《基因工程基本实际操作程序》导学案

1、基因工程基本实际操作程序导学案1.1.简述基因工程原理及基本操作程序。简述基因工程原理及基本操作程序。2.2.明确获取目的基因的方法。明确获取目的基因的方法。3.3.掌握将目的基因导入受体细胞的方法。掌握将目的基因导入受体细胞的方法。4.4.掌握目的基因检测与鉴定的方法。掌握目的基因检测与鉴定的方法。一、目的基因的获取1.从基因文库中获取所有一部分基因文库种类2.利用PCR技术扩增目的基因(1)含义:是一项在生物体外 的核酸合成技术。(2)原理: 。(3)过程:第一步,加热至9095 DNA解链为 ;第二步,冷却至 ,引物与两条单链DNA ;第三步,加热至7075 , 从引物起始进行互补链的合

2、成。(4)特点: 形式扩增。3.人工合成法:如果基因较小, 又已知,可以通过 用化学方法直接人工合成。复制特定DNA片段结合DNA双链复制单链核苷酸序列DNA合成仪5560 热稳定DNA聚合酶(Taq酶)指数111.组成:目的基因、 、 、标记基因。2.功能:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以 给下一代;使目的基因能够 和发挥作用。3.启动子:位于基因的首端,是 酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA。4.终止子:位于基因的尾端,功能是终止 。5.标记基因:鉴别受体细胞中是否含有 ,从而将符合要求的受体细胞筛选出来。终止子遗传启动子RNA聚合目的基因转录121415181716表达

3、13二、基因表达载体的构建 1.基因工程的基本步骤中,哪几步用到了限制酶?哪几步涉及碱基的互补配对?答案：答案： 第一、二步用到了限制酶; 第一、二、四步涉及碱基的互补配对。 2.启动子与起始密码子,终止子与终止密码子有何区别?答案：答案： 简单地说,启动子和终止子都是一段特殊的DNA序列,属于基因的非编码区,分别位于编码区的上游和下游,负责调控基因的转录。而起始密码子和终止密码子都是mRNA上的三联体碱基序列,分别决定翻译的起始和终止。启动子DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域。起始密码子蛋白质翻译过程中被核糖体识别并与起始tRNA互补配对的三个碱基序列。终止子转录过程

4、中能够终止RNA聚合酶转录的DNA序列,使RNA合成终止。终止密码子蛋白质翻译过程中终止肽链合成的信使核糖核酸的三个碱基序列。知识点一知识点一:目的基因的获取目的基因的获取 目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因,也可以是一些具有调控作用的因子。如:与生物抗逆性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因,以及与工业所需用酶相关的基因等。 答案：答案：1.你对目的基因的概念是怎样理解的? 基因组文库包含某种生物的全部基因,而部分基因文库只包含某种生物的部分基因;基因组文库中的基因含有外显子和内含子,而部分基因文库中的基因没有;部分基因文库中的基因在物种间可

5、以交流,而基因组文库中的基因只有部分可以。2.简要说明基因组文库和部分基因文库之间的区别。答案：答案： 3.请列表比较目的基因几种获取方法的过程及优缺点?方法基因文库的构建PCR技术扩增人工合成基因组文库部分基因文库过程优点缺点 供体细胞中的DNA限制酶许多DNA片段插入载体导入受体菌群(基因组文库)外源DNA扩增,产生特定性状分离目的基因蛋白质的氨基酸序列推测mRNA的核苷酸序列推测结构基因的脱氧核苷酸序列目的基因目的基因DNA单链DNA大量目的基因mRNA反转录单链DNA合成双链DNA(cDNA)插入载体导入受体菌群(cDNA文库)分离目的基因专一性强可在短时间内大量扩增目的基因专一性强,

6、可产生自然界中不存在的新基因工作量大,盲目性大,专一性差操作过程较麻烦,技术要求高适用范围狭小相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果4.请比较PCR技术与DNA复制的异同点,补充完成下表。比较项目PCR技术DNA复制在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子DNA双链复制(碱基互补配对)四种游离的脱氧核苷酸模板、ATP、酶等解旋酶催化DNA在高温下变性解旋体外复制主要在细胞内热稳定的DNA聚合酶细胞内含有的DNA聚合酶知识总结知识总结 区分基因、基因文库、目的基因区分基因、基因文库、目的基因1.1.基因是有遗传效应的基因是有遗传效应的DNADNA片段片段, ,是控制性状的遗传物质的基

7、本结构和功是控制性状的遗传物质的基本结构和功能单位能单位, ,基因的脱氧核苷酸序列代表遗传信息。基因的脱氧核苷酸序列代表遗传信息。2.2.基因文库是将含有某种生物不同基因的许多基因文库是将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段片段, ,导入受体菌的导入受体菌的群体中储存群体中储存, ,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因各个受体菌分别含有这种生物的不同基因, ,叫作基因叫作基因文库。文库。3.3.目的基因是基因工程操作中需要的外源基因目的基因是基因工程操作中需要的外源基因, ,它是它是编码某种蛋白编码某种蛋白质的结构基因。质的结构基因。1.构建基因表达载体的目的是什么?知识点二知识点二:基

8、因表达载体的构建基因表达载体的构建 构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在,并可以遗传给下一代,同时,使目的基因能够表达和发挥作用。答案：答案： 2.基因表达载体由哪些组分组成?各组分起什么作用? (1)基因表达载体的组分:目的基因、启动子、终止子、标记基因。(2)各组分的作用:目的基因控制蛋白质的合成或起调控作用;启动子是一段特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,是mRNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA;终止子是一段有特殊结构的DNA短片段,位于基因的尾部,能使转录在所需的地方停止下来;标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因

9、的细胞筛选出来。答案：答案： 3.基因表达载体是在何处如何构建的?基因表达载体在体外构建,方法如下:答案：答案： 4.将目的基因与载体混合并用DNA连接酶处理后,会出现几种结果?怎样从中筛选出所需要的重组质粒? (1)会出现三种结合方式:目的基因与载体结合;目的基因与目的基因结合; 载体与载体结合。 (2)利用质粒中含有的一些标记基因如抗生素基因等所赋予的重组质粒的特性进行筛选。答案：答案： 知识总结知识总结1.1.载体与基因表达载体的区别载体与基因表达载体的区别: :二者都有标记基因二者都有标记基因, ,但基因表达载体在但基因表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。载体

10、基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。2.2.基因表达载体的构建是基因工程的核心。基因表达载体的构建是基因工程的核心。3.3.由于受体细胞和导入方式存在差异由于受体细胞和导入方式存在差异, ,所以基因表达载体的构建不能所以基因表达载体的构建不能千篇一律。千篇一律。4.4.用同一种限制酶切割目的基因和载体的目的是为了获得相同的黏性末用同一种限制酶切割目的基因和载体的目的是为了获得相同的黏性末端端, ,用不同的限制酶切割目的基因和载体的目的是为了防止自身用不同的限制酶切割目的基因和载体的目的是为了防止自身环化。环化。1.转化:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内 和表达的过程。2.导

11、入植物细胞的方法: 、基因枪法、 。农杆菌特点:易感染 植物和 植物;Ti质粒上的 可转移至受体细胞,并且整合到受体细胞 上。3.导入动物细胞的方法: 注射技术。4.导入微生物细胞的常用处理方法:用 处理受体细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为 。农杆菌转化法花粉管通道法维持稳定裸子染色体的DNAT-DNA19202121242322双子叶25三、将目的基因导入受体细胞显微26感受态细胞28Ca2+271.检测及方法(1)检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了 ,采用DNA分子杂交技术。(2)检测目的基因是否转录出了 ,采用分子杂交技术。(3)检测目的基因是

12、否翻译成蛋白质,采用 杂交技术。2.鉴定:除了分子检测外,还需要进行 水平的鉴定,如抗虫、抗病鉴定等。目的基因个体生物学mRNA293031四、目的基因的检测与鉴定抗原抗体321.转化的实质是什么?常见的转化方法有哪些?知识点三知识点三:将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。不同受体细胞的转化方法不同,分别如下:答案：答案： 受体细胞种类方法植物细胞农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法动物细胞显微注射法微生物细胞Ca2+处理法2.早期基因工程操作都用原核生物作为受体细胞,试分析原核生物作为受体细胞的优点。 原核生物细胞具有一些其他生物没

13、有的特点,如繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等,因此,早期基因工程操作都用原核生物作为受体细胞。答案：答案： 3.请归纳总结各种导入方法的转化过程。 (1)农杆菌转化法:目的基因插入Ti质粒的T-DNA农杆菌导入植物细胞稳定维持和表达。(2)显微注射法:目的基因表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育新性状动物。(3)Ca2+处理法:Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子。答案：答案： 1.为什么要有“目的基因的检测与鉴定”这一步骤?知识点四知识点四:目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定 因为目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中,是否能够在受体

14、细胞中稳定遗传和正确表达,只有通过检测、鉴定才能得知。答案：答案： 类型 步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步目的基因是否进入 是否成功显示出杂交带第二步目的基因是否 是否成功显示出杂交带第三步目的基因是否 是否成功显示出杂交带 鉴定包括抗虫、抗病的接种实验,以确定是否有抗性以及抗性的程度;基因工程产品与天然产品的活性比较,以确定功能是否相同等2.如何进行目的基因的检测?结合下表完成检测与鉴定内容和方法的比较。受体细胞DNA分子杂交(DNA和DNA之间)转录出mRNA翻译出蛋白质分子杂交技术(DNA和mRNA之间)抗原抗体杂交个体水平知识总结知识总结外源基因在受体细胞内表达的理论基础外源基因

15、在受体细胞内表达的理论基础1.1.基因是控制生物性状的遗传物质的结构单位和功能单位。基因是控制生物性状的遗传物质的结构单位和功能单位。2.2.遗传信息的传递和表达都遵循中心法则的信息流动方向。遗传信息的传递和表达都遵循中心法则的信息流动方向。3.3.生物界共用一套遗传密码。生物界共用一套遗传密码。例例1 1下列关于基因文库的说法,错误的是()。 A.可分为基因组文库和部分基因文库 B.cDNA文库属于部分基因文库 C.在基因组文库构建中不需要用到限制酶和DNA连接酶 D.同种生物的cDNA文库基因数量较基因组文库基因数量少C【解析】基因组文库构建中需用到限制酶和DNA连接酶。技巧归纳技巧归纳1

16、.1.在理解基因文库的概念时一定要明确在理解基因文库的概念时一定要明确: :虽然基因文库中含有某种生虽然基因文库中含有某种生物的全部基因物的全部基因, ,但基因文库不是直接保管某种生物的基因但基因文库不是直接保管某种生物的基因, ,而是保管受而是保管受体菌体菌, ,某种生物的基因是在受体菌中得到保管的。某种生物的基因是在受体菌中得到保管的。2.2.由于人工合成的目的基因没有非编码系列由于人工合成的目的基因没有非编码系列, ,故其在与载体重组时故其在与载体重组时必须加入启动子和终止子。必须加入启动子和终止子。例例2 2科学家在培育抗虫棉时,起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中,然后导入棉

17、花的受精卵中,结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端),导入棉花受精卵,长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端),导入棉花受精卵,结果长成的植株有了抗虫能力。请回答下列问题:(1)由以上过程推知,作为目的基因的载体应具备的结构是 。(2)基因表达载体的构建过程是在(细胞内、细胞外)进行的,需要的工具有。启动子具有 的作用。(3)当苏云金芽孢杆菌的抗虫基因和质粒混合后,在DNA连接酶的作用下会有几种结合方式?分别是什么?目的基因、启动子、终止子、标记基因细胞外限制酶和DNA连接酶驱动基因转录出mRN

18、A三种结合方式,即抗虫基因和载体结合、抗虫基因和抗虫基因结合、载体和载体结合(4)请绘出一个基因表达载体的模式图。基因表达载体模式图如下:【解析】在基因表达载体构建的过程中需要限制酶切割质粒,还需要DNA连接酶连接黏性末端;启动子是RNA聚合酶的结合位点,能驱动基因转录出mRNA。技巧归纳技巧归纳1.1.绘制基因表达载体模式图的要点绘制基因表达载体模式图的要点: :要将模式图绘制成圆形要将模式图绘制成圆形, ,因因质粒是环状的双链质粒是环状的双链DNADNA分子。要将组成基因表达载体的各组分都绘制分子。要将组成基因表达载体的各组分都绘制出出, ,包括复制原点、启动子、目的基因、终止子、标记基因

19、。包括复制原点、启动子、目的基因、终止子、标记基因。2.2.启动子启动子(DNA(DNA片段片段)起始密码子起始密码子(RNA),(RNA),终止子终止子(DNA(DNA片段片段)终止密码终止密码子子(RNA)(RNA)。3.3.用同一种限制酶切割目的基因和质粒后用同一种限制酶切割目的基因和质粒后, ,产生的黏性末端都相同产生的黏性末端都相同, ,用用DNADNA连接酶连接后连接酶连接后, ,可形成三种两个可形成三种两个DNADNA片段之间的连接产物片段之间的连接产物, ,不便不便于筛选于筛选, ,故通常用两种不同的限制酶同时切割目的基因和质粒故通常用两种不同的限制酶同时切割目的基因和质粒,D

20、NA,DNA连接酶作用后只能形成重组质粒连接酶作用后只能形成重组质粒, ,便于筛选。便于筛选。例例3 3关于将目的基因导入受体细胞的说法中,正确的是()。A.将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是花粉管通道法B.将目的基因导入动物细胞采用最多的方法是显微注射技术C.为使大肠杆菌易吸收DNA分子,应先用缓冲液进行处理D.在显微注射技术中,不需先构建基因表达载体B【解析】将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法;为使大肠杆菌易吸收DNA分子,应先用氯化钙溶液进行处理,使其成为感受态细胞;在显微注射技术中,导入受体细胞的是构建好的基因表达载体。技巧归纳技巧归纳1.1.将目的基因导入受体细胞前将目的基因导入受体细胞前, ,都必须进行目的基因表达载体的构建都必须进行目的基因表达载体的构建, ,而不能直接导入目的基因。而不能直接导入目的基因。2.2.转化过程也是一个基因重组的过程。转化过程也是一个基因重组的过程。3.3.将目的基因导入单子叶植物不采用农杆菌转化法。将目的基因导入单子叶植物不采用农杆菌转化法。例例4 4目的基因导入受体细胞后,是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是()。检测受体细胞是否有目的基