影响血凝和血凝抑制试验因素的探讨与分析.docx

1、影响血凝和血凝抑制试验因素的探讨与分析宋建国，周峰(甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃兰州730046)摘要：血凝抑制试验具有所需S5材简单、操作方便、试验培果判定快速等优点，但该试验影响因素很多，常造成检测结果出现较大偏差。本文从试验器材、试剂、待检血清、缓冲液、红细胞、微量血凝板、环境温度及其他影响因素进行综合分析，旨在避免或减少不利因素的影响，提高试验的准确性。关键词：禽流感；新城疫；产下降综合征；血凝抑制试毁；影响因素中图分类号：S852.5+3文献标识码：A文章编号：1001-0769(2015)10-0059-03血凝抑制试验(HI)由于所需器材简单、操作方便、试验时间短等优点，是一

2、种在基层临床实践中极易推广的检测手段与诊断方法。然而，在血凝抑制试验方面，由于受个人技术、试验条件、环境等诸多因素的限制与影响，影响了试验结果的准确性，导致检测结果不准确甚至错误。现分析如下。1器材的选择和使用为获得准确的检洌结果，严格按相应的标准操作程序使用单道、多道移液器，使其始终保持最佳工作状态。新购移液器在使用前、旧移液器在使用一段时间后均应进行校正或鉴定。选购正规厂家生产、质量较好的微量反应板、吸头等一次性耗材。1.1单道、多道移液器使用注意事项(1) 吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，不允许突然松开，以免因吸液过快，液体冲入加样器内，使柱塞腐蚀而造成漏气；(2) 为获得较高的精确

3、度，在正式加样前，按紧吸头后先吸取溶液一次，湿润吸头，直接吸取因吸头内壁应残留一层"液膜”，造成排液量偏小而产生误差；1.296孔V型微量反应板(1)建议采用96孔110°V型有机反应板进行血凝收稿日期：2015-07-06.试验(HA),但注意不要使用底部磨损严重和底部不干净的反应板。采用一次性优质塑料反应板(90°或110°均可)进行HI。(2) 使用有机反应板进行HI时，建议按如下程序清洗：试验结束后，立即用带有压力的自来水反复冲洗(以看不到孔底有红血球为准)，用力甩干孔内剩余的水滴，需要时反扣在吸水纸上排干。置2%3%浓度的盐酸浸泡过夜(12h以

4、上)后，捞出反应板并小心将孔内残留盐酸甩到盐酸缸内，用自来水冲洗后，用蒸馋水冲洗23次,甩干水分置温箱中烘干备用。及时淘汰损坏和底部洗不干净的反应板。(3) 不建议使用镣子夹棉花或使用试管刷涮洗有机反应板凹孔，以免对反应板板面和孔内造成损伤。(4) 建议购买材质较好的有机反应板，试验前应尽可能挑选干净、内孔壁平滑工整的反应板，避免因板子质量问题造成试验结果的偏离。有机反应板材质有好有坏，价格便宜的反应板质量差、多内孔粗糙、V型底部不工整。因此在采购时，需要进行挑选。以减少因反应板对血球凝集和结果的判定产生影响。2选择相应的检洲技术标准HA与HI试验，虽然原理相同、方法相似，但禽流感、新城疫和产

5、蛋下降综合征等病各自执行标准却不尽相同，特别是有些关键环节存在较大差异。高致病性禽流感诊断技术(GB/T18936-2003)、新城疫诊断技术(GBJ16550-2008)和产蛋下降综合征诊断技术(NY/T551-2002)三个标准对HA与HI试验中红血球的离心速度要求存在明显差异。NY/T551-2002中抗原对照设置也不同于前两个标准，所用稀释液也非PBS,而是生理盐水。并且前两个标准与SPF鸡红细胞凝集抑制试验(GBAT17999.2-2008)中的要求也不相同。因此，不同的检测项目应选用相应的检洌技术标准来开展检测，确保试验执行标准的统一性和规范化，是保证试验结果准确性和一致性的重要前

6、提。3配液用量具配液时选择精准度高的容量瓶、玻璃吸管和移液器。建议不要使用精准度低的量筒(特别是大量程量筒和圆锥形量简误差更大)和注射器，量筒一般用于精确度要求不是太高的液体配制(如洗液、消毒液等)，普通注射器的准确性也不高。4试剂4.1稀释液4.1.1倍酸盐试剂不同的检测项目，要求使用的稀释液(磷酸盐缓冲液PBS)不同。特别是高致病性禽流感和新城疫检测所用稀释液采用的化学试剂有差异。磷酸盐必须选用分析纯的试剂，称量前应注意选用相应要求的试剂，结晶水分子数不一样或进行结晶水分子换算。4.12灭菌和pH值调整配好的PBS须及时进行高压灭菌或过滤。而且在高压灭菌后，需要对稀释液的pH值进行再次调整

7、。PBSpH值必须满足标准要求。4.1.3稀障液禽流感和新城疫试验使用的稀释液必须为0.01mol/LpH值7.07.2的PBS,最好不要用生理盐水，因为PBS对其他酸碱物质具有一定的缓冲能力，能维持反应体系的pH®,而生理盐水不具备缓冲功能。试验中使用的PBS在pH值在5.18以下，易造成红细胞自凝，pH值在7.3以上时凝集的红细胞洗脱加快，而pH值为7.07.2时红细胞沉淀最充分，观察效果最理想。4.1.4抗凝剂选用分析纯柠摞酸三钠配制，浓度为3.8%,配好后进行高压灭菌。4.21%红细胞制备(1) 为防止血球发生自凝，采血时应用预先吸有3.8%柠檬酸钠采集至少3只SPF公鸡无禽

8、流感与新城疫等抗体的健康公鸡血液，所采血液与抗凝剂按4：15：1的比例混合，采完后应及时把针管小心颠倒几次，避免出现凝血块或溶血。(2) 离心洗涤红细胞时，选择10mL左右的"V"型玻璃离心管进行红细胞洗涤，建议不要使用5mL或10mL等大小的“U"型塑料离心管洗涤红细胞，因"U"型离心管离心时红细胞沉淀不彻底，进而影响洗涤效果，最终影响红细胞质量。(3) 按相应标准要求选择不同的离心速度进行离心。禽流感抗体检测1000rpm离心10min,新城疫抗体检测2000rpm离心5min10min,产蛋下降综合征抗体检测2000rpm离心5min2次

9、，第3次高心10min,4.3抗原和阳性血清(1) 新的未开封冻干抗原和阳性血清，按抗原瓶身说明要求用1mL移液器取相应要求量的PBS(产蛋下降综合征用生理盐水)进行稀释；(2) 已稀释配制好但暂时不使用的浓缩抗原、阳性血清和均应在冰箱4°C保存，有条件的实验室4HAU抗原可放置在实验台面上的冰盒内。(3) 4HAU抗原需现配现用。为验证洌出的浓缩抗原血凝价和4HAU抗原配制是否准确，须做4HAU抗原回归试验：取0.025mL的PBS加入反应板的第26孔；将配制好的4HAU抗原0.025mL分别加入第1和2孔，然后从第2孔依次倍比稀释至第6孔，最后弃去0.025mL；各孔再加PBS0

10、.025mL,最后加1%红细胞悬液0.025mL混匀，室温静置30min观察结果。若4HAU、2HAU和1HAU能使1%红细胞完全凝集，而1/2HAU、1/4HAU和1/8HAU不能完全抑制，说明4HAU配制准确，否则需要重新洌定浓缩抗原的HAU或对4HAU浓度进行微调，直至抗原回归试验成立。5操作(1)使用微量移液器移液时慢吸慢放，以保证加样的准确性和避免样品和试剂加在孔壁上或溅出板孔产生气溶胶。加样时移液器吸头应垂直加入液体，禁止与孔内液体接触。不允许移液器吸头插入反应板孔内液面下加液体，防止发生交叉污染；首次加液时尽量将所加液体加在V型板的底部，避免加在孔壁上部；(2) 加样的顺序应该是

11、由低浓度到商浓度，即先加低浓度孔(第12孔)，后加高浓度孔(第1孔)，以减少样品加入时造成交叉污染；(3) 倍比稀释时不能速度太快、用力过猛，避免产生过多气泡，使吸头内有大量气泡，造成移液量误差，影响反应过程，造成检测结果的偏离；(4) 1%红细胞悬液在试验过程中须随时用随时摇匀，使之呈均质状态。(5) 每个反应板尽量都要设置阴阳性对照，以验证试验是否成立。6孵育温度与时间孵育温度对试验的影响较大，温度既影响HA与HI的滴度，也会影响反应的速度。从4°C37°C,随看温度的上升，HA与HI的滴度随之升高。温度过低反应速度减慢，温度过高会使反应结果洗脱加快，所以孵育温度常控制

12、在室温(20°C25°C)。此外，孵育时间须严格控制在20min40min之间。HI试验的反应时间与试验环境温度成反比，即环境温度越高所需反应时间相对较短；环境温度低于4°C时红细胞可能发生自凝现象。因此，建议在反应20min后，随时观察反应结果，摸索试验终点时间，以便获得最准确结果，若纽扣状沉淀较小或发现泪流状流淌线细，可加长孵育时间。7结果的判定(1) HA结果判定以红细胞完全凝集的病毒最大稀释度为抗原凝集价。(2) 在阳性血清对照、抗原对照和1%红细胞对照完全正确情况下，将微量反应板倾斜45°左右(不大于60°),孔底沉淀的红细胞流动性好，呈泪珠样流淌，边缘无凝集颗粒的为凝集完全抑制，能完全抑制4个血凝单位抗原的血清最高稀释度为HI滴度。HI滴度的判定受主观因素影响较大，判定时需要与对照孔进行比对，与其泪滴大小、流速快慢一致的最后孔为其最终值。一般来说，以红血球对照完全沉淀的前后5min内判定试验结果较好,大约在20min40min左右。8小结HA和HI试验结果准确与否，试验中的每个因素都