抗病毒多肽疫苗临床研究现状.docx

1、专题综述抗病毒多肽疫苗临床研究现状薛冰肖长义叶红（三峡大学医学院，宜昌443002）中国图书分类号R392.1文献标识码A文章编号自20世纪80年代Stnihmaier等"人发现口蹄疫病侏（FMDV）的146154及200213氨基酸肽段含免疫学位点，从而找到了一种新型疫苗，即肽疫苗。多肽疫苗安全性好，不具备传染疾病的危险，具有高度的特异性，价格低廉，易于保存和应用，且随着分子免疫学、分子生物学和现代生物工程技术的发展，近年来成为疫苗研究的热点。目前匕百种肽得到发展，数十种肽疫苗已进行临床试验阶段。主要集中在人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒和人乳头瘤病毒3种抗病毒多肽疫苗研究方面。1

2、HIV（Humanimmunodeficiencyvirus）多肽疫苗的研究现况艾滋病继续在全球蔓延，根据UNAIDS/WHO2007年最新统计数据显示，仅2007年即新增250万感染者，约210万成年人和儿童因HIV感染而死亡。教育和行为规范是控制H1V流行的重要因素，同时H1V疫苗的研发亦成为当下迫切需要尽管对于HIV疫苗的研究L1经过去20多年，目前还没有一种应用于临床，但临床前试验已取得巨大进展。虽然抗HIV免疫保护的具体相关因素还没有确定，多数专家均认为布效的HIV疫苗应该引发体液和细胞免疫应答。HIV肽疫苗具有引发CD4和CD8,细胞免疫应答的能力，在复合抗原或抗原混合物的外表面显

3、露的肽可能诱发亚优势表位应答，HIV基因的肽代表区也已经被确定。HIV-1基质蛋白pl7（matrixproteinp!7）与病毒复制有关，其不同的免疫调制性质与病毒发病机制本文受国家H然科学基金项目（3O77OUM）、湖北省只生厅资助（No.鄂卫科【2006197号JX3B32）及湖北省教育厅垂大课题资助（No.鄂教科：20074号7200713002） 湖北省宜昌市中心人民医院，宜昌443000作者简介：牌冰（1982年-）,女.在读硕上.主要从事肿痛免疫学方面研究,E-mail：2011lxuebing163.cum;通讯作者及指导教师：fl长义（1958年-）,男，教授，博土生导师，主

4、要从审病霍感染与免疫学方面的研究Kiaochyclgu.cdu.5。1000-484X（2009）1MO5O-Q5有关，是H1V-1中和抗体的靶位,pl7抗体的水平高低与AIDS的进展缓急有关。事实上已经显示pl7在体外可加强HIV-1的复制，负性调节CD4+T细胞,NK细胞，树突状细胞，单核细胞的激活、分化及增殖。最近还发现在HIV-1感染者血清中可以检测到P17,a持续存在于病人的淋巴结中。因此，HIV-1基质蛋白pl7成为抗艾滋病治疗性疫苗的候选抗原。FiorentiniS等合成了针对HIV-1p!7的多肽，用这个由20个氨基酸（SGGELDRWEKIRL-RPGGKKK）组成的合成肽（

5、命名为AT20）结合载体蛋白钥孔戚血蓝素（KeyholeLimpetHemocyanin,KU1）共同免疫BALB/c鼠，产生抗AT20的中和抗体，抗体滴度超过1：25000,其可终止所有病毒蛋白的生物学活性。由于艾滋病肽疫苗面临的主要挑战是HIV-1株的多样性，为了评估AT20-KLH作为广谱候选疫苗的能力，Fio厅miniS等从乌干达人HIV-1A和C亚型中抽取4例不同的重组体p!7蛋白（含AT20表位突变点），使用该肽疫苗进行效果评价。结果发现尽管AT20表位存在突变点，p】7依然能与其受体P17R结合，在1：50血清稀释度检测到相同的生物学活性。令人惊奇的是,AT20-KLH产生的抗体

6、既能识别线性表位（aa922之间），又能识别构象表位。AT20-K1B的这些临床前免疫研究数据为肽疫苗的I期临床试验提供了研究基础。KranAM等使用Vacc-4x肽疫苗，基于HIV-1核心蛋白p24共有序列基础上的四个水溶性肽（长度为2427个aa）组成，免疫40位HIV阳性患者。整个免疫过程中无一例发生严重不良反应，患者在体力状态、生命征象和安全参数方面均未改变。同时，体外诱导T细胞增殖试验（16位病人未被免疫，作为阴性对照）:在12周，11位患者中9位（81%）检测到Vacc-4x特异性增殖反应；在26周，25位患者中20位（80%）持续存在特异性增殖反应，而未免疫组16位中仅5位（31

7、%）产生弱的免疫应答。该研究显示了候选肽疫苗Vacc-4x在大多数病人中能安全诱导HIV相关性T细胞应答。Nehete等用猴-人耳有抗原性的8个高度保守HIV-1被膜肽组成联合肽疫苗(Peptide-cocktailvaccine),该疫苗通过FM0C固相法在肽合成仪上合成，纯度超过95%,免疫印度起源掰猴，通过酶联免疫吸附试捡检测到特异性的IFN-y诱导细胞和T细胞增殖，启动强的细胞免疫应答。PialouxG等"仞用HIV六脂肽疫苗(threeNef,twoGag,andoneEnvlipopeplide)分别在0、3、6周免疫24位HIV-l感染者,23个患者中16个(70%)对

8、HIV-1肽中的至少一种产生CD4+T细胞增殖反应，13个(57%)检测到CD8+T细胞应答,90%的患者对HIV-1肽中的至少一种获得CD4和/或CD8反应。HIV肽疫苗由于弱的免疫原性使其发展受限，寻求并确定HIV肽疫苗的最佳佐剂以增强免疫原性成为必要，如制备的细胞因子C4-V3HIV肽疫苗已确定能增强机体的体液免疫应答此。同样地，GM-CSF通过吸附巨噬细胞诱导其成熟，增强抗原递呈作用来加强免疫应答，同时具有增强乙肝疫苗和利什曼原虫疫苗的应答活性。在临床试验前研究中,GM-CSF与HIVDNA,病毒样颗粒或活病毒体疫苗联合，均显示好的佐剂效果。Speannan等”对多表位肽(Multie

9、pitopepeptide,MEP)疫苗的免疫原性进行评估，这是HIV候选疫苗在人体上的首例研究。HIVCTL多表位肽(MEP)疫苗是由4个CTL多表位肽与油水相乳剂(RC529-SE),加或不加GM-CSF辅佐剂组成。这4种肽被指定为A、B、C和J,范围在aa2747之间。2004至2005年美国的7个区96位受试者参与了本试验，年龄在18-50岁之间。分别在。天、28天、84天给予3种剂句:组，其中40位接种CTLMEP/RC529-SE,40位接种CTLMEP/RC529-SE+GM-CSF,16位给予生理盐水作为控制组，追踪随访15个月。第一次免疫后2周应答率较低，CTLMEP/RC5

10、29-SE组7.5%,CTLMEP/RC529-SE+CM-CSF组7.9%。第三次免疫后2周两组均达到92%,98天时达100%。98天时在不加GM-CSF组和加GM-CSF组中CTLMEP特异性抗体应答中位数分别是8569和16324,具有统计学差异。2 HCV(HepatitisCvirus)多肽疫苗的研究现况目前全世界估计有1.7亿人感染HCV(HepatitisCvims),每年新增感染人数达300400万,持续的HCV感染最终导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌，严重危害人类健康，近年来针对HCV合成的疫苗尤其肽类疫苗取得的发展与效果，显示其可以成为解决HCV感染的良好途径。Yutani等I

11、"：对12名HCVlb(+)的患者免疫接种HCVlb衍生肽，评价肽疫苗的安全性和免疫应答效果。4个疫苗候选肽接种于HLA-A24(+)患者，诱导产生CTL和体液免疫应答。这4种不同的合成肽是从HCVlb的高度保守区获得的：蛋白E1衍生肽，位于aa213221(El213221,VYEAADM1M);蛋白E2衍生肽，位于aa488496(E2488496,HYAPRPCGI);非结构区3衍生肽，位于aa1081090(NS31081-1090,VYHGAGSKTL)及非结构区5A衍生肽，位于aa21322140(NS5A21321 140,RYAPACKPL)o皮下注射肽，24小时后皮

12、肤硬结5mm或红斑10mm作为阳性对照，用HIV肽作为阴性对照。每两周一次注入患者腹部皮下,一个周期接种7次，所有12名患者至少接种2个周期，分析肽的安全性和免疫原性。整个研究过程没有发现严重的细胞毒性反应，肽疫苗接种剂量与症状起始和持续时间没有相关性，患者对该疫苗具有极好的耐受性。接种0.3mgJmg和3mg肽观察到分别有1/4J/4和3/4的患者对肽产生了特异性的CTL反应；相应地，检测到有0/4、3/4、3/4的患者IgG抗体滴度增强，即剂量越大，免疫效果越强，为剂量依赖性。这一结果为进一步临床研究提供了很大支持。由于HCV感染T细胞反应微弱，且被膜抗体在慢性感染患者和动物试验中不能产生

13、相应的中和反应,F1M等设想建立由表位特异性CD8+CTLs和CD4+反应所致的抗HCV免疫应答效果会更佳,若使用特征性表位包括大部分HLA-A2限制性表位的疫苗也将更具优势,基于上述假设合成的IC41肽疫苗便具有这一特性oIC41包含至少4个HLA-A2限制性CTL表位及3个高度泛宿主性的CD4辅助T细胞表位,以多聚-L精氨酸作为IC41佐剂。在一组随机的、安慰剂控制下的试羚中，对128位HLA-A2阳性健康志愿者给予4次皮下注射,7个不同剂tto结果显示IC41安全，具有极好的耐受性，轻度到中度的局部注射反应是暂时的，旦所有剂量组对IC41均能诱导产生特异性的免疫应答。检测CD4*T细胞增

14、殖反应，接种0.5mgIC41+多聚精氨酸，应答率达8%-25%;接种2.5mgIC41+多聚精氨酸,应答率达25%-42%;接种5mg1C41+多聚精氨酸，应答率约50%。检测CD8+T细胞增殖反应，接种0.5mgIC41+多聚精氨酸，应答率约8%;接种2.5mgIC41+多聚精氨酸，应答率约25%;接种5mgIC4】+多聚精氨酸，有超过40%的志愿者产生CD8+免疫应答。即接种剂凰越高,免疫应答越强c同样地，在健康志愿者中已安全诱导产生特异性的能分泌干扰素y(IHVy)的CD4*和CD8T细胞。KladeCS等采用双自法，随机抽取60名对经典治疗无效或治疗后复发的HLA-A2阳性的慢性丙肝

15、患者,分成5组，观察IC4I、单纯HCV肽疫苗、单纯多聚精氨酸免疫后的反应差别。结果发现1C41耐受性好，无药物依赖性。在IC41疫苗组中T细胞增殖达67%,相较于单纯用肽疫苗的17%的明显增高；lEN-y酶联免疫试验其应答率为42%。研究表明HCV肽疫苗IC41对慢性丙肝患者能诱导产生有效的特异性Ihl/Tcl应答。ChuaBY等m通过Cl)4+T辅助细胞表位(序列为KLIPNASUENCTKAEL)经一个赖氨酸残基插入结合CD8+T细胞表位(来自流感病毒A基质蛋白aa5866,Gni；FVFTL)合成一种脂肽。这种含二棕桐酰硫甘油半胱氨酸类脂的脂肽(它是树突状细胞表面Toll样受体2的配体

16、)，能诱导产生有效的CD8*T细胞应答.在健康人群与HCV感染者中均能活化DC并分泌IM2P70，活化CD8*T细胞产生IFN-yo这种脂肽疫苗可通过诱导抗HCVCD8*T细胞应答来清除慢性患者体内的病毒。2 HPV(Humanpapillomavirus)多肽疫苗的研究现况宫颈癌在妇女常见肿瘤中位列第二，约80%出现在发展中国家。每年约25万妇女死于宫颈癌，新增病例50万。近年来，HPV多肽疫苗无论在动物试羚还是临床试验中都取得令人鼓舞的进展。Daftarian等使用脂质体抗原呈递系统(Vacci-Max,VM)对一个肽疫苗进行临床前试验。该肽疫苗是将HPV16E7aa4957肽IUHYNI

17、VTF(R9F)(包含一个CTL表位)与通用辅助T细胞表位(PADRE)融合，结合佐剂CpG或脂质体。此肽被指定为假阳性(Falsepositive,FP),疫苗使用剂量为50网/单剂鼠。将50xI05个表达HPV的C3肿瘤细胞接种C57BI/6鼠.4、5、6、9、14天后给予皮下注射FP-CpG-VM疫苗。所有接种了该疫苗的鼠在试验终止时第130天均无肿瘤生K,经细胞毒性分析,酶联免疫斑点试验和INF-y检测均显示产生了针对选择性CTL表位的特异性免疫应答。同样的方法，接种6OX1O5个HPV肿痛细胞,4个月后测定细胞毒性，发现只有接受FP-CpG-VM疫苗的小鼠脾细胞具有溶解活性。这些结果

18、显示该疫苗对表达肿瘤的HPVE7蛋白能产生强而持久的特异性免疫应答。不仅在动物模型，将HPV肽疫苗应用于人体试验依然产生积极的效果。有证据表明抗L1抗体能有效识别宫颈损伤和正常宫颈。U用uiza等人发现位于L1表面暴露区的肽18283(55PNNNK1LVTKV-SGLQYRVFR74)和18294(284LYIKGSGSTANIASSNYFP1300)能与来自宫颈损伤病人血清中的抗体发生特异性的中和反应。使用这两个肽与165名正常妇女血清和148名有宫颈损伤或官颈癌患者的血清发生反应，经ELISA方法进行结果分析。不到3.6%的正常妇女血清能识别此两肽；相反.91%96%的官颈上皮内瘤变(C

19、ervicalintraepithelialneoplasia,CIN】CINIII)或宫颈癌患者血清能识别这两个肽。这些数据显示患者血清中的抗肽18283和18294抗体与HK-HPV存在密切相关，并且发现识别癌前期和宫颈癌的敏感性达92%97%,特异度达89%95%,且特异性免疫应答效果比病毒样颗粒更强例。由这两个肽所制备的抗体对于展开大规模的宫颈癌筛查可能具有重要意义。Sarkar等根据两性分子结构和相关T细胞表位从HPV16E6和E7蛋白中选择7个E6肽序列和8个E7肽序列，通过固相法合成肽，用这些肽去免疫患者，对免疫效果进行评价。研究对象共69人，分为4组：1组6人，为正常组,CIN

20、(-)/HPV(-);2组31人，C【N(+)/HPV(+)；3组和4组均为CIN(+)/HPV(+),在参与实验之前6个月进行了CIN消融或切除手术,3组22人,为未复发组Reeur(-),4组10人，组织学再发CIN,Recur(+)。结果显示使用单一肽，第1组无一例，第2组31人中5例产生单核细胞增殖反应，第3组的大多数病人对所有7个E6肽和7/8E7肽产生增殖应答.刺激指数(Stimulationindex,SI)N3.0,第4组10人中4例产生增殖应答；而使用合成肽，第3组64%的患者对E6合成肽产生增殖应答,82%的患者对E7合成肽产生增殖应答,86%对E6或E7合成肽中的至少一种

21、产生明显增殖反应，而第4组无1例对E6/E7产生增殖反应。这些结果显示引发的特异性细胞免疫应答对宫颈癌治疗后无复发患者具有重大意义c因此这些肽对CIN痊愈患者获得保护性免疫起到指示剂的作用，极具潜力设计成CIN相关的HPV预防性和治疗性免疫试剂C徐道华等基于表位设计疫苗(Epitope-basevaccinedesign,EBVD)的技术路线，以HPVE7抗原86-93表位为基础，合成了CTL、Th和脂类分子组合的模拟多肽抗原Pl(TLGrVCPI),同时合成了CTL、Th表位组合的模拟抗原肽P2(TLGIVCPI)科单纯CTL表位肽P3(TLGIVCPI)的两个对照多肽。以负载表位肽T2细胞

22、为靶细胞，P1、P2及P3肽均诱导出较强的CTL活性，其中乂以P1的效应最强，而以未负载表位肽的T2细胞为靶细胞，Pl、P2及的肽所诱导的CTL对其特异性溶破率均小于10%o此外,P1、P2及P3经体外诱导产生的CTL,均能杀伤Caski细胞。ELISA测量值显示,P1、P2及P3肽均诱导PBMC分泌IEN-y,其中又以P1的效应最强。以负载表位肽的JurkalA2.1/K1)为靶细胞，结果表明P1诱导出了较强的CTL活性，在E/T=100:1时，靶细胞特异性溶破率为65.0%；P2也诱导出rCTL活性，在E/T=100：1时，靶细胞特异性溶破率为35.5%；P3诱导的CTL对靶细胞基本无特异

23、性杀伤作用c但以未负载表位肽的Ju&atA2.1/Kb为靶细胞,P1、P2及P3肽所诱导的CTL对其特异性溶破率均小于10%。ELISA法测定多肽诱导小鼠脾细胞IFN-y的分泌，结果表明P1及P2肽均能诱导PBMC分泌IFN-y,其中乂以P1的效应更强；而P3并不能诱导PBMC分泌IFN-yo以上结果表明将CTL表位同Th表位及脂类分子构建的多肽可显著提高CTL表位肽的免疫原性，且P1诱导抗原特异性CTL效应显著高于P2和P3。4抗病毒多肽疫苗佐剂理想的多肽疫苗免疫原性强，能激活抗原发生特异性细胞免疫和体液免疫应答，有效杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒害作用。但是普通多肽抗原因其表位单一、

24、分子量小易降解等原因而致免疫原性弱，只能激发低水平的CTL反应，不能获得理想的抗肿瘤效果，通过使用佐剂可帮助解决免疫原性弱的缺陷。过去艾滋病疫苗评估组(AIDSVaccineEvaluationGroup,AVEG)对接种C4-V3HIV多表位肽疫苗加不完全弗氏佐剂的效果进行评估，结果由于在凡位受试者身上产生无法接受的局部注射不良反应，包括疼痛，无菌脓肿，流感样疾病而被迫终止'。Spear-manP等!在H1V肽疫苗CTLMEP/RC529-SE的安全性检测方面密切监测,发现局部反应轻度且短暂。接种部位轻度疼痛和压痛是最常见的不良反应，MEP/RC529-SE组为65%,MEP/RC5

25、29-SE+GM-CSF组为58%,控制组为6%。在MEP/RC529-SE纽中有1例产生抑郁,MEP/RC529-SE+GM-CSF组中疲劳/抑郁、头疼/抑郁、过敏反应各1例，但没有任何受试者因此终止试验，也没有发现GM-CSF在局部注射部位的严重不良反应。受试者对HCV肽疫苗IC41加佐剂多聚精氨酸具有极好的耐受性,考虑与免疫接种有关，局部症状是最常见的,2例发生淋巴结病,2例出现皮疹。在IC41组96个受试者中6%的人对多聚精氨酸呈现阳性反应，随免疫接种次数增多对多聚精氨酸的阳性应答会增加，但多聚精氨酸抗体存在是暂时的，没有出现变态反应，也无一例退出该试验。以诱导产生有效T细胞免疫应答抗

26、肿瘤为目的的HPV肽疫苗还未应用于临床，需要寻求新的最佳佐剂来增强肽疫苗的免疫效果。ToninsI等日：将神经节糖昔融入奈瑟均属脑膜炎外膜蛋白夏合物中，形成非常小的蛋白脂质体(Verysmallsizeproteolipo-sog,VSSP),即为一种新型佐剂。用HPV16E7派生的最小单位CTL肽(RAHYNIVTF)与VSSP联合免疫小鼠，可使肿瘤发生退变，生存期延长，诱导E7特异性CD8+T细胞应答。5结语虽然抗肿瘤多肽疫苗研究取得巨大进展，具有广泛的应用前景,但由于存在一些问题，如人工合成多肽疫苗免疫原性欠佳，受HLA表型限制，在一些临床研究中免疫应答和临床反应不一致，病毒的高突变率等

27、,限制了多肽疫苗的临床应用，还需要进一步的研究和完善，以便更好地应用于临床。6参考文献AdamKHvKaadcn0R.Slrohfnaieric.Isolationofimumunizingcyanogmbnxnkie-pqidesoffoot-and-muuthdiseasevirusLJ.BiochcmBiophyResCummun,I978;84(3):677-683.1 PiniA,Fai(*ianiC,BracciLHal.BranchedpeptidesasthcrapcuticsLJ.CurrPnxcinPqxSci,2008;9(5)：468-477.2 JohnstonMLF

28、auciAS.AnHIVvaocinc-fnxdving<wcepteJ.NEngiJMed.2007:356(20)：2073-208!.3 SuMiramanianRA(JiariniWAKurodaMjftal.ExpansionafterepitopepeptideexjKHureinvitropredictscytotoxicTlymphocytet-pitcjpedominancehierarchyinlymphocytesofvaccinatedtnamu-a*014-rhesusmonkeysJ.AIDSResHumRetroviruses.2006;22(5)：445-

29、452.4 HorenliniS.RiboldiFE.FacchctliFetal.HIV-1matrixproteinp!7induceshumanplasmacjloiddendriticcdlstoacquireamigratoryimmalun*ceH|J>cnotypcJ.ProcNalJAcadSriUSA,2008;105(10):3867-3872.5 EiorcntiniS.MariniE,BcraoLda/PreclinicalstudiesanimmunogenicityoftheHTVlpl7-l>asedsyntheticpeptideAT20-KLHJJ

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31、C娜功0化§89$：(OS)£乙：9(XU姬.>w,(fKKMuni3u!FdxA凸9|J(L<|(Adil)|nra«nqp.M)si|(p)>.«(m|i».>i|)rj.»dg.|mif.啊ld;xl;)叩ptAfeioqiounuMU/”uy.»ui?y,(),««au«»1®Z££62：皈-I乙)1«£00£啊4叫'门叩WFJ!U!PIII小珥1国仆吨垢侦丫Ndnotiur)ncnpA

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