甘肃省健康猪群猪链球菌分离株的耐药性检测.docx

1、文章编号1001-3601（2011）02-0108-0128-03甘肃省健康猪群猪链球菌分离株的耐药性检测邢娟微，李学瑞之，柳纪省,胡永浩I（】.It肃农业大学动物医学院.甘甫兰州730070,2.中国农业科学院兰州料医研究所，甘甫兰州730046）摘要为了解甘肃地区表观健康猪群携带猪群猪链球菌的情况，从甘肃省武威、兰州、庆阳等地采集到152份健康猪扁桃体分离猪链球蔺，结果共分离到67株.分离率约44%,67株猪链球菌的射药性检测表明，全部猪链球茵分离株具有多重耐药性.其中1株对22种抗生素中的16种产生耐药性。用我国致病性链球茵2型特有的89k毒力岛序列特异性引物对67株猪链球菌进行PCR

2、签定，其中1株能够扩增出该特异性片段，表明在该地区健康猪群中存在致病性2型猪链球苗。关键词猪链球菌；药敏试验；毒力岛中图分类号S852.6P1文献标识码ADrugToleranceof67StreptococcussuisStrainsIsolatedfromHealthyPigsinGansuProvinceXINGJuan12,LIXue-rui2,LIUJi-xing2HUYong-hao1(.1.CollegeofAnimalMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou.Gansu730070；2.LanzhouVeterinaryResea

3、rchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,iMnzhouGansu730046.China)Abstract：Thedrugtoleranceof67S.suisstrainsisolatedfromtonsilof152healthypigswasdetectedtoknowthestatusofapparenthealthypigscarryingS.suisinGansuprovince.TheresultsshowedthatallisolatedS.suisstrainswereofmulti-drugtoleranceand

4、anisolatedstrainwasofdrugtoleranceto16antibioticsof22antibiotics.Thespecific89kpathogenicityislandsequencespecificityprimerofChinesepathogenicityIJS.suiscouldbeamplifiedfromanisolatedstrain,whichindicatesthatthereispathogenicityIIS.suisinGansuprovince.Keywords:S.suisidrugsensitivetest；pathogenicityi

5、sland猪链球菌病（Streptococosis）是一种分布范围极广的由猪链球Streptococcussuis（.S.5uis）感染所引起的一类猪疾病的总称。猪链球菌（S.SMis）是革兰氏阳性兼性厌轲的球菌，目前已知有35个血清型（但也有研究认为链球菌32型和34型属于Streptococcus,Orisratti）其中2型致病力最强、分布最广泛。该南可引起猪脑膜炎、肺炎等病症，严重者死亡；也可感染人，引起人败血症、心内膜炎等症状.甚至死亡。1990年，1998年和2005年，在我国广东、江苏和四川省部分地区暴发猪链球菌感染人的疫情，均引起人员死亡口司。因此.防治猪链球菌病具有重要的经济

6、和社会意义。但近年来，由于抗生素的滥用，特别是在动物饲料中添加抗生素及在疾病治疗过程中抗生素的不当使月J.使得细倒的耐药菌株越来越多，其耐药谱逐年变化，日趋严塞句,从而使抗生素的治疗效果降低。如果让猪链球倒耐药性不断增加，难免产生耐药性的超级猪链球前，由此类细菌所引发的疫病-旦爆发，将难以控制。近年来.国外研究者对猪链球菌健康猪群所携带的猪链球菌分离株的耐药性以及菌群的分类进行了研究匚但有关猪链球筋的研究在国内较少。任肃省是一个畜牧业比重较大的省份，到目前为止，尚未见猪链球菌大规模爆发的报道或人感染猪链球菌而致死亡的报道。作者等以表观健康猪为研究对象.从甘肃省武威、兰州、庆阳等地收集屠宰猪的扁

7、桃体，从猪扁桃体部位分离猪链球菌株.采用药敏纸片扩散法对各猪链球菌窗株进行耐药性测定，分析猪链球菌的耐药状况；同时.利用我国猪链球菌2型的一个89k疑似毒力岛序列，进行特异性扩增.以监测甘肃省表观健康猪群中是否存在猪链球薄2型致病毒株，以期为猪链球曲的临床防治提供依据。1 材料与方法1.1材料参考萌株购自中国兽药监察所。试验菌株152份，分离自甘肃省庆阳、兰州、武威等地区（从猪扁桃体部位分离）。药敏纸片22种.为链容素、杆菌肽、四环素、先锋卷素V、育霉素、红毒素、氯洁霉素、洁霉素、氨节青霉素、瓶哌酸、苯嗤育霉素、万古霉索、阿莫西林、庆大霉素、阿奇霉素、强力铤素、恩诺沙星、罗红花素、克拉霉素、卡

8、那霉素、氯霉素和利福收稿日期2010-11-05|2011-0103修网基金项目甘南省科技衣大专顼“外源营养依赖型掰2型链球茵分子疫苗的研究M（0801NKDA035>作者简介邢姐1983）.女.在读硕士.研究方向：维防鲁医学.滴讯作名、柳ft!省（1955）.男.研究员.从事病击及细萌病的防治研究.Email.liujixinR（引物序号引物序列扩增片段长度/kbPrimerNo.PrimersequenceLength15,-CACGCATCTCGTAGAGTTTGAC-3*1.8（1和2）25'-AGATTGCGAGOCTTTTAGATTG-3Z35'-TCGCCA

9、CTATGGTATCTGCTTA31.0（3和4）45'-GATTGTGGACCATGCTGTTTAG-3Z55'-ATAAATAGCCCCATCCTCATCA-3,0.7（5和6）65'-GCGTAGCTGCTTAGTGCTACAA3'1.5（1和6）与89k«力岛相关的引物Table1Theprimersrelatedto89kpathogenicityisland表267株猪链球菌的药敏试验结果平，均购于杭州微生物试剂有限公司。THB培养基自制。1.2方法细茵分高及生化鉴定无前采取猪扁桃体(0.5g左右)至THB培养液中，37C培养16h后涂片，

10、进行革兰氏染色镜检，将镜检时存在有链球菌的培养物接种于THB琼脂平板，37C培养18h,挑取单个菌落，涂片染色镜检，确定为链球曲后接种于THB琼脂平板。将分离菌株分别进行生化鉴定，确定为猪链球菌者，置4C冰箱备用。1.2.1 药敏试验采用药敏纸片扩散法，按常规方法即挑取猪链球菌单个菌落密集均匀地涂布整个平板，将含有抗生素药物的滤纸片用烧灼灭萌的锻子分别贴于平板表面，相互间应间隔一定距离，37C培养24h后观察结果。判定标准：按抑萌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准，抑菌圈直径在15mm以上为高度敏感，1015mm为中度敏感，10mm以下为低度敏感，无抑削圈的为不敏感。敏感率/%=(高敏带株数+

11、中敏萌株数)/菌株总数X100高敏率/%=高敏菌株数/菌株总数X100耐药率/%=耐药菌株/萌株总数JX1001.2.2 猪链球菌基因组DNA的提取根据改良的TELT法提取猪链球菌基因组DNA。挑取猪链球函单菌落，接种于TH培养液中，37C培养过夜。取2mL细萌培养物于离心管中，10000g离心1min,弃上清液，在沉淀中加入TELT细菌裂解液表1(50mmol/LTris、pH8.5,62.5mmol/LED】A、pH8.5,2.5mol/LLiCl,1%TritonX-100)500ML,混匀，室温放置3min后加入500ML:氯仿：异戊僧(25:24:l,v/v),混匀。10000g离心

12、5min,取上清液.加入等体积的貌仿溶液，轻轻摇匀。10000g再离心5min,取上清液，再加入等体积的氯仿溶液.轻轻摇匀J0000g离心lmin,取上清液.加入2倍体积的纯乙醇沉淀DNA。于4C、12000g离心30min,弃乙博，保留沉淀，用70%乙醇再清洗2次，弃液体，沉淀于室温晾干，加入灭曲水溶解基因组DNA60尸置4C冰箱备用。1.2.4与猪链球菌2型相关的猪链球菌毒力岛基因的扩增参照ChenC等研究中所用的引物,89k毒力岛的相关引物见表1。2 结果与分析猪链球菌菌株的分离从152份健康猪扁桃体中共分离出猪链球俏67株，其中武威地区26/40(65%),庆阳地区30/72(41.6

13、%),兰州地区11/40(27.5%),总的猪链球曲分离率约为44%。2.1 药敏试验由表2可看出，先锋零素V、青零素、氨节青零素、万古霉素和阿莫西林对分离的猪链球菌菌株作用强，高度敏感株可达80.6%100%；红毒素、氟哌酸、阿奇霉素、恩诺沙星、罗红锥素、克拉德素、氯霉素和利福平作用次之，高度敏感株达53.7%73.2%。分离的猪链球陶对链农素、杆菌肽和四环素Table2Thedrugsensitivityof67isolatedStrefilococcussuisstrains抗生素Antibiotic高度敏感Extremelysensitivity比例/%中度敏感Mediumsensit

14、ivity_比例/以料药Drugtolerance岛度敏感ExtremelysensitiveStrainProportionStrainProportionStrainProportion抗生素Antibiotic株数比例/%株数比例/%StrainProportion中度敏感Mediumsensitivitylift比例/%耐药Drugresistance株数比例/%StrainProportionStrainProportion索素素素卷待素肽索每素素毒素奇酸育待菌环锋需霉洁每r哌哇链杆四先肓红M洁基M笨01553188579&3.62O7.4.4.2.11256 oo.o908

15、n993.O.O2292742O3.L5.O9.8.2ii万阿庆阿强恩非克卡叙利素林*素索星素素*一霉西福莓布沙«布布素平4494949492714183087399444894O0O066564.LO322121411抗生素/抻Antibiotic图167株猪链球董的多重耐药情况Fig.1Multi-drugtoleranceof67isolatedStreptococcussuisstrainsMMM2000bp1000bp引物I和2扩域产物引物3和4扩增产物引物5和6扩增产物2000bp1000bp750bpPCRproductsofIand2PCRproductsof3and

16、4primerPCRproductsof5and6primer1：PCR产物；M：DL2000DNAMarker的耐药率达80.6%100%,对氯洁霉素、洁霉素和苯哩青霉素的耐药率达58.2%65.7%。2.367株猪链球菌的多重耐药情况由图1可见，多数受检菌株均对2种以抗生素具有耐药性，并目.没有菌株为全部抗生素敏感株。2.4猪链球菌分离株中致病毒株的PCR检测经PCR检测，仅在1株猪链球菌中检测到疑似毒力岛序列(图2),表明，在甘肃省健康猪群中存在致病性2型猪链球菌。1:PCRproducts；M：DL2000DNAMarker图289k毒力岛扩增产物Fig.2Amplificationp

17、roductsof89kpathogenicityisland3 小结与讨论Davies等研究表明，猪链球曲2型在健康猪扁桃体内的带菌率高达76%。Sandy等:厄研究表明，猪链球菌在健康猪扁桃体内的带偏率甚至高达100%。本研究从152个健康猪扁桃体中分离出猪链球悟67株，分离率约44%,远低于Davies等，Sandy等的研究结果，但与InmacLadaLuque8在西班牙的研究(28.2%)高16百分点左右，说明，甘甫省庆阳、兰州、武威等地区健康猪扁桃体中猪链球菌带菌率相对较高。近年来，在猪链球菌病的防治过程中，盲目使用一些抗萌药物，导致耐药菌株越来越多，并日趋严重。药敏试验结果表明，所

18、分离的67株猪链球菌对先锋零索V、青霉素、氨苯青毒素、万古辑索4种抗生素高度敏感，但是全部菌株对2种以上抗生素具有耐药性.与我国忒他学者在东北、河南等地对猪铤球菌耐药菌株所作的耐药性研究相符研究中，耐药性最严重的1株竟对22种抗生素中的16种抗生素产生多重耐药性.提示人们应密切关注猪链球菌耐药性的严重程度.正确应用先锋需索V、青卷素、氛乍青霉素、万古很素等抗生素，以免猪链球菌对上述抗生素也产生耐药性，从而影响猪链球萌病发生时对该病的有效防治。ChenC等】研究发现，我国现有的致病性2型猪链球菌菌株均含有1个89k的疑似卷力岛序列.并给出了该毒力岛序列特异性扩增引物，4对引物中，引物1和6所能扩

19、增出1.5kb的片段，目前仅在欧洲菌株中能扩增出，而在我国所存在的菌株中均未扩出。研究利用其特异性引物对所分离的67株猪疑球菌进行PCR鉴定，仅发现1株分离株能够扩增出毒力岛特异性片段。说明，甘甫省健康猪群存在致病性猪2型链球菌御株，应密切关注未来该地区猪链球南的发病情况。参考文献13蔡宝祥.家畜传染病学M.2版.北京：中国农业出版社1991:141-144.2TouilF,HigginR,NadeauM.AisolationofStreptococcussuisfromdiseasedpigsinCanadaJVetMicrobiol,1988,17：171-177.3 系宝祥.家畜传染病学

20、CM.2版.北京，农业出版社，1991J86-190.4 黄静.张苏强.猪溶血性链球萌诊疗报告J.中国兽医杂志,1992,18(1):22-23.5 物演，卢中华，张红英，等.猪链球曲病病原的生化分群鉴定和药敏试验J.中国畜牧兽医，2004.31(4):32-33.6 郑世军.杨汉春.猪病免疫与防治技术M.北京：北京农业大学出版社.1995.7JSlaatsJ.Feder!,Okwumabua(),etal.StreptococcuussuisPastandPreasent_J.VetResCommun,1997.21(6):381-407.文章编号J1OO1-36OK2O11)02-0109

21、-0131-04安徽地方猪种质资源及其特性与开发利用殷宗俊(安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥230036)摘要为安徽省地方猪的保种及利用提供科学依据，对安徽省地方猪的种质资源及其有关特，性进行了调查。结果表明：安徽地方猪种具有繁殖力高、肉质好等优点，但存在纯种数量少、生长慢、瘦肉率相对较低等劣势。同时分析了安徽省地方猪保种工作存在的问题，并提出了对现有猪种资源的保护及开发利用措施关键词地方猪；遗传资源；评估；开发利用中图分类号S828.9文献标识码AAnhuiNativePigResourse,CharacteristicandItsExploitationandUtilizationYIN

22、Zong-jun(CollegeofAnimalScienceandTechnology.AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui230036.China)Abstract：TheresourcesandcharacteristicsofAnhuinativepigwereinvestigatedtoprovideascientificbasisforprotectionandexploitationofAnhuinativepig.Theresultsshowedthatthequantityofpurebredpigsissmall,whichhave

23、highreproductivecapacityandhighmeatqualityaswellasthedeficienciesofslow-growingandlowerleanpercentage.Theproblemsandsomemeasuresofprotectionandexploitationforexistingpigresourceswereproposedinthispaper.Keywords:nativepig;geneticresources；evaluation；exploitationandutilization安徽省地处长江中下游，季风明显，四季分明，由北向南

24、可划分为淮北平原、江淮丘陵、沿江平原、皖南山区四大类型生态区域。由于各大生态区环境的复杂多样、南北跨度大及海拔高度悬殊，从而形成了不同的生态条件和与其相适应的畜禽种质资源。根据生态类型特点安徽省地方猪种分为皖北猪、淮南猪(定远猪、寿旅黑猪)、皖南花猪、皖南黑猪、安庆六白猪、机阳黑猫、好猫等，这些地方猪种均有着繁殖力高、抗逆性强、肉质优良且对肯粗料利用率高等优良特征C，5).然而，随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，市场对高瘦肉率猪肉的需求增加.加之品种改良工作的深入，致使安徽省地方猪种资源呈现急剧减少的态势，有些品种甚至绝种或已濒临绝种。如果这种情况继续下去，许多优秀基因在我们尚未认识其价

25、值之前就永远从猪基因库中消失。因此，为了保护安徽省地方猪的种质资源，就必须了解地方猪的遗传多样性状况.加强对地方猪种种质资源的合理保护和开发利用。这不仅是发展当前经济，造福未来的需要，而且其成功的经验对于安徽省乃至我国猪种遗传资源的保存均具有重大的指导意义。鉴于此，笔者就安徽省地方猪的种类及品种特征进行概述，并针对目前安徽省地方猪保护工作中存在的问题提出了针对性的措施，旨在为安徽省地方猪的保种及利用提供科学依据。收稿日期201010-18；2010-12-21修回基金项目安微省“十一五”科技攻关页点项目“优质高繁殖力瘦肉型坪猪新品系培育及其配套组装"(07010302136)作者笥介股宗ft(1967),男教授.博士.从