猪瘟疫苗研究进展及我国传统疫苗的研究现状.docx

1、猪瘟疫苗研究进展及我国传统疫苗的研究现状杜军I,舒常永2,张剑扬(1.河南南阳农业学校，河南南阳423003；2.河南省安阳县安丰乡农业服务中心，河南安阳455143；3.河南罗山县中等职业学校，河南罗山464200)中图分类号：S859.79+7文献标识码：A文章编号：1008-3111(2009)03-0016-04猪瘟是由猪由病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)|起的一种高度接触性传染病，也是世界粮农组织和各国政府密切关注的主要传染病之一，0IE国际委员会国际卫生法典(2002版)中，猪瘟被列为A类15种法定传染病之一。在我国也被列为一类传染病。最近该病在美

2、洲、亚洲、欧洲等国家和地区呈现散发的趋势，一些宣布已消灭猪瘟的国家如法国、荷兰、德国、比利时等又见猪瘟笈发的报道。近年来，我国因各种疾病死亡的生猪占饲养总数的8%10%,其中1/3由猪瘟致死，每年的经济损失高达数十亿元，造成了巨大的人力和资源浪费。针对我国畜牧业生产现状，采取疫苗防制仍是预防猪瘟的主要措施，因而研制开发安全、高效、稳定的猪瘟疫苗仍是当前兽医科研工作的重点。1传统疫苗自1903年DeSehweinitz和Dorset首次证明CSFV是一种滤过性病毒以来，人们采用各种免疫方法预防和控制猪痕。1908年匈牙利HutyraK-oves制成猪瘟高免血清后，人们一直用高免血清一血毒同时肌注

3、来免疫猪群。但由于高免血清昂贵，获取困难，加之血毒有散毒的危险，因此各国学者在以后的60年间相继研制出许多灭活疫苗。其中福尔马林和结晶紫灭活苗曾被广泛应用。灭活疫苗虽然安全，但保存期短。20世纪50年代，在佐剂和病毒培养技术发展的推动下，人们在研制出较为理想的灭活疫苗的同时，还研制出安全有效的猪瘟弱毒疫苗，并广泛应用于临床。猪瘟弱毒疫苗由猪瘟野毒株弱化获得，如中国C株、日本GPE株、法国Thivcrval株等都是广泛应用的CSFV疫苗株，-般均可提供终生免疫。中国培育的C株是国收稿日期：2009-12-18作者简介：杜军(1976-)，女，河南南汨人.学士，讲师。际上公认的安全有效的疫苗株，该

4、毒株免疫原性好、免疫谱广、安全性高、遗传性稳定。但也有研究认为C株可发生垂直感染。中国C株是中国兽医药品监察所周泰冲等研究者自1954年开始，相继用4株猪瘟病毒(hog-cholcravirus,HCV)分别诱发家兔感染，经过一系列的试验，终于选育出一株能够适应家兔的HCV,经兔体连续传代适应后发生变异，减弱对猪的致病力，却仍保持很强的免疫原性。用其制备的疫苗自1956年开始在全国推广应用，对控制我国猪瘟(HC)的流行起到了决定性作用，并在国外广泛应用。世界公认中国C株兔化弱毒的突出优点是，用其接种的猪不产生病毒血症和脑炎病变，可以安全地免疫接种任何怀孕期的母猪和吮乳仔猪，不影响受精率及存活率

5、，不引起流产、死胎，可安全地用于建立种猪群。传统疫苗具有免疫原性优良，免疫谱广、安全高效、遗传稳定性良好等优点。但是，由于弱毒疫苗干扰猪瘟血清学诊断，使人们难以区别猪瘟感染猪和免疫猪；弱毒活苗还有可能与野毒重组或进行自然突变而造成毒力返强，并可通过母猪胎盘感染造成胎猪死亡、弱仔、先天性感染仔猪，导致出现免疫耐受现象。欧盟已禁止使用猪瘟弱毒疫苗，而采用扑杀感染猪来控制和消灭猪瘟，采用扑杀政策需要大量的人力、物力和巨额资金投入，发展中国家是难以承受的，因此开发猪瘟的新型疫苗显得尤为迫切。近年来基因工程技术的迅速发展为猪瘟新型疫苗的研究和开发提供了新的工具。2新型疫苗2.1重组疫苗以无致病力或低毒力

6、的痘病毒（VAC）和伪狂犬病毒（PRV）为载体，将猪痕病毒E2基因与之重组研制出的基因重组疫苗，免疫动物后可对2种病毒产生良好的保护力。Rumenapf等将编码CSFV结构蛋白的E2基因插入痘病毒的TK基因中，获得了能表达该结构蛋白的重组痘苗病毒，将这种重组病毒免疫猪，可使猪抵抗强毒攻击。随后Matthias等发表了猪瘟E2基因重组痘病毒疫苗的相关研究，澳大利亚学者Hammond等相继发表了将E2基因重组到腺病毒后免疫猪的文章。Mulder等指出，伪狂犬病毒是另一个重要的活病毒载体，外源基因可稳定地插入其DNA。荷兰学者Peetes等报道了将猪痕E2基因重组到伪狂犬病毒中，免疫猪可以抵抗猪瘟和

7、伪狂犬病毒的攻击。我国四川农大郭万柱。教授研制的伪狂犬/猪瘟活载体重组疫苗也显示出了良好的应用前景。重组疫苗的安全性和实用价值目前还有争议，因为人类至今还不了解病毒自然发生变异的机制一方面，对于VAC/HCV重组体来讲，引起人们疑虑的是痘病毒会引起未种痘疫苗人群的感染，并使极少数感染者发病;另一方面，伪狂犬病是一种较为普遍的疾病，猪瘟一伪狂犬病毒重组疫苗对于已感染或已免疫的动物不能产生保护力。2.2亚单位疫苗亚单位疫苗因其良好的安全性和稳定性而备受研究者青睐。CSFV亚单位疫苗的研制是基于对CSFV保护性抗原的深入研究，其产品已被载人欧洲药典,CSFV编码的E2和E0蛋白是其主要保护性抗原，均

8、能独立诱导机体产生中和抗体，保护机体免受强毒攻击.荷兰学者Hulst等将E2基因与杆状病毒重组，并在昆虫细胞Sf21中成功表达，免疫20g表达的E2蛋白可以保护被免疫猪免受强毒的攻击。荷兰学者Bouma等确定将表达的32gE2蛋白为1头份疫苗，对猪的保护率可达95%,保护期达18个月,deSmit等研究了E2亚单位疫苗的保护期，发现E2亚单位疫苗一免后可提供613个月的保护力.他又进一步研究了E2亚单位疫苗一免和二免后对CSFV温和型毒株的保护情况，发现用E2亚单位疫苗标准滴度一次免疫就能显著减少温和型毒株从带毒妊娠母猪向胎儿的传播，二免后4周攻毒可阻止病毒胎盘传播。2.3标记疫苗目前国际上兴

9、起了所谓标记疫苗（Markervaccine）,该疫苗就是对猪瘟兔化弱毒进行改造，使其缺失某一段基因（如E0）或某一段特殊片段（如E2）,但其免疫原性不改变。以缺失的基因所表达的蛋白作为诊断抗原，能绽区别疫苗接种猪和自然感染猪产生的抗体。荷兰学者deSmit等将C株重组克隆出Fle2和Fle3重组疫苗株，Widjo-joatmodjo等报道利用猪瘟C株感染性拷贝在SK6e26细胞系上连续传代，制备了2株E0基因突变株Fle22及Fle23,荷兰学者vanGennip等报道制备了3株C株E2基因突变株Fle4、Fle47及Fle48.荷兰学者deSmit等又报道构建了2株C株E2基因突变株Fle

10、9和Fiello他们构建的很多突变株可以抗猪瘟强毒的感染.GRRisatti等研究了E2亚单位标记疫苗在实验条件下的免疫保护情况并发现，在E2亚单位标记疫苗中融入细胞因子有可能进一步提高疫苗免疫效果。标记疫苗的最大优点在于它带有可识别的标记，诱导的抗体能与野毒诱导的抗体相区别，便于及早发现感染动物，采取控制措施，可为在实施猪瘟“扑灭计划”时减少大量错杀导致的经济损失，同时也是扩大生猪及其制品出口，发展对外贸易的需要.2.4核酸疫苗DNA疫苗技术是近年发展起来的一种新的疫苗研制技术，它将连接有猪瘟病毒主要保护性抗原E2基因的表达载体直接免疫动物，使病毒核酸在动物机体内进行表达，从而刺激机体产生免

11、疫保护.解放军军需大学余兴龙等已用猪瘟DNA疫苗成功保护了猪对猪瘟强毒的攻击,他们构建了4种包含E2全基因序列的真核表达质粒，其中用pCDSW质粒（含有5'信号序列）给小鼠肌肉注射后可诱导小鼠抗CSFV的体液免疫。Hammmond等用表达CSFVE2基因的裸露质粒DNA免疫6周龄断奶仔猪和7日龄提前断奶乳猪，再将这2组猪群均用表达E2基因的腺病毒重组体（rPAV-gp55）加强免疫一次，用CSFV攻毒后，100%的仔猪和75%的乳猪获得保护。Andrew等也证明用编码CSFVE2基因的质粒免疫猪后可获得保护。MarkowskaDaniel等报道CSFVDNA疫苗免疫猪后能完全保护强毒攻

12、击，但攻毒后有2d体温高达40C以上，同时T、B淋巴细胞活性轻微增强.任何疫苗应用效果评价都应考虑其安全性问题,核酸疫苗同样如此。从目前研究情况来看，核酸疫苗在安全性上主要存在三个方面的问题即DNA抗体形成,外来抗原持续表达带来的副作用以及导致宿主细胞恶性转化的可能性。CSFV核酸疫苗刚刚起步，其免疫安全性是必须要考虑和解决的。3我国猪瘟疫苗生产工艺中存在的问题3.1传统猪瘟兔化弱毒疫苗的生产工艺发展历程我国在1956年开始推广猪瘟兔化弱毒疫苗，最初提倡就地制苗，就地使用。继而研制真空冷冻干燥疫苗成功，集中生产，统一供应。冻干苗便于保存，成为我国防制HC的有力工具。开始时采用家兔淋脾组织制苗，

13、每只家兔所制疫苗可供300头猪免疫。1964年将猪痕兔化弱推接种乳兔，研制成功乳兔苗，对猪仍保持较好的免疫原性和弱毒性。每只乳兔所制疫苗可供1500头猪使用，大大提高了产屋，降低了成本，自1965年起在全国推广使用。接着又用猪瘟兔化弱毒接种牛，病毒可在牛体内繁殖，淋脾毒价可达到乳兔水平，便于就地制苗或生产厂制造冻干苗。在偏僻山区用牛生产牛体反应苗深受欢迎。1974年黑龙江兽医研究所用原代猪肾细胞培养猪瘟兔化弱毒制苗，获得成功，但不能适应于规模化生产的需要。1975年开始由中国兽医药品监察所组织全国兽医药品生产厂进行病毒型疫苗转为细胞培养制苗的技术革新，将猪瘟兔化弱毒接种原代肾细胞进行工厂化制苗

14、。19781980年，有13家兽用生物药品厂生产猪肾细胞苗，并用细胞毒配制猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联冻干苗，在全国大量使用，1980年我国研制成功绵羊肾细胞苗，1982年研制成功奶山羊肾细胞苗,1985年生产出犊牛睾丸细胞苗，为HC疫苗生产开辟了一条新的道路。羊肾和犊牛睾丸细胞苗接种猪后3d可产生免疫力，5d可产生坚强的免疫力，免疫期均达到一年。王栋等发明了耐热冻干保护剂配方和制造耐热冻干活疫苗的技术，获得发明专利，使我国猪瘟耐热冻干苗达到国际水平。3.2传统疫苗的特点猪痕疫苗的质量涉及两方面的问题：一是猪瘟兔化弱毒的免疫原性，免疫原性是由最小免疫保护剂量和刺激机体产生的抗体水平决定的，兔化弱携

15、对兔感染的主要标志是发热反应，无临床症状及病理变化，即使传至935代，经鉴定免疫原性亦无改变；二是猪瘟疫苗的使用时的质量（毒价），涉及到制苗中的质量、出厂运输冷藏保管的质笊和注射疫苗操作技术的影响等3个方面的问题。3.3传统猪瘟疫苗生产中存在的问题3.3.1温度的影响猪瘟细胞毒生产中，病毒增殖过程中释放于营养液中的病毒粒子部分失活。猪瘟病毒在37C的半衰期为3h。在转瓶生产中，病毒粒子成熟后从细胞中释放到营养液里，会导致部分病毒粒子失活。因此降低病毒对温度的敏感性是提高疫苗质量的重要因素。3.3.2不产生细胞病交CSFV-般不使培养细胞产生病理变化（Cytopathicefect.CPE）,在

16、体外培养的细胞中，CSFV以低水平增殖.产牛的子代病窿滴度较低。这是当前生产中影响疫苗质最的关建问题。3.3.3毒价低在猪瘟细胞苗生产过程中，4收以后细胞明显老化，毒价降低；6收以后毒价难以达到配苗要求。3.3.4病毒粒子的失活抗原保存和疫苗冻干过程中病毒粒子的失活也是制约疫苗质量的因素之一。据报道，在某个猪瘟疫苗接种点观察，早上稀释效价为150个兔体反应量的合格疫苗，于室温条件下到晚上8时就只有15个兔体反应景，效价损失达90%（已失效）。3.4传统猪瘟疫苗应用过程中存在的问题国际上要求猪瘟疫苗应达到每头份400RID,才能剌激机体出现亚临床症状，产生保护性抗体。由于我国猪痕细胞苗生产工艺的

17、限制，毒价含量偏低，每头份含量仅为150RID。我国猪瘟细胞苗生产中用犊牛睾丸细胞培养收获细胞毒，效检用5万倍兔检通过为合格，而按国际标准应13万倍兔检通过，犊牛睾丸细胞培养难以达到这一标准。在兽医部门进行临床疫苗免疫测试时，用1头份疫苗免疫后，只要对攻毒能临床保护，即算通过，这一标准远低于国际标准，导致免疫剂量不足使免疫水平达不到保护性亚临床感染的水平，以至于出现隐蔽感染猪瘟。猪瘟传统细胞苗需一15C保存，目前养猪业的生产条件很难达到这一要求.4猪瘟疫苗研究展望4.1发展亚单位标记疫苗，建立鉴别试验如将传统c株病毒的某一基因用相应的牛病毒性腹泻病毒的基因代替，或者牛病毒性腹泻病毒的E2基因被

18、有毒力的猪瘟病毒E2基因代替，或者直接开发DNA疫苗进入宿主细胞后表达E2基因，或者将突变的E2基因删除。4.2病毒保护剂研究在细胞苗半成品生产中加入病毒保护剂，提高疫苗生产质最。其重点在于:解决收获液中病毒效价的降低，以及配苗前冷冻保存中病毒效价的降低问题;降低疫苗对温度的敏感性,延长冷冻保存时间和冻干保存期。4.3耐热冻干保护剂研究选择适宜的耐热冻干保护剂使生产的疫苗产品具有抗过敏、疫苗免疫原性高、可常温保存等特点。4.4免疫佐剂及稀释液研究开发出与传统猪瘟疫苗相配套的免疫佐剂和稀释液，提高其免疫效果。4.5新工艺在传统猪瘟细胞苗生产中研制、筛选和应用高通量、大规模生产的生物反应器，将替代

19、常规转瓶培养，为细胞苗的生产带来新的飞越。4.6产业化新型疫苗的研究和开发须向低成本、高产率、更安全的产业化方向努力。综上所述，疫苗对猪瘟的预防、控制及净化起到了不可替代的作用。就其发展方向而言，灭活疫苗已成为历史；弱毒疫苗虽仍在使用，但要消灭猪瘟，应禁止使用；亚单位疫苗安全，但还需改进生产工艺、降低成本，并有与之相配的鉴别诊断方法；活载体疫苗虽已取得成功，但到临床应用还有许多工作要作;标记疫苗优势明显，但投入应用前仍需证实其安全性、有效性；核酸疫苗刚刚起步，具有很大的开发潜力和应用前景，但在安全性和接种方法方面还需解决和改进。总之，无论是哪一种疫苗都不能作为控制并最终消灭猪瘟的唯一手段。参考

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