狂犬病口服疫苗研究进展.docx

1、狂犬届口服匠苗GR秃迅展刘妈.王学林，郭恒，孙树民(吉林大学人喜共患病研究所.吉林长春130062)狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)感染引起的-种人答共患急性传染病。狂犬病在世界范围内广泛流行。调杳表明，我国农村地区犬只免疫率仅为10%20%,猫则几乎没有进行过免疫，形成不了免疫屏障。而旦，我国狂犬病病例多未进行暴露后处置或处置不规范。面对这种极为严峻的形势，唯一简便有效的方法就是研制口服疫苗建立免疫群，最终达到消除狂犬病的目的。一、口服狂犬病毒疫苗毒株随若对残犬病举疫苗技术研究的深入，有许多种病毒被用来研究门服疫苗。ERA株活疫苗能有效刺激狗和浣族产生中和

2、抗体，具有很好的保护性，但对鼠等咽齿动物、猫、臭鼬具有致病性。SAD-Bem株疫苗对红狐有很好的保护作用，但对咽齿动物和狒狒具有一定的致病性。SAD-BI9株在实验室研究中，对狐狸和浣熊做口服试照结果发现，血清阳转率很高，但SAD-BI9株疫苗对鼠有一定的致病性。SAD-P5/88疫苗主要对部分咽齿动物是致命的。源于SAD-Bem株的双突变株SAGI株，均是无毒的，无论【I服、肌注、脑注和免疫削量如何，对成年小鼠和狐狸均无致病性，但对仓鼠是致病的。CTN-1株制备的口服狂犬病疫苗给家犬一次性口服，可获得长达15个月的免疫力°1989年又将该毒株适应Ver。细胞，制备的口服疫苗口服免疫

3、家鼠，抗体阳转率达80%以上。1996年郑海发等乂采用CTN-1株经Vero细胞传15代,制备狂犬口服疫苗，口服乳犬，结果表明该疫苗病逐对乳犬口服无致病性，而11疫苗抗体阳转率很高。二、减毒活疫苗与灭活疫苗相比较，减毒活疫苗可以诱导强的细胞毒性T细胞(CTE)介导的免疫反应，而灭活疫苗不能诱导T细胞免疫。反向遗传操作系统方法是新近发明的方法，应用该方法通过修改狂犬病病毒糖蛋白与毒力相关的位点和蛋白的膜外区，"以重组出更安全、更有效的减毒活疫苗。狂犬病毒的反向遗传学操作系统，迄今为止已经程到弋速发展。艾军等应用反向遗传操作技术拯救出重组病毒HEP-Flury(NIG2),获得了适应BH

4、K-21细胞的病毒克隆株，改组病毒的致病性已明显降低、在BHK-21细胞中的病毒滴度逐渐升高。12等用RV强毒株，证明G基因是RV毒力决定基因，并通过实验进一步证实糖蛋白333位氨基酸是毒力决定位点。郭宵峰等于2006年运用基因突变、反向遗传技术的原理与方法成功地拯救已发生基因面排的狂犬病毒。郭利等于2009年采用负链RNA病毒反向遗传学方法构建减毒株ERAG6,减弱了其潜在的毒力归的危险，为研制更加安全有效的狂犬病减毒活疫苗打下坚实的技术基础。Dietzschold把编码细胞凋亡蛋由基因插入到狂犬病病毒中，通过该蛋白刺激免疫或干预病毒的致病性来增强疫苗的效力和安全性。三、转基因植物口服疫苗表

5、达狂犬病病毒抗原蛋白的植物可能成为人或动物疫苗的廉价来源，特别对于发展中国家，这种疫苗更有推广价值。目前报道有两种方法能够在植物中表达狂犬病病毒抗原基因。第一种方法是直接种植表达狂犬病病毒抗原蛋白的转基因植物。McGarvey等于1995年通过这种方法率先在西红柿中的叶片和果实中表达糖蛋白，但其相对较低的抗原蛋白表达最可能不足以避免动物受到病毒的攻击。第二种方法是构建重组植物病毒，然后用重组的植物病毒感染植物，用分离的病毒粒子免疫动物或直接用病毒感染的植物叶片饲喂动物就可起到免疫效果。Yusibov等于1997年成功构建了带有糖蛋白B细胞表位和核蛋白T细胞抗原表位的重组AIMV病毒。通过纯化的

6、病毒粒子腹腔免疫小鼠，小鼠能产生中和抗体。Yusibov等又于2002年用重组病逐感染的液菜叶给受试者食用，结果表明植物病毒表达系统具有用作狂犬病口服加强免疫的潜力。但是，狂犬病病毒糖蛋白目前在可食性植物中的表达水平还相当低，然而，表达水平方面的技术难题一旦攻破，将为生产安全廉价有效的新型狂犬病口服疫苗提供空前繁荣的前景。四、重组活载体疫苗人们希望发展-种既保留狂犬病病毒完整的免疫原性而又不含狂犬病致病的疫苗，目前研究得最多的是重组活载体疫苗。故是当前认为最有开发和应用前景的动物疫苗。该活载体疫苗克服了常规疫苗的缺点，兼有死疫苗和活疫苗的优点,在免疫效力上有很强的优势。（一）杆状病毒载体有资料

7、报道，具有免疫反应性和保护性的狂犬病病毒糖蛋白和核蛋白，已在杆状病毒-昆虫细胞系统获得成功表达，并可大量生产，易于纯化精制。杆状病毒表达系统是比较理想的真核表达系统。狂犬病病毒G基因在异源宿主系统杆状病毒中的高效表达，为大规模地制备亚单位疫苗提供了另一条可能的途径。1990年Prehaud等将CVS株G基因插入苜蓿Y纹夜蛾核型多角体病毒转移我体上，与ACNPVDNA共转染Sf9,结果发现狂犬病病毒糖蛋门表达产量高，而且有免疫原性。FuZF把ERA株G基因和N基因分别重组到杆状病毒中，分别用纯化表达的G蛋白和N蛋白免疫浣熊和小鼠，均能诱生抗狂犬病病毒的中和抗体和抵抗街毒致死削量的攻击，从而显示了

8、此种疫苗的口服使用前换。（二）痘病毒载体用痘苗病毒做载体具有许多优点，比如：病毒栽体本身无毒性，对目标动物和非目标动物都是安全的；制备的疫苗具有很好的保护性,可以通过消化道免疫动物以及具有热稳定性，在野外可以存活一个月以上，其最先被用于狂犬病口服疫苗的构建中。重组活裁体疫苗中以痕苗病毒为载体V2RG研究的最为清楚、应用得也最广泛。2（X）1年Blaso用表达G蛋白的重组痘苗病毒疫苗免疫雌狐，表明用跋组痘苗病雀载体有可能适合于幼狐的免疫。在痘病毒中插入狂犬病病毒ERA株的慵蛋白基因，研制出安全有效的vCP16重组病旄疫苗，重组CPV狂犬病病毒疫苗保护小鼠、猫和狗抵抗致死性狂犬病病毒攻击所需的接种

9、剂最很低。用重组CPV狂犬病病谁疫苗，替代目前已有的狂犬病病毒疫苗能取得很好的效果。（三）腺病毒载体腺病毒基因重组活载体疫苗已成为当前开发研制经济、安全、有效，旦使用方便的新型疫苗中十分活跃的领域。目前，基干犬2型腺病毒、猴踪病毒、腺相关病毒等的狂犬口服疫苗的研究也都在进行中，有的已进入临床试凝阶段，对载体病很的减毒及狂犬保护性抗原基因的修饰是研究的热点问题。1990年加拿大Prevec等用基因重组技术将狂犬病病毒ERA株糖蛋白基因表达狂犬病病毒糖蛋白的AdRGl。体内外试骋均证实AdRGl均可诱生高水平的中和抗体，保护动物抵抗致死剂量狂犬病病毒的攻击。1992年Charlton等以重组腺病毒

10、疫苗给臭鼬和红狐狸口服免疫，证明安全有效可抵抗病毒的攻击。ZhouD等构建了表达狂犬病病毒精蛋白的黑猩猩腺病毒，该病毒可以作为服疫苗，保护机体免受狂犬病病也的感染。2005年张守峰等构建出狂犬病病毒情蛋白的重组犬2型腺病毒，在细胞当中包装出毒，通过采用各种接种途径都伏得了令人满意的效果。（四）细菌载体除了病毒作为载体的疫苗外，还可以利用细菌作为运栽体。对沙口氏菌为疫苗运载体的口服疫苗的免疫学基础了解得比较全面，有很多资料显示以鼠伤寒沙门氏菌为运载体构建的其它疫苗都有报道，故有学者将沙门氏菌和狂犬病病毒疫苗紧密的结合在一起,目前这种新型的粘膜免疫的口服疫苗正在研究之中。其大致可能机理如下：将狂犬

11、病病毒G和N具有抗原性蛋白的外源基因，克隆到表达质粒中，然后将该重组成粒电转入减毒沙门氏菌。用此重组减毒沙门氏菌对动物和人进行粘膜免疫（口服或鼻腔免疫）。这种方法制备的口服疫苗廉价、接种方式简便，毋需专门医护人员，适用于大群体免疫，1L可避免因注射接种而感染血源传播的疾病。此外，以减毒沙门氏菌为我体的疫苗抗原不需要提纯、制备简单、易于储存和运输，可显著降低疫苗的制作成本。鉴于这些优点，减毒取伤寒沙门氏常可成为狂犬疫苗的优良载体，用于某些细萌、病毒、寄生虫、肿瘤性疾病的预防或治疗性疫苗。五、DNA疫苗在一些动物实验模型中，DNA疫苗预防狂犬病有较好的效果。目前，传统DNA疫苗存在的抗体应答弱的缺

12、陷徘到很大改善，通过使用佐剂、对DNA质粒的改造及免疫利量和次数的优化，ManprcctKaur等构建了一种有效的狂犬DNA疫莅，动物保护率为100%,中和抗体滴度为4IU/ml。但是这种传统的DNA疫苗接种，需要极高剂量的质粒，在人体内免疫原性很弱，使人们不得不考虑寻找有效的DNA疫苗的运我系统。近年来，DNA疫苗的运裁系统IIII毒混感多肽注射液的体外抑菌试验及人工攻毒试验研究向世忠商树林？，张国红3,刘利春4.郭世勤杜国清5（1四川省宣:汉县畜牧兽医协会.四川宣汉636150:2.四川省宙波县亩牧兽医局.四川荷波616550：3.四川西科晴尖兽药饲料生物工程研究中心.四川绵阳621023

13、；4四川西吕学院动物科学系.四川西昌615000；5.四川精尖动物疫病研究中心.四川缉阳621023）组别大廊杆伤螺沙门氏歼血毒混感多肽注射液211718琥酸庆大尊素注射液171611盐酸林可卷素注射液111210表1体外抑菌试验结果（单位：mm）猪大肠杆闻病、伤寒沙门氏杆萌病、痢疾杆菌病是养猪生产中比较常见11较多发的细菌性疾病病，危害较大。目前，在临床中，由于抗生素的非合理使用，使得病原萌对一些抗生素产生较强的耐药性。课题组采用脂质体技术研制了由多雨组分制备的复方制剂一血茬混感多肽注射液，为临床用药增加了轮换、选择的机会，可在一定程度上改善临床因长期不规范、不合理使用抗生素而产生耐药性的现

14、象。现将该药的体外抑慎情况和人工攻毒防治试验结果报告如下。一、材料（一）供试药物血毒混感多肽注射液的主耍成分为磺胺间甲氧喧璇钠、硫酸庆大零素、林可密素等，各成分按一定比例，采用脂质体技术和工艺制备的油相脂成体注射液，10ml/支，批号：20090709,由四川西科精尖兽药饲料生物工程研究中心试制。硫酸安普霉素、硫酸庆大毒素、盐酸林可毒素均购F绵阳天诚药业有限公司，经检测属合格产品。（二）菌种猪大肠杆菌、伤寒沙门氏杆菌、询疾杆菌，由四川精尖动物疫病研究中心从临床自然病例中分离。（三）药敏片硫酸庆大毒素-盐酸林可族素、硫酸庆大容素、盐酸林可霉素纸片，由四川精尖动物疫病研究中心提供。二、试验方法（一

15、）菌液的制备将三种菌分别接种于适宜的培养基上，于37C培养使其活化。然后接种在营养肉汤中，置37C温箱培养，取出后用肉汤稀释到10KT，备用。（二）体外抑菌试验采用药敏纸片法。（三）人工攻毒防治试验双月龄断奶健康仔猪390头，分别进行猪大肠杆函、伤寒沙门氏杆菌、痢疾杆菌的攻毒防治试验。将390头仔猪随机分成13组，每组30头，设攻毒对照组、血毒混感多肽治疗组、硫酸庆大容素组、盐酸林可霉素组、健康对照组（共同对照）。健康对照组不攻毒不给药，攻毒对照组只攻茬不给药，血毒混感多肽预防组从攻毒前8h开始给药（按0.2ml/kg给药），硫酸庆大每索组按0.2ml/也有了更深入的研究，这为狂犬口服DNA疫苗的发展提供了广阔的空间。利用沙门氏菌为DNA疫苗运载体的研究已有成功范例。沙门氏御作为活疫苗载体技术发展迅猛，以往激发免疫应答偏弱的缺陷得以改善。当前沙门氏保i致弱手段非常成熟，而沙门氏菌进入体内后被巨噬细胞吞噬进而在吞噬体内溶解以及外源