚体的结合以及 细胞磷脂酶的激活是 AD 发病过程中的重要步骤，同时也应是治疗 AD 的重要靶

17、点。 (2).朊蛋白对 A 引发的毒性的抑制作用虽然大量的数据发现了朊蛋白是 A 产生毒性的重要因素，但是同样有报道发现朊蛋白 的表达程度的增加，A 蛋白的产生量会有所降低，即朊蛋白能够减少 A 的产生，从而有 一定的神经保护作用47。朊蛋白能够减少 A 蛋白的生成量 由于朊蛋白在自身序列、糖基修饰以及生理功能上都有一定的复杂性和特殊性，因此其在神经退行性疾病中的作用也较为复杂。在不同实验条件下，有时也会发现朊蛋白不具有介导 A 蛋白寡聚体毒性的功能，甚至在阿尔兹海默症的发病过程中有一定的神经保护功能。 英国利兹大学的 Hooper 教授利用朊蛋白表达程度不同的细胞实验发现，随着朊蛋白的 表达

18、程度的增加，细胞所产生的 A 蛋白的量会有所减少，当干扰朊蛋白的表达后，A 蛋 白的生成又会增加47。由于发现 APP 蛋白的表达量并没有减少，而由 分泌酶单独切割 APP 蛋白所产生的 sAPP 的量也会减少，可以推测知道朊蛋白具有抑制 分泌酶的作用效果。a.朊蛋白抑制 分泌酶的机理Hooper 教授利用人工重组质粒的方法分析了在这一保护作用中起作用的朊蛋白片段， 他在朊蛋白基因上的不同区段进行突变后，分析了突变体对于细胞分泌 A 的影响。最终发 现朊蛋白完整的 N 端和 C 端是起到这一保护作用的关键，如果此二片段被敲除或替换，则 朊蛋白不再能够减少 A 的分泌。正常的朊蛋白 C 端上有和

19、糖基化磷脂酰肌醇的连接位点。如果将 C 端与糖基化磷脂酰肌醇结合的位点突变成跨膜单位时，即使朊蛋白能够固定在细胞膜上，却无法行使神经保护作用，这说明朊蛋白的保护作用的发挥依赖于其定位于脂筏上。 而正常朊蛋白的 N 段具有复杂的糖基化修饰，若用肝素将 N 端糖基上的活性位点占据或者 敲掉 N 端糖基化的肽段，其也无法行使神经保护作用47。因此可以推测，朊蛋白上 N 端修 饰的氨基葡聚糖很可能是发挥作用的活性位点。为了进一步研究朊蛋白对于 分泌酶的抑制机理，Hooper 教授组在表达朊蛋白的细胞 的培养基中加入 分泌酶，利用朊蛋白抗体进行免疫共沉淀实验，发现朊蛋白能够特异性 结合 分泌酶，而此结合

20、又能够被肝素可逆地阻断。由此可知 分泌酶与朊蛋白 N 段的糖 基有很好的结合作用。由于朊蛋白在细胞膜表面的分布局限于脂筏上，因此在与朊蛋白上的糖基相结合之后， 分泌酶行使切割作用范围在空间上就大大缩小了。最终 A 蛋白的分泌量降低，对神经元 的损伤也就降低了47。关于朊蛋白对于 A 作用的不同结果的分析 目前对于朊蛋白在阿尔兹海默症中的两种作用均已被证明存在。实际上，由于朊蛋白的结构和后修饰的复杂性，其生理功能具有多重性和复杂性也不难理解。深入分析以上两种不同的影响的机理可以发现，朊蛋白的有害作用主要是 100 位氨基酸 附近的氨基酸残基发挥的作用，该位点和 A 蛋白寡聚体的直接结合导致了朊蛋

21、白的分布变 化从而导致细胞内细胞磷脂酶的激活；而其保护作用主要是通过朊蛋白上修饰的糖基完成， 糖基和 -分泌酶的结合导致了对后者作用的抑制。即朊蛋白的不同区域发挥着不同的生理 功能。由于 Alun Williams 教授组控制朊蛋白的量的方式是向敲除了朊蛋白基因的细胞培养基 中加入游离的朊蛋白，虽然朊蛋白能够自发地与糖基化磷脂酰肌醇结合并被后者锚定在脂筏 上，但是缺乏正常的细胞内蛋白质修饰，某些糖基上的位点的作用可能没有被发现，可能因 此只发现了朊蛋白的毒性作用。在其它的实验中，Stephen 等人通过转染的方式控制朊蛋白 的表达，依然发现了完整修饰的朊蛋白有介导细胞毒性的作用，而 Hoope

22、r 教授组也只发现 了朊蛋白能够导致 A 蛋白的减少，并没有发现此作用可以降低细胞毒性，由此推测，这两 种作用中，朊蛋白的介导细胞毒性的作用占主导。实际上，A 和朊蛋白能够相互调控，APP 被切割分泌后的残基（AICD）能够加强朊蛋白的表达，而朊蛋白反馈减弱 APP 的切割48，这种调节使得二者的量达到平衡，如图 4 所 示。Hooper 教授组发现的朊蛋白下调 A 产生量的作用应该属于这种正常生理状况下的循环 调节的一部分，如图 4 所示，而 Stephen 和 Alun Wiliams 等人发现的过程则是在 A 浓度较 高时 A 寡聚体致病的原因。3结语综上所述，在 A 蛋白介导的阿尔兹海

23、默症的致病过程中，朊蛋白扮演着重要的角色。 某些研究表明朊蛋白可以作为膜受体与 A 蛋白寡聚体结合而激发细胞内信号通路，使细胞 磷脂酶被激活并定位在脂筏上，细胞磷脂酶能够水解细胞膜的酯键，使得细胞膜可塑性降低、 突触退化、膜蛋白脱落甚至细胞凋亡。同时由于朊蛋白上具有较为复杂的糖基化修饰，其 N 端修饰的糖基能够和 分泌酶相结合并将其固定在脂筏区，这一结合使得 分泌酶的作用范 围在空间上被限制，从而降低了其切割效率，减少了 A 蛋白的生成量，减弱了 A 蛋白的 毒性。从细胞实验的结果来讲，前者的作用对于 A 细胞毒性的影响的作用更为明显，后者 虽然调节了 A 蛋白的分泌量，但不足以降低 A 蛋白

24、寡聚体的毒性，然而如果针对朊蛋白 设计药物时，其神经保护作用也是不可忽视的。尽管目前对于朊蛋白在阿尔兹海默症致病过程特别是 A 蛋白诱导的神经损伤过程中所 扮演的角色有着不同的争论，但事实上目前的结果并不矛盾。而是由于实验条件的差异，以 及朊蛋白本身的复杂性，其在阿尔兹海默症致病过程中的功能和作用还没有完全清楚。也正 是因为其复杂性，在阿尔兹海默症的发病研究和寻找治疗靶点上，朊蛋白是不可忽视的因素。参考文献 (References)1 Tanzi R E, L Bertram. Twenty years of the Alzheimer's disease amyloid hypoth

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