现有猪圆环病毒2型疫苗以及新型疫苗的研究进展.docx

1、doi:10.3969/j.issn.1006-4907.2013.03.001现有猪圆环病毒2型疫苗以及新型疫苗的研究进展屈泰龙，李润成.（湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128）摘要：猪圆环病毒病是近几年来对养猪业威胁较大的传染性疾病之一，时传染性疾病的防技主要是通过疫苗免疫来实现。本文对目前商品化以及实验性猪圆环病毒疫苗的研究概况进行了介绍，以期为现有PCV2商品我苗的临床选用提供参考，并为养猪人增强对PCV2新型疫苗的了解提供材料。关键词：猪圆环病毒2型；疫苗；进展中图分类号:S852.5;S858.28文献标识码:A文章编号：1006-4907(2013)03-0001-03基

2、金项目：2010-2013年长沙市校产学研合作产业化培育项目（¥）00046-173）作者简介：屈泰龙（1986",男，河南厨氏人，在读硕士，研究方向：动物病原分子学与免疫学，E-mail:qutalong。通讯作者：李润成。猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型（PCV2）引起的猪的一种免疫抑制性疾病，主要引起以患猪全身性淋巴结肿大为特征的多系统功能衰竭性疾病，临床上表现为体质下降、消瘦、贫血、淋巴结肿大坏死、黄疸、皮炎、腹泻和呼吸困难、繁殖障碍等叫自1991年加拿大首次发现该病后明逐渐在美洲，欧洲（德国）以及亚洲（韩国，中国）发现该病叫我国自2000年郎洪武首次发现该病后，研究

3、人员对猪群进行流行病学调查结果显示,PCV2抗体阳性率高达80%以上，被调查的猪场阳性率达100%,尚未发现有抗体阴性猪场存在叫给健康养猪带来了较大的压力。猪圆环病毒2型（PCV2）有11个ORF,其编码的蛋白由2ku-36ku不等，其中研究的较为深入的为ORF1.ORF2和ORF3,分别编码病毒复制相关蛋白Rep和Rep'、病毒结构蛋白Cap以及病毒感染细胞凋亡相关的蛋白。Cap为PCV2的主要结构蛋白，可诱导动物体产生免疫反应，是PCV2的主要免疫保护性抗原，是研制亚单位疫苗的目标抗原以句。预防猪圆环病毒并的关键性技术为疫苗免疫。国内外学者就圆环病毒疫苗的研究进行了诸多探索，目前已

4、经商品化的疫苗有灭活苗、亚单位疫苗以及PCV1-PCV2嵌合型疫苗,这些疫苗对于猪圆环病毒的防控起到了关键性的作用。近年来随着分子生物技术手段的发展，对圆环病毒疫苗的研究又进入了一个新的阶段，比如：核酸疫苗、载体疫苗、表位疫苗以及合成肽疫苗等，本文就近年来猪圆环病毒疫苗研究进展作一阐述，以期为疫苗使用和新型疫苗的开发提供-定参考。1传统疫苗1.1灭活疫苗灭活苗是指将接种有PCV2的细胞培养物经过理化手段处理，使其丧失感染性但保留免疫原性，添加佐剂经乳化后制备而成。该类疫苗无毒,易于保存，性能稳定。灭活疫苗能够有效的预防圆环病毒病的发生,国外学者较早投入到PCV2灭活疫苗的研究中。法国Meria

5、l公司早在2004年就已经开发出了PCV2全病毒灭活疫苗-Circovaco母猪以及3周龄以上的仔猪均可使用该疫苗。法国的田间试验显示，妊娠母猪免疫后,仔猪通过吮吸初乳获得母源抗体，可以降低仔猪病毒血症以及淋巴结损伤在德国的233个猪场的哺乳猪，断奶仔猪以及育肥猪进行的免疫实验中发现，免疫Circovac的猪群比没免疫猪群的死亡率分别下降了2.9%.4.8%和2.6%可见该疫苗能够获得较稳定的免疫力，可有效的保护猪群免受PCV2的损害。美国富道公司2006年推出了PCV1-PCV2嵌合型灭活疫苗-SuvaxvnoJ.Segal£s使用该疫苗进行免疫实验发现:三个猪场中，猪场1和3免疫

6、组比非免疫组平均抗体水平高12%,平均H增重分别高出28g/d和16g/d,猪场2和3免疫组比非免疫组攻毒后血液中病毒含量低（p<0.05）"%在国内，哈尔滨兽医研究所研究员刘长明研制的PCV2灭活疫苗（LG株）为首个上市产品，该疫苗具有安全性好、抗原含量高、抗母源抗体干扰等特点南京农业大学的姜平教授研制的PCV2灭活苗（SH株）,该毒株免疫原性稳定，能够引起机体产生较强的免疫力，阻碍圆环病毒的入侵和繁殖皿。此两种疫苗的研制填补了我国圆环病毒疫苗的空缺，同时也引导了国内圆环病毒疫苗的研发。随后国内的一些疫苗企业分别推出了自己的产品，这地疫苗都在某种程度上为圆环病毒的控制起到了积

7、极作用。1.2减毒活疫苗制备减毒活疫苗有两种方法可循：传统的方法为将病原接种在非易感动物或者细胞，通过连续的传代培养以降低其毒力，另外一种较为新的方法就是通过基因工程手段将强毒力基因进行缺失或者重组，从而得到减毒的病原体。国内外对圆环病毒的弱族苗研究尚不很多oKenaux等网将PCV2接种于PK15细胞并进行连续传至120代，发现120代的病毒编码Cap蛋白的基因有两个位点发生了突变，导致120代体外增殖能力增强但是毒力却降低。应用此代细胞毒进行免疫学实验，120代病毒感染的仔猪病毒血症发生率低于第一代病毒感染的仔猪.表明此毒株诃作为弱毒候选疫苗、类似于FD公司的嵌合型疫苗Tenaux和Bea

8、ch分别构建了嵌合型PCV1-2W4和PCV1-2"。这两种疫苗遗传稳定性好，免疫后可诱导产生广泛的保护性免疫，对实验动物进行攻毒实验并对血液中病毒含址进行测定，发现免疫组的病毒载y：明显比非免疫组低。虽然弱毒疫苗可对动物产生保护，但是目前为止也仅限于实验研究，要商品化还'需解决毒力返强等问题，因此仍需进一步的探索研究。2基因工程疫苗2.1亚单位疫苗PCV2的ORF2编码的Cap蛋白是圆环病毒的结'构蛋白，是圆环病毒的主要抗原区域，具有免疫保护性。目前已经商业化的亚单位疫苗为BoehringerIngelheim,Intervet（Merck"Scherin

9、g-Plough（Merck）的PCV2a-Cap疫苗。这两种疫苗均为将ORF2片段插入到杆状病毒基因组中，然后将病毒转染昆虫细胞并进行培养，收获培养物进行纯化加入佐剂制备成疫苗。Fort等叫应用Intervet的疫苗-Porcilis,尽管免疫组与非免疫组在外观症状，增重等方面没有显著差异，但是攻毒后非免疫组于第7天开始出现病毒血症（病毒载量：100%）,实验结束时其比例达到55.6%,而免疫组至实验结束则只有7%（病毒载虽:80.8%）oFachinger等1,71使用BoehringerIngelheim的CircoF'LEX进行免疫实验，可以显著的降低组织病变以及病毒的排泄。通

10、过杆状病毒表达的蛋白自发的形成了病毒粒子，这种病毒粒子不含有PCV2的致病基因，但是保留了PCV2的抗原性，可以引起机体产生较强的免疫反应。但是真核表达得到的病毒粒子疫苗，价格昂贵，这无疑增加了养殖成本。相较于真核表达系统，大肠杆菌表达系统可以大量的表达目的蛋白。浙江大学周继勇教授网将PCV2的去核定位信号衣壳蛋白（dCap）和谷胱甘肽-s-转移酶（GST）融合表达得到GST-dCap蛋白，此蛋白可被多克隆血清特异性识别。湖南农业大学余兴龙教授将PCV2衣壳蛋白基因3'端396片段碱旌与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）进行融合表达，免疫保护实验结果显示对照组小鼠100%感染,而免

11、疫组仅有12.5%感染叫Cap蛋白用原核表达方式，不但具有其核表达方式所得蛋白的免疫保护性，同时表达量较大，而且目前国内还没有商品化的PCV2亚单位疫苗，因此圆环病毒亚单位疫苗的商品化将会是一个突破性进展。2.2载体疫苗将PCV2编码Cap蛋白的ORF2基因片段运用分子生物学手段整合于致弱的病毒或者菌株中.以此微生物作为疫苗免疫动物,则可使动物获得针对PCV2的抗体。华中农业大学教授陈焕春问将PCV2的ORF1和部分ORF2融合进PKVTK、/gE-/UcZ将重组病毒进行动物实验：在Babl/c小鼠和猪体内，能够产生显著的免疫反应，可分别产生PHV的中和抗体以及PCV2特异性淋巴细胞增殖反应。

12、华南农业大学教授罗满林四将PCV2-ORF2与猪）-1FN连接至腺病毒得到：rAd-ORF2-lFN-）。重组病毒可使小鼠获得PCV2-ORF2特异性抗体，且在二免后28天可获得抗体峰值。Kim等口将ORF2连接进博代氏杆萌aroA突变株（BBS）,将BBS-MCP通过滴鼻形式进行免疫ICR小鼠，抗体测定结果显示免疫组与非免疫组抗体水平差异显著（P0.05orO.ODo攻毒后检测肠系膜淋巴结病毒含量，免疫组和非免疫组分别为：12.6±4.5和23.6±5.6。载体形式的疫苗还有蓝耳病毒、杆状病毒、乳酸菌、酵母菌凶冽等,尤其是乳酸菌和酵母菌，可以通过口服的方式进行免疫，激活了

13、粘膜免疫系统，这无疑使圆环病毒疫苗的研究上升了新的台阶。2.3核酸疫苗PCV2有两种实验性基因疫苗：一种为将PCV2的基因组直接注射动物机体，第二种为将编码PCV2Cap蛋白的ORE2连接至真核表达载体中构建出质粒作为免疫原。Fenaux等四将PCV2基因纽直接注射进小鼠和猪的淋巴结和肌肉，可产生和感染性病毒一样的结果。Blanchard等凶将构建的PORF2质粒免疫猪可获得保护性免疫反应，Kamstrup和申会刚四用构建的PORF2的质粒免疫小鼠，可刺激小鼠产生PCV2特异性中和抗体。然而申会刚等网将ORF1或者ORF3同PORF2同免疫时，则干扰了其保护性抗体的产生。Aravindaram

14、等运用基因枪注射PORF2/PORF3或者PORF1/PORF2/PORF3却得到了比较好免疫效果。产生两种截然不同的结果可能是由于基因疫苗在常规免疫方式下不稳定，因此导致重复性不好。基因枪免疫方式可使基因疫苗产生最大免疫效果,然而这种免疫方式仅限于实验研究，应用到实践中尚存在一定的困难。2.4表位疫苗通过噬菌体展示技术将Cap蛋白进行区域性划分，然后分析其免疫原性。将免疫原性好的区域运用生物合成技术得到多肽，辅以佐剂制备成疫苗是新型疫苗的趋势。四川农业大学郭万柱教授以PCV2SC株为模板，扩增ORF2的三个抗原表位基因A、B、C,并分别与细小病毒VP2基因串联插入到真核表达载体pCI,将构建

15、的质粒转染MDBK细胞并免疫小鼠，结果显示三个质粒都具有较强的抗原性,其中以B区域表位最强。商绍彬等30验证Cap蛋白231-233位氨基酸为其构象表位的主要中和抗体产生位点。本文作者将Cap蛋白划分为4个不同区域，并将每区域进行2次串联表达,通过鼠免疫实验发现，其中区域2可产生最强免疫,而区域4则引起较低的抗体。由此可见，表位疫苗可清晰的认识到主要抗原区域的存在，避免其他区域对于抗原性的影响。然而，由于不同毒株之间Cap蛋白所编码的氨基酸存在一定的差别,其免疫效果也就存在差异。因此，将不同毒株的主要抗原表位进行串联表达将是PCV2表位疫苗研究的重点。3总结与展望现在临床上广泛使用的商品疫苗有

16、基于Cap蛋白的基因工程亚单位疫苗及灭活疫苗，处于实验研究阶段的PCV2疫苗有表位疫苗、核酸疫苗及新型载体疫苗。根据实验室及临床实践结果表明，现行商品化以及实验性疫苗虽不能完全阻止圆环病毒的感染和传播，但是都在某种程度上能够降低病毒血症,病毒载量以及病毒的排泄。圆环病毒病主要引起机体的免疫器官功能下降，导致机体的免疫力下调，且当猪群中有其他病原体存在，PCV2的感染可促进这些病原对机体造成更大的损害，再由于圆环病毒在猪群感染的普遍性,免疫猪圆环病毒疫苗对最大程度的降低猪群内的圆环病毒的存在鼠,提高猪群的健康水平，增加养殖效益，具有非常重要的作用。另外，由于近几年流行的毒株以PCV2h较多，因此

17、加速PCV2b疫苗的研究可能将是以后疫苗研究的重点。参考文献：1 AlanGM,EllisJA.Porcinecircovirus:areview(J|.JVetDiagnInvest.2000,12(1)：314.2 ClarkEG.Post-weaningmuhisystemicwastingsyndrome(C.27thAnnu.Meet,1997.3 Grau-RomaL,FraileLScgal6sJ.Recentadvancesintheepidemiology,diagnosisandcontrolofdiseasescausedbyporcinecircovirustype2(

18、J.TheVeterinaryJournal.2011,187(1):23-32.|4|刘长明.猪圆环病毒病的流行趋势与防控JI兽药市场指南.2011(11):36.|5JCheungAK.Porcinecircovirus:transcriptionandDNAreplication/.Virusresearch.2012,164(1):46-53.6 FinslerbuschT,MankertzA.PorcinecircovirusessmallbutpowerfulJ.Virusresearch.2009,143(2):177183.7 JacobsenB,KruegerI-SeeligerF,elal.Retrospectivestudyontheoccurrenceofporcinecircovirus2infectionandassociatedentitiesinNorthernGermanyJ|.Ve