新甲型H1N1流感和季节性流感临床快速诊断的研究.docx

1、新甲型H1N1流感和季节性流感临床快速诊断的研究程晓东。袁权。苏明权】，张荣，马越云，陈毅歆夏宁邵郝晓柯'(1.第四军医大学西京医院全军临床检验医学中心，西安710032；2.厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，福建厦门361005)摘要：目的考核北京万泰生物药业有限公司生产的甲型流感病毒抗原检测试剂(斑点ELISA)的临床应用效果。方法选用BD公司的DirectigenEZFluA+B流感检测试剂作为对照试剂，并以实时荧光RT-PCR结果为标准，进行比对试验。结果万泰试剂对于64份新甲型H1N1流感病毒的检测敏感度达92.2%,对季节性流感患者的检测敏感度为91.1%。

2、特异度为99.8%°作为对照，BD试剂检测新甲型流感病毒的敏感度为78.1%,明显低于万泰试剂(尸=0.016)。结论万泰斑点ELISA试剂对于新甲型H1N1流感和季节牲流感的检测灵敏度都超过90%,同时具有很好的特异度，显示了其在临床使用中的巨大潜力。关键词：新甲型H1N1流感；甲流抗原斑点检测试剂；逆转录聚合酶链反应中图分类号：R373.1+3;R446.62文献标志码：A文章编号：1671-7414(2010)03-061-04doi：10.3969/j.issn.1671-7414.2010.03.019SensitiveRapidAntigenTestfortheClini

3、calDiagnosisof2009PandemicA/H1N1andSeasonalInfluenzaACHENGXiao-dong1,YUANQuan2,SUMing-quan1,ZHANGRong1,MAYue-yun1,CHENYi-xin2,XIANing-shao29HAOXiao-ke1(1.CenterofClinicalMolecularBiology9XijingHospital9theFourthMilitaryMedicalUniversity9Xiyan710032tCAzna;2.NationalInstituteofDiagnosticsandVaccineDev

4、elopmentinInfectiousDisease9XiamenUniversity9FujianXiamen361005China)Abstract:ObjectiveToinvestigatetheclinicalapplicationofWantaiFlu-ADot-ELISA.MethodsAnevaluationofperformanceofanewlydevelopedRIDTtestcomparedwithBDDirectigenEZFluA+BandRT-Realtime-PCRwasconductedwithregardstotheclinicaldiagnosisofp

5、andemicA/H1N1andseasonalinfluenzaAinfection.ResultsFoundFlu-ADot-ELISAyieldedasensitivityof92.2%among64pandemicA/H1N1patientsand91.1%amongseasonalinfluenzaApatientswithaspecificityof997%Thecontrols,pandemicA/H1N1specimenstestedbyBDDirectigenEZFluA+Byieldedasensitivityof78.1%whichwassignificantlylowe

6、rthanFluADot(P=0.016).ConclusionWantaiFlu-ADot-ELISAyieldedasensitivityofover90%bothinpandemicA/H1N1patientsandseasonalinfluenzaApatientswithgoodspecificity.Theseencouragingresultshighlightitspotentialuseintheclinic.Keywords：2009PandemicA/H1N1；FluA-Ag,DotELISA»reverse-transcriptasepolymerasecha

7、inreaction目前，流感病毒诊断的金标准是病毒培养。其他检测技术包括应用逆转录聚合酶链反应(reverse-transcriptasepolymerasechainreaction,RT-PCR)进行的核酸检测等。与病毒培养相比,RT-PCR明显缩短了出报告的时间，并且具有更好2009年3月底4月初，一种新型的猪起源甲类流行性感冒病毒(2009PandemicA/H1N1)出现在墨西哥和美国。2009年4月30日凌晨，世界卫生组织把全球流感大流行警告级别提高到第5级。6月11日，WH()又宣布将甲型H1N1流感大流行警告级别提升为6级，全球进入流感大流行阶段。截至2009年12月20日，

8、超过208个国家报告了病例，并且已经造成了超过11516人死亡。该病毒的蔓延越发突显了拥有良好诊断信息的重要性。的敏感性。但是RT-PCR(包括实时荧光RT-PCR)费用昂贵，操作人员需要受过专业培训，而且进行批量的处理实验，费时费力。因此快速流感诊断实验以快速的出报告时间(1030min)和较低的运行成本已成为一个床旁诊断流感病毒的有利工具。前期的研究显示当前的快检试剂大多是基于免疫层析法原理，他们的敏感性大部分只能达到11%79%之问35】。这种情况很不理想并急需改善，因此我们在新甲型H1N1流感和季节性流感大流行期间，应用万泰斑点ELISA检测试剂与美国BD公司的流感病毒抗原快速筛查试剂

9、DirectigenEZFluA+B同时进行临床检测，并以实时荧光RT-PCR结果作为标准，比较该试剂的敏感度和特异度。.1材料和方法作者简介：程晓东(1972),男，硕士研究生，研究方向：分子微生物学»E-mail：xjyyjyk。通讯作者：都晓柯，E-mail：haoxkgo1.1实验材料1.1.120株A型流感病毒毒株（10株为2009年A型/H1N1新甲流株，5株H3N2季节性和5株H1N1季节性流感病毒株）和三种全长重组核蛋白rHlnp,rH3np和rSOIVnpC浓度均为2ng/ml）,以上样品均为厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心惠赠，用于试剂敏感度试验。

10、1. 1.2收集2009年9月24日26日，共807例西京医院发热门诊的发烧患者（38C以上）的鼻咽拭子标本。病人的年龄6个月86岁，其中男性患者436例，女性患者371例，大部分为在校学生。鼻咽拭子标本采集后，存储在15ml病毒保存液中，用于快速抗原检测和核酸检测。1.1.3两种快速检测试剂：实验试剂为北京万泰公司的FluA抗原斑点ELISA试剂，检测样品中的病毒核蛋白抗原（FluANP）,对照试剂为BD公司DirectigenEZFluA+B检测试剂，两种试剂检测均严格按操作执行。1.2实验，方法1-2.1病毒培养：以MDCK细胞培养甲型流感病毒，当75%100%细胞出现病变时进行收获上清

11、，以豚鼠红细胞进行凝集试验（HA）鉴定病毒生长情况，并进行甲流的血清学分型，置一80C保存。1.2.2病毒抗原检测：使用上述两种试剂，并严格按操作指南进行。1.2.3病毒RNA的提取：样本量200使用商品化核酸提取试剂（厦门百维信），在Biomek%IX全自动核酸提取仪（贝克曼库尔特）上执行。新甲型H1N1病毒核酸检测首先使用达安基因公司试剂进行RealtimeRT-PCR法，阳性标本被诊断为感染新甲型H1N1流感病毒。阴性标本加做CDC推荐的RealtimeRT-PCR以排除可能的遗漏和季节性流感的感染。1. 3统计学分析采用X2检验和Fisher精确检验进行统计分析。P值0.05,则说明二

12、者存在显著性差异。本研究获得西京医院伦理委员会的批准。2结果120株A型流感病毒毒株经MDCK细胞培养结果见图1。以豚鼠红细胞凝集试验（HA）鉴定其滴度均大于8HA单位/ml。2.2试剂灵敏度试验A（A,病毒培养前细胞;病毒培养后细胞）图1MDCK细胞病毒培养2. 2.1三种重组的NP蛋白经连续的倍比稀释从2ng/ml。.016ng/ml（稀释了2,倍），然后分别用两种试剂进行测定。万泰试剂的最低检测浓度都是0.063ng/ml,而BD试剂对于rHlnp,rH3np和rSOIVnp的最低检测浓度分别是1,2ng/ml及2ng/mlo2.2.220株经培养的甲型流行性感冒病毒株用20g/dl的P

13、BS稀释成0.1HA单位/ml,然后连续倍比稀释到0.00005HA单位/ml（稀释了2”倍）。这些稀释的样品同时进行二种试剂及CDC推荐的RT-realtime-PCR检测。最少能检出50%的所有病毒株的HA稀释度规定为分析检测下限。因此,三种方法的分析检测下限分别是CDCRT-reaktime-PCR：0.0001HA单位/ml,万泰试剂：0.0008HA单位/ml,BD试剂：0.0125HA单位/ml。由于万泰试剂比BD试剂灵敏度高16倍，因此选定其对临床标本做进一步检测。2.2.3在807名发热患者中，经RT-PCR检测出166例季节性流感，64例新甲型H1N1流感，其余577例患者没

14、有感染流感病毒。在新甲型H1N1流感患者、季节性流感患者和非流感患者当中，经万泰试剂检测为阳性的分别是59例，151例和2例（表1）。作为对照，用BD试剂检测这64份新甲流标本，其敏感度为78.1%（5O/64,95%CI：66.O87.5）,明显低于FluADot的结果（P=）.016）。3讨论流感的快速诊断是非常有用的，因为它能适当降低抗生素的使用情况，并能指导医生恰当的使用抗病毒药物，达到最终减少病人花费的目的。不过，当前大部分使用的流感快速测试都表现的不尽如人意。Vasoo等最近已报告三种全球范围内使用的快检试剂对于此次的新甲型H1N1流感的检出率分别是46.7%,38.3%和53.3

15、%。在Drexler等的研究显示Binaxnow流感A&B试剂对于144例PCR阳性鼻拭子及咽喉样本的敏感度只有U%。Welch等报告了在2009年春季第一波新甲型H1N1流感病毒发作期间，使用BD公司试剂测定了经LuminexxTAGRVP试剂和美国疾病控制及预防中心PCR检测鉴定的1599例患者,结果敏感度为77%。还有一些快检试剂对新甲型H1N1流感的检测敏感度与对季节性流感的检测敏感度相比明显下降（53.4%比74.2%,P<0.01）“J,这可能与核蛋白的抗原性差异有关，或者与流感病毒来自呼吸道不同部位的脱落细胞有关口°。总之，以前的流感快检试剂不适合于临床诊

16、断的需要口订。表1快速诊断试剂临床性能分析（万泰FluADot）项目新甲型H1N1季节性流感非流感合计RT-PCR64(8%)166(21%)577(71.2%)807(100%)轴（了七）12±3151151611315土7好(M/F)37/2784/M314/263434/373啪59(92.2%)151(91.1%)2(0.3%)212(26.3%)5(7.8%)15(8.9%)575(99.7%)595(73.7%)革勇度91.3%(CI：87.094.7)m99.8%(C【：99.0100)99.5%(CI；97.4100)96.6%(CI：94.997.9)用培养的病毒进

17、行分析灵敏度的测定可以间接反映检测临床患者感染相同流感病毒的临床敏感度。结果显示PCR高于万泰试剂检测限816倍，而万泰试剂高于BD试剂检测限16倍左右。这可能归因于较高亲和抗体的使用和方法学上的优势。在此项研究中的临床标本绝大多数来自学龄前儿童和学生（年龄：222岁，=628,77.8%）。新甲型H1N1流感患者与季节性流感患者在年龄和性别比率方面没有显著差异（P=0.110,P=0.310,分别见表1）。万泰试剂对于新甲型H1N1流感和季节性流感的检测敏感度超过90%,同时具有很好的特异度。高临床敏感度可能是由于两个方面的原因：本身是很好的测试试剂；使用了高质量临床标本。在本研究中，每个标

18、本都是用长柄棉拭子从患者后鼻咽处采集，而后鼻咽处的上皮细胞研究显示更容易产生B待检测抗原。但对于BD公司的试剂，对这64例新甲型H1N1患者中只检出了78.1%,敏感度与Welch等*的报告类似但高于其他用喉咙或鼻拭子的研究。总之，利用万泰生产的斑点ELISA试剂检测新甲型H1N和季节性流感病毒的敏感度达到90%以上。这种敏感快速流感诊断测试必然会在流感的诊断和治疗中发挥重要的作用。参考文献：1 CentersforDiseaseControlandPrevention.SwineinfluenzaA(H1N1)infectionintwochildren-SouthernCalifornia

19、March-April2009J.MorbMortalWkly2009,58(15)：400402.2 WorldHealthOrganization.Pandemic(HIND2009-upload80.Availableat:http：//csr/don/2009-12-23/en/index.html.Accessed.3 DrexlerJF»HelmerAtKirbergHwal.PoorclinicalsensitivityofrapidantigentestforinfluenzaApandemic(H1N1)2009virusCJJ-EmergIn

20、fectDiSy2009,15(10):1662-1664.4 CentersforDiseaseControlandPrevention.EvaluationofrapidinfluenzadiagnostictestsfordetectionofnovelinfluenzaA(HINDVirus-UnitedStates,2009JlMMWRMorbMortalWklyRe/>,2009,58(30):826-829.5 ChanKH,MaldeisN»PopeW>etal.EvaluationoftheDirectigenFluA+Btestforrapiddiag

21、nosisofinfluenzavirustypeAandBinfectionsLj.JClin况，2002,40(5)：16751680.6 CentersforDiseaseControlandPrevention.CDCprotocolofrealtimeRTPCRforinfluenzaA(H1N1).Availableat；http；//csr/resources/publications/swineflu/CDCReal-time-RT-PCR-SwmeHlAssay-2009-20090430,pdf.Accessed.7 VasooS,StevensJ,S

22、inghK.Rapidantigentestsfordiagnosisofpandemic(Swine)influenzaA/H1N1J.C&InfectDls,2009,49(7):1090-1093.8 WelchDFGinocchioCC.Point-Counterpoint：1'heroleofrapidimmunochromatographicantigentestinginthediagnosisofinfluenzaA2009H1N1fJj.JClinMicrobiol,2010,48(1)：22-25.9 KokJ,BlythCC.FooH9etal.Compa

23、risonofaRapidAntigenTestwithNucleicAcidTestingDuringCo-circulationofPandemicInfluenzaA/H1N12009andSeasonalInfluenzaA/H3N2EJ.JClinMi-c*。/,2010,48(1):290-291.10 FaixDJ»ShermanSS,WatermanSH,Rapid-testsensitivityfornovelswine-origininfluenzaA(H1N1)virusinhumansj.NEnglJMed,2009,10(1056):1-2.11 Cente

24、rsforDiseaseControlandPrevention.Performanceofrapidinfluenzadiagnostictestsduringtwoschooloutbreaksof2009pandemicinfluenzaA(H1N1)virusinfectionConnecticut,2009J.MMWRMorbMortalWklyRep,2009,58(37)：1029-1032.12 AgoritsasKMackKBonsual.EvaluationoftheQuidelQuickVuetestfordetectionofinfluenzaAandBvirusesi

25、nthepediatricemergencymedicinesettingbyuseofthreespecimencollectionmethodsJ.JClinMicrobiol,2006,44(7):2638-2641.收稿日期：2010-05-17修回日期：2010-05-19不同厂商真空采血管致BT-2000Plush生化分析仪“S”报警提示汪旭强，陶永东，贾小强（天水市第三人民医院检验科，甘肃天水741000）中图分类号*446文献标志码：B文章编号：1671-7414（2010）03-064-01doi：10.3969/j.issn.1671-7414.2010.03.020工作中

26、发现BT-2000Plush生化分析仪对真空采血管中血清无法探测的报警提示出现频繁，以“仪器故障”做检查维修，结果发现，引起报警提示非仪器故障，而是由于不同厂商生产的真空采血管所导致，现报道如下，供同行参考。1材料与方法1.1仪器意大利BT-2000Plush生化分析仪。1.2 真空采血管国内两厂商生产，笔者标注“A管”和“B管二方法将空白“A管”和空白“B管”分别放置于样品盘孔位中并人为进行转动，观察仪器“真空采血管感应器”指示灯的变化。肉眼观察比较空白“A管”和空白“B管，2结果2.1“真空采血管感应器”的变化空白“A管”随意放置和转动，“真空采血管感应器''指示灯均闪烁；

27、空白“B管”无标签一侧对着“真空采血管感应器”时，指示灯无闪烁，当有标签一面对着“真空采血管感应器”时，指示灯均闪烁。2.2肉眼观察比较空白“A管”通体无色透亮，外表面光滑，反光度强；空白“B管”管壁略带淡黄色，外表面光滑度及反光度均差于空白“A管”。3讨论BT-2000Plush生化分析仪的“样品盘模块”支持“真空采血管”和“样品杯”两种容器的检测模式，对两种容器的甄别，是依靠模块中的“真空采血管感应器”该装置的工作原理，是红外线发射一束红外光照射样品盘，临近的红外线感应器接受样品容器反射回的红外线，若接受的红外线，仪器判断该容器为“真空采血管”，相反，若未接受到红外线，仪器判断该容器为“样品杯根据这一判断结果，仪器在吸取样品时采取不同的运动方式：对“真空采管管”容器，吸样针可下降到管底，可控测到最少1ml的液体；